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1 CICLO DE KREBS El ciclo de Krebs, también llamado ciclo de los ácidos tricarboxílicos o ciclo del citrato, constituye una vía oxidativa común para los glúcidos, ácidos grasos y aminoácidos, quienes hacen ingresar al ciclo su esqueleto carbonado el que es convertido en CO2. La función más importante asignada al ciclo de Krebs es la de liberar energía a través de reacciones de oxidación propias del ciclo para ser usada en la síntesis de ATP y se constituye en la principal vía para la síntesis de ATP en la mayoría de seres vivos, incluyendo el hombre. Las reacciones del ciclo de Krebs se dan exclusivamente en la matriz mitocondrial y por lo tanto cerca de los intermediarios de la cadena respiratoria, que serán finalmente usados para explicar la gran síntesis de ATP que determina. Además de su función energética, el ciclo de Krebs desempeña un papel principal en la gluconeogénesis, en la transaminación, desaminación y lipogénesis. Algunos de estos procesos se realizan en casi todos los tejidos, pero el hepático es el único donde todos tienen importancia extrema. Por tanto, las repercusiones son profundas cuando, por ejemplo, gran número de células hepáticas están dañadas o han sido reemplazadas por tejido conectivo, como en la hepatitis aguda y en la cirrosis, respectivamente. En la primera reacción del ciclo de Krebs el oxaloacetato se condensa con el acetil Co A originado citrato, que a través de 7 reacciones importantes, en donde suceden dos descarboxilaciones, regenera el oxaloacetato con lo cual se completa el ciclo (Figura 1). Figura 1. Regeneración del oxaloacetato en el ciclo de Krebs. 1. DESCARBOXILACION OXIDATIVA DEL PIRUVATO. Una reacción muy importante que permite explicar el ingreso del piruvato al ciclo de Krebs es la catalizada por la piruvato deshidrogenasa (PDH), en donde ocurre la descarboxilación oxidativa del cetoácido para ser convertido irreversiblemente en acetil coenzima A. Este compuesto también puede ser usado para la síntesis de ácidos grasos, como se verá después. El piruvato también puede carboxilarse, con el requerimiento de biotina y ATP y convertirse en oxaloacetato, con la participación de la enzima piruvato carboxilasa (PC). El oxaloacetato es necesaria para iniciar las reacciones del ciclo de Krebs y es además un importante sustrato gluconeogenético. Un destino del piruvato, que solo ocurre en microorganismos (levaduras y ciertas bacterias como las de la flora intestinal) permite su conversión en etanol, con la formación del acetaldehído como intermediario. La tiamina pirofosfato es necesaria para la formación previa del acetaldehído. 2 El piruvato, producto final de la vía glicolítica aeróbica, debe ingresar a la mitocondria antes de ser descarboxilado oxidativamente para dar acetil coenzima A e iniciar el ciclo de Krebs. El ingreso del piruvato se hace mediante el uso de un transportador específico que le ayuda a atravesar la membrana mitocondrial interna. El complejo de la piruvato deshidrogenasa (PDH) es quien convierte el piruvato en acetil coenzima A y corresponde a un agregado molecular de 3 enzimas, la piruvato descarboxilasa (E1), la dihidrolipoil transacetilasa (E2) y la dihidrolipoil deshidrogenasa (E3), que están presentes en copias múltiples. Cada una de estas 3 enzimas cataliza una etapa del total de la reacción en vista de su asociación física, lo que también permite que los intermediarlos que se van formando no quedan libres. Además de las enzimas señaladas, el complejo de la PDH tiene fuertemente unidas dos enzimas regulatorias, la piruvato deshidrogenasa quinasa y la piruvato deshidrogenasa fosfatasa. a. Mecanismo de acción del complejo de la PDH La secuencia de etapas en esta reacción catalizada por el complejo de la PDH es la siguiente: (Figura 2) El piruvato es descarboxilado para rendir un hidroxietil que está unido al pirofosfato de tiamina que es la coenzima de la E1. El hidoxietil es oxidado y transferido al ácido lipoico que está covalentemente unido a la E2. El acetil unido como un tiéster al ácido lipoico es transferido a la coenzima A. La forma sulfihidrilo del ácido lipoico es oxidada por la E3 que tiene como grupo prostético al FAD, permitiendo la regeneración de la forma oxidada del ácido lipoico. El FADH2 formado, es reoxidado a FAD, también con la participación de E3, pero usando como coenzima al NAD, quien al aceptar los hidrógenos se reduce a NADH+H. b. El complejo de la PDH tiene 5 formas activas de vitaminas El complejo de la piruvato deshidrogenasa contiene 5 coenzimas que actúan como transportadores u oxidantes para los intermediarios en las reacciones que hemos señalado. La piruvato descarboxilasa (E1) requiere de pirofosfato de tiamina, la forma activa de la tiamina. La dihidrolipoil transacetilasa (E2) requiere de ácido lipoico y de la coenzima A, la forma activa del ácido pantoténico. La dihidrolipoil deshidrogenada requiere de FAD y NAD+, formas activas de la riboflavina y niacina, respectivamente. Figura 2. Complejo de la Piruvato Deshidrogenasa (PDH). Tomado de Lehninger 3 En los pacientes deficientes en tiamina o niacina se encuentran alteraciones a nivel del sistema nervioso y que se explican por la menor actividad de la piruvato deshidrogenasa que determina menos utilización del piruvato como fuente de ATP en el ciclo de Krebs. c. La fosforilación y defosforilación regula la actividad del complejo de la PDH Las dos enzimas regulatorias (PDH quinasa y PDH fosfatasa) que forman parte del complejo de la piruvato deshidrogenasa regulan su actividad actuando sobre la E1. La PDH quinasa, que es independiente del cAMP fosforila a E1 y al hacerlo la inhibe; en tanto que la PDH fosfatasa al defosforilar a E1, la activa. De otro lado, la PDH quinasa es alostéricamente activada por el ATP, acetil CoA y NADH, mientras que el acetil CoA y NADH inhiben alostéricamente a la forma defosforilada (activa) de la E1. Es decir que en presencia de estos tres compuestos altamente energéticos, se inactiva la piruvato deshidrogenasa. Cuando las concentraciones de piruvato son elevadas, la enzima E1 estará muy activa, lo que se explica porque el cetoácido inhibe a la PDH quinasa. El Ca2+ es un potente activador de la PDH fofatasa, lo que aumenta la actividad de la E1. Esto es útil para el músculo ya que durante la contracción, que requiere de más energía del Ca2+ activará a la PDH y habrá una mayor síntesis de ATP. Estos mecanismos de activación inactivación de la actividad del complejo de la piruvato deshidrogenasa a través de su componente (subunidad) E1, se ilustran en la figura 3. Figura 3.- Activación e inactivación de la PDH- E1. d. La deficiencia de la piruvato deshidrogenasa es la causa más frecuente de acidosis láctica congénita La deficiencia de la PDH, particularmente de su componente (subunidad E1) es la causa más frecuente de acidosis láctica congénita. Esta situación determina una incapacidad de convertir el piruvato en acetil Co A y el piruvato acumulado hace que se destine a la mayor formación de lactato usando la LDH. En estas condiciones el cerebro se ve afectado, no solamente por la acidosis sino también porque la oxidación del piruvato representa la principal fuente de ATP para el cerebro ya que no puede oxidar a los ácidos grasos. La E1 es un tetrámero constituido de dos subunidades α y dos subunidades β, siendo la subunidad α la más frecuentemente comprometida. El gen que codifica para la subunidad α de la E1 está localizando en el cromosoma X, pero en razón a la importancia que tiene esta enzima para el cerebro, tanto hombres como mujeres se ven afectados, aunque los primeros están más comprometidos. Es por esta 4 razón que se considera a la enfermedad ocasionada por esta deficiencia como dominante ligada a X. Las manifestaciones de la deficiencia de PDH cursan con una variedad de síntomas destacando aquellos que son consecuenciadel compromiso cerebral. e. El arsénico también interfiere con la descarboxilación oxidativa del piruvato El arsénico interfiere con la vía glicolítica a nivel de la reacción catalizada por la gliceroaldehido 3P deshidrogenasa. Sin embargo la acción dañina del arsénico más importante es a nivel de las enzimas que requieren de ácido lipoico, como la piruvato deshidrogenasa, particularmente su componente E2 y la α cetoglutarato deshidrogenasa. Está demostrando que el arsénico forma un complejo estable con el grupo tiol (- SH) del ácido lipoico, anulando la participación de este compuesto en la reacción. Al unirse el arsénico al complejo de la PDH, se acumula el piruvato y consecuentemente el lactato. Esto explica que en las intoxicaciones por arsénico comprometen más el cerebro y determinen alteraciones neurológicas y finalmente la muerte. 2. LAS REACCIONES PROPIAS DEL CICLO DE KREBS En los organismos aeróbicos, el ciclo de Krebs resulta una vía esencial ya que junto a la glicólisis, a la descarboxilación del piruvato y a la fosforilación oxidativa permiten la conversación química de los glúcidos, lípidos y aminoácidos en CO2 y agua, liberando una gran cantidad de energía que en un alto porcentaje podrá ser almacenada en la moneda energética de la célula, es decir en el ATP. En la figura 4 se muestra, usando fórmulas, todas las reacciones del ciclo de Krebs, las cuales pasaremos a describir individualmente a continuación. a. El citrato se forma por condensación del acetil Co A con el oxaloacetato En la primera reacción del ciclo de Krebs sucede la condensación del acetil coenzima A con el oxaloacetato para rendir citrato, mediante la participación de la citrato sinteasa. El equilibrio de esta reacción está largamente desplazada hacia la formación de citrato por lo que la reacción se hace irreversible. La disponibilidad de sustrato resulta ser clave para la actividad de la enzima, ya que la unión del citrato cambia la conformación de la enzima, generando un lugar de unión para el acetil CoA. El citrato resulta ser un intermediario clave para regular la actividad de otras enzimas. Inhibe la actividad de la enzima regulatoria de la glicólisis, la fosfofructoquinasa y veremos más adelante como activa a la acetil Co A carboxilasa, que es una enzima clave para la síntesis de los ácidos grasos. 5 Figura 4. Las reacciones del ciclo de Krebs: (1) Citrato sinteasa. (2) Aconitasa. (3)Isocitrato deshidrogenasa. (4) Alfa ceto glutarato deshidrogenasa. (5) Succinato Tioquinasa. (6) Succinato deshidrogenasa. (7) Fumarasa. (8) Malato deshidrogenasa. b. La isomerización del citrato En la segunda reacción del ciclo de Krebs, el citrato es convertido en isocitrato con la participación de una enzima fierrosulfurada, la aconitasa. Esta enzima es inhibida por el fluoroacetato y esto explica su uso como veneno para ratas. El fluoroacetato para poder actuar se convierte en fluorocitrato que es el verdadero inhibidor. En el curso de la reacción catalizada por la aconitasa se persigue que el grupo alcohólico unido a un carbono terciario en el citrato pase a un carbono secundario y asi resulte más oxidable. En la primera etapa de la reacción se elimina una molécula de agua y se forma el cis aconitato, el mismo que se hidrata en la segunda etapa y con ello se forma el isocitrato. c. El isocitrato se oxida y se descarboxila para dar alfa ceto glutarato La isocitrato deshidrogenasa cataliza la descarboxilación oxidativa e irreversible del isocitrato para rendir alfa ceto glutarato, rindiendo en una primera etapa una molécula de NADH +H (la primera de las 3 que se formarán) y liberando CO2 en la segunda etapa. Esta es una reacción limitante del ciclo de Krebs, ya que está sujeta a mecanismos de regulación. La enzima es activada por el ADP y Ca2+ e inhibida por el ATP La enzima es activada por el ADP y Ca2+ e inhibida por el ATP y NADH +H. d. La descarboxilación oxidativa del alfa ceto glutarato es similar a la del piruvato En la cuarta reacción del ciclo de Krebs, el alfa ceto glutarato es descarboxilado oxidativamente para rendir succinil coenzima A, con la participación del complejo 6 enzimático de la α ceto glutarato deshidrogenasa. El mecanismo de esta reacción es muy similar al usado por la piruvato deshidrogenasa para convertir piruvato en acetil CoA. La enzima libera CO2 del sustrato (el segundo liberado) y se forma la segunda molécula de NADH +H. El complejo de la alfa ceto glutarato deshidrogenasa requiere también las 5 formas activas vitamínicas que necesitaba la piruvato deshidrogenasa (NAD, FAD, pirofosfato de tiamina, coenzima A y ácido lipoico) y su participación en la reacción es análoga a la descrita para la piruvato deshidrogenasa (PDH). Debe tenerse muy en cuenta que el complejo de la α ceto glutarato deshidrogenasa a diferencia de la PDH no es regulado por fosforilación o defosforilación. El complejo de la alfa ceto glutarato deshidrogenasa es inhibido alostéricamente por ATP, GTP, NADH y succinil CoA y es activado por Ca2+. El equilibrio de esta reacción esta largamente desplazado hacia la formación del succinil coenzima A, siendo el ∆Go de la reacción de -8.0 kcal/mol y que explica su irreversibilidad. El producto, succinil CoA tiene un enlace tioéster de alta energía similar al de acetil coenzima A. e. La conversión del succinil CoA en succinato permite la síntesis de ATP por fosforilación a nivel de sustrato En la quinta reacción del ciclo de Krebs, se rompe el enlace tioéster del succinil Co A para dar succinato. La reacción es catalizada por la succinato tioquinasa o succinil CoA sinteasa. El ∆Go para esta reacción es de -7.0 kcal/mol. La energía que se desprende en el curso de la reacción es usada inicialmente para fosforilar el GDP a GTP. En vista que el GTP y ATP son energéticamente interconvertibles por la acción de la enzima nucleósido difosfato quinasa, finalmente se consigue la formación de una molécula de ATP. Este ATP formado corresponde al único que se forma en el ciclo de Krebs por fosforilación a nivel de sustrato, ya que los otros 11 son formados usando la fosforilación oxidativa. Recordemos que la formación del ATP en la reacción catalizada por la succinato tioquinasa, no es inhibida por el 2,4 dinitrofenol ya que este impide sólo la síntesis de ATP asociado al transporte mitocondrial de electrones. f. Con la participación del FAD el succinato se convierte en fumarato En la sexta reacción del ciclo de Krebs, el succinato es oxidado a fumarato con la participación de la enzima succinato deshidrogenasa que tiene como aceptor de electrones al FAD. Esta enzima es la única del ciclo de Krebs que esta empotrada en la membrana interna mitocondrial, constituyendo el complejo II de la cadena respiratoria. La succinato deshidrogenasa o deshidrogenasa succínica es activada alostéricamente por el fosfato, succinato y el mismo fumarato e inhibida competitivamente por el oxaloacetato. Recordemos que el fumarato es formado en el ciclo de la urea, durante la síntesis de los nucleótidos púricos y en la degradación de la fenilalanina y tirosina. g. La hidratación reversible del fumarato lo convierte en malato La sétima reacción del ciclo de Krebs implica la participación de la enzima fumarasa o fumarato hidratasa, que en una reacción reversible hidrata al fumarato para convertirlo en malato. h. La oxidación del malato regenera el oxaloacetato En la última reacción del ciclo de Krebs, el malato es oxidado y regenera el oxaloacetato, con la intervención de la coenzima NAD y la participación de la enzima malato deshidrogenasa o deshidrogenasa málica. Debemos recordar que es la tercera y última molécula de NAD+ que se reduce en el ciclo de Krebs y que también será oxidada por la cadena respiratoria para liberar energía disponible para la síntesis de ATP. 7 El ∆Go para esta reacción es alto y positivo (+7.1 kcal/mol), sin embargo la reacciónes propulsada por la alta exergonicidad de la reacción siguiente que inicia un nuevo ciclo, es decir la catalizada por la citrato sinteasa. Balance energético y resumen Por cada molécula de acetil CoA que ingresa al ciclo de Krebs se liberan dos moléculas de CO2. Por cada vuelta del ciclo de Krebs se forman tres moléculas de NADH +H y una de FADH2. Las moléculas de NADH +H se forman durante las reacciones de oxidación de isocitrato, α ceto glutarato y malato, en tanto que la molécula de FADH2 se forma durante la oxidación del succinato. Al oxidarse una molécula de NADH +H por la cadena respiratoria se libera energía para la síntesis de aproximadamente 3 ATP y que al hacerlo el FADH2 se generan aproximadamente 2 ATP. En la reacción que convierte succinil CoA en succinato se forma un enlace de alta energía en el GTP, el cual permite luego la síntesis de ATP por acción de la difosfonucleotido quinasa. Al formarse 3 moléculas de NADH+H se sintetizaran 3 x 3 = 9 ATP Al formarse 1 molécula de FADH2 se sintetizaran 1 x 2 = 2 ATP Con la molécula de GTP se sintetizará 1 x 1 = 1 ATP Total 12 ATP Preguntas de repaso 1. Las reacciones del ciclo de Krebs se dan exclusivamente en: - 2. Mencione 2 aspectos relacionados con la importancia del Ciclo de Krebs: - - 3. Enzima que participa en la descarboxilación oxidativa del piruvato: - 4. El complejo de la piruvato deshidrogenasa (PDH) comprende 3 enzimas: - - - 5. El complejo de la PDH tiene fuertemente unidas dos enzimas regulatorias: - - 6. El complejo de la piruvato deshidrogenasa contiene 5 coenzimas: - - - - - 7. Explique la acción de las dos enzimas regulatorias del complejo de la piruvato deshidrogenasa: - - 8. ¿Qué origina la deficiencia de la PDH y qué órgano se ve principalmente afectado? - 9. ¿En qué consiste la acción dañina del arsénico? - 10. Explique la primera reacción que presenta el ciclo de Krebs - 11. Explique la segunda reacción que presenta el ciclo de Krebs - 8 12. Explique la tercera reacción que presenta el ciclo de Krebs - 13. Explique la cuarta reacción que presenta el ciclo de Krebs - 14. Explique la quinta reacción que presenta el ciclo de Krebs - 15. Explique la sexta reacción que presenta el ciclo de Krebs - 16. Explique la sétima reacción que presenta el ciclo de Krebs - 17. Explique la octava reacción que presenta el ciclo de Krebs - 18. ¿Cuál es el inhibidor de la enzima aconitasa? - 19. Mencione las etapas en las que se forman las moléculas de NADH +H y se liberan las de CO2. - - 20. Mencione una similitud y una diferencia relacionada con la descarboxilación oxidativa del alfa ceto glutarato y la del piruvato. - - La oxidación de un mol de glucosa hasta CO2 y agua usando el ciclo de Krebs genera 36 o 38 moles de ATP Tenemos ya la información suficiente como para estimar el rendimiento energético que tiene la oxidación completa de la glucosa en condiciones aeróbicas, es decir hasta CO2 y agua y expresarlo en el número de moles de ATP generados por mol de glucosa oxidada. Tengamos en cuenta las etapas que permiten sintetizar ATP. En la vía glicolítica: Cuando un mol de glucosa se convierte en 2 de piruvato, el rendimiento neto es de 2 moles de ATP. En la misma vía glicolítica (aeróbica), se forman dos moles de NADH, que al ingresar sus hidrógenos a la mitocondrias y oxidarse en la cadena respiratoria podrían generar 6 ATP su usa la lanzadera del malato que trabaja con el NAD mitocondrial, como ocurre en hígado, corazón y riñón o sólo 4 ATP si usa la lanzadera del glicerolfosfato que trabaja con el FAD, como ocurre en el músculo esquelético y en el cerebro. Queda claro que son 6 ó 4 ATP porque son 2 NADH los que se forman en la vía glicolítica por molécula de glucosa que se degrada. Cuando el piruvato, producto final de la glicólisis aeróbica, ingresa a la mitocondria y se convierte en acetil Co A, se forma una molécula de NADH por molécula de piruvato oxidada, pero como son 2 piruvatos los que vienen de la glicólisis al final serán 2 NADH. Como cada molécula de NADH oxidada en la cadena respiratoria, genera 3 ATP, se tendrá finalmente en esta etapa la síntesis de 6 ATP. Cuando el acetil Co A se oxida completamente en el ciclo de Krebs, se generan 12 moléculas de ATP por cada molécula de acetil Co A, pero como son 2 las que proceden del piruvato, se obtendrá finalmente 24 ATP. La suma de los ATP obtenidos en cada una de estas permite obtener la cifra de 36 ó 38 moles de ATP por mol de glucosa oxidada completamente 9 hasta CO2 y agua. Como lo hemos señalado, la diferencia se explica por tipo de aceptor de los hidrógenos (FAD o NAD), que proceden del NADH, a nivel de la membrana mitocondrial. 3. REGULACION DEL CICLO DE KREBS A diferencia de la vía glicolítica, que es regulada fundamentalmente por la actividad de una enzima (fosfofructoquinasa), el ciclo de Krebs se regula por la actividad de varias enzimas, dentro de las cuales destacan aquellas que catalizan reacciones que cursan con ∆Go alto y negativo, como las catalizadas por la citrato sinteasa, la isocitrato deshidrogenasa y la α- ceto glutarato deshidrogenasa. Como señalamos antes, la citrato sinteasa es inhibida por el NADH, succinil Co A y citrato. La isocitrato deshidrogenasa es inhibida por NADH y ATP y activada por ADP y Ca2+, la α-ceto glutarato deshidrogenasa es inhibida por ATP, GTP, NADH y succinil Co A por Ca2+ (tabla 3) ENZIMA ACTIVACION INHIBICION Citrato sinteasa NADH, Succinil Co A y, Citrato Isocitrato deshidrogenasa Ca2+ y ADP NADH y ATP A-ceto glutarato deshidrogenasa Ca2+ NADH, ATP y GTP Tabla 3.- Regulación del ciclo de Krebs. Bibliografía NELSON, D. y M. COX. 2009. LEHNINGER: PRINCIPIOS DE BIOQUIMICA. 5ta Edición. Ediciones Omega. Barcelona – España. BOHINSKI, ROBERTS C. 1991. Bioquímica. 5ta Edición. MURRAY, R., BENDER, D., BOTHAM, K. 2013. Bioquímica Ilustrada Harper. 28va edición. Editorial Mc Graw Hill. KOOLMAN, JAN y KLAUS-HEINRICH ROHM. 2004. Bioquímica: Texto y Atlas. 3ra Edición. Editorial Panamericana. Buenos Aires-Argentina. LAGUNA, JOSE y E. PIÑA GARZA. 2007. Bioquímica. Editorial El manual Moderno. México.
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