EJERCICIOS RESUELTOS DE MACROMOLÉCULAS-BIOQUIMICA (1)

Vista previa del material en texto

Bioquímica básica de macromoléculas
La Bioquímica nació cuando se probó que una célula se forma por los mismos principios de la física, la química y la fisicoquímica que rigen la materia. Entonces, la célula se definió como una máquina altamente eficiente (gracias a la catálisis enzimática), principalmente química, que funciona a temperatura y presión constantes. Por otro lado, desde el punto de vista termodinámico, las células son sistemas abiertos estacionarios: Intercambian materia y energía con el medio, pero sin variar su contenido neto y transformándose a sí mismas y al medio en el proceso.
La Bioquímica estudia la química biológica estructural, es decir, estudia las bases moleculares de la vida. Par esto se utilizan métodos de aislamiento, purificación y caracterización de biomoléculas para luego analizar sus estructuras tridimensionales y poder determinar cómo estas definen su función y cómo interactúan las unas con las otras (estructuras macromoleculares). También se puede encontrar una función a partir de una estructura gracias al conocimiento que se tiene del código genético.
La comprensión de las moléculas y las estructuras macromoleculares permite comprender los procesos celulares, ya que las funciones de las estructuras macromoleculares están dadas por cómo interaccionan las biomacromoléculas, cuyas funciones y complementariedad están dadas por la secuencia en las que moléculas más simples están enlazadas. A su vez, las funciones de estas moléculas están dadas por las propiedades de los grupos funcionales que contienen.
Finalmente, las propiedades de los grupos funcionales y de cómo interaccionan entre sí están dadas por las interacciones atómicas y moleculares:
· Interacciones covalentes: Es una interacción química específica en las que los átomos comparten orbitales.
· Interacciones no covalentes: Son interacciones físicas en las que los átomos no comparten orbitales ni electrones, tienen una distancia de efectividad y menor energía debido a que son interacciones de tipo eléctricas. Existen muchos tipos diferentes y son de gran importancia biológica porque estabilizan las estructuras tridimensionales. 
· Iónicas y dipolares.
· Van der Waals: y de dispersión.
· Puente de hidrógeno.
· Interacción hidrofóbica.
· Interacción bioespecífica: Interacciones estereoespecíficas entre biomoléculas.
Lógica molecular y atributos de los seres vivos
Los seres vivos siguen a lógica de alcanzar la complejidad, con la consecuente variedad de herramientas moleculares, a partir de la simplicidad, como producto del proceso evolutivo regido por “el azar y la necesidad”. Esto determina los atributos de la materia viva:
· Complejidad y alto grado de organización.
· Cada tipo de componente cumple una función específica.
· Presentan la capacidad de extraer y transformar la energía de su entorno, a partir de materias primas sencillas, y de emplearla para construir y mantener sus estructuras más complejas, proceso denominado metabolismo. Pueden también realizar trabajo útil.
· Tienen la capacidad de producir una réplica exacta de sí mismos.
El agua como disolvente
El medio intracelular es un ambiente de superpoblamiento molecular, por la alta concentración de macromoléculas, lo que lo hace un líquido espeso con características próximas a las de un gel. Esto, junto con la presencia de moléculas que son osmóticamente activas, determinan que la actividad del agua en el medio esté alterada.
Los compuestos neutros o iónicos al disolverse en agua pueden ordenar o desordenar la estructura del agua, se denominan cosmotrópicos o caotropícos, respectivamente. Esto se debe a que los cosmotrópicos, al contrario de los caotropícos, tienen mayor ordenamiento del agua alrededor del ión y una interacción con el agua más fuerte que la interacción . En general, los aniones son más cosmotrópicos que los cationes de densidad de carga semejante y los iones de mayor densidad de carga tienden a ser caotropícos.
La característica del agua de ser un líquido muy estructurado da origen a la interacción o efecto hidrofóbico, por el cual la introducción de compuestos hidrofóbicos altera la estructura del agua haciendo que los puentes hidrógeno se reorganiza para acomodar el soluto. Así, se forman cajas o clatratos alrededor, en las que el agua se encuentra en un estado de menor entropía, por lo que las moléculas hidrofóbicas se aproximan y excluyen el agua entre ellas para ofrecer una menor superficie de contacto y proporcionar estabilidad al complejo molecular.
En la complementariedad entre una enzima y un sustrato, el agua se distribuye de acuerdo a las características de los grupos funcionales de estas moléculas. Generalmente son desplazadas del sitio de interacción.
Cromatografía
La cromatografía es un método de separación y caracterización de macromoléculas que se adapta a un amplio rango de compuestos, debido a la variedad de principios de separación, y que permite recuperar los compuestos separados y trabajar a escalas mayores cuando se busca producir.
Hay gran variedad de matrices que trabajan con diferentes principios de separación y múltiples diseños experimentales, siendo el de columna el más práctico. En todos los casos hay una fase estacionaria equilibrada, sobre la que se siembra la mezcla de analitos, y una fase móvil (eluyente), que los transporta a distinta velocidad y separa en distintas fracciones.
Clasificación
· Según la disposición de la fase sólida:
· Columna.
· Membrana
· Capa fina.
· Según si la fase estacionaria es sólida o líquida y la fase móvil es líquida o gaseosa.
· Según el fenómeno general involucrado:
· Partición entre dos fases inmiscibles: 
· Adsorción: Si hay un número limitado de sitios puntuales de unión, independiente del tipo de interacción, el fenómeno predominante es de adsorción, pero se los trabaja como de partición.
· Según el principio de separación:
· Intercambio iónico: Interacción iónica.
· Fase reversa: Interacción hidrófoba.
· Hidrofóbica: Interacción hidrófoba.
· Exclusión molecular: No hay interacción, se da una separación según el tamaño y la forma molecular.
· Afinidad: Interacción bioespecífica.
· Covalente: Formación y ruptura de grupos tiol.
Evaluación del resultado
La evaluación de un resultado cromatográfico, cualquiera sea el tipo, implica:
· Qué datos experimentales se obtienen.
· Cómo se expresa el resultado.
· Cómo se puede optimizar en función de las variables de las que depende, para lo cual se necesita un modelo.
Cromatografía 
En el proceso de separación, las partículas viajan a velocidades diferentes a través de la fase estacionaria en función del balance entre las fuerzas de retención de la fase estacionaria y las de arrastre de la fase móvil.
La representación de datos experimentales se da en la forma de un cromatograma: A medida que transcurre la fase móvil, registrada como volumen de elución o tiempo, se mide alguna propiedad de los analitos (absorbancia, radioactividad, etc). Esto permite identificar el momento de aparición de cada componente como un pico sobre la línea de base.
Teoría de los platos teóricos
Esta teoría considera que cuanta mayor cantidad de platos teóricos haya en el empaque de una columna, mayor número de intercambios habrá, más se distinguirán las velocidades de los analitos y mayor será la resolución. Esto permite obtener una expresión de la Resolución en función de los coeficientes de partición de los analitos y parámetros funcionales de la columna que se pueden modificar para optimizar el procedimiento.
Los parámetros que se pueden controlar son:
· Eficiencia: Depende del número de platos teóricos, lo que depende de la longitud de la columna y la altura equivalente de los platos teóricos . El número de platos teóricos necesario para una buena resolución es:
La altura mínima para que se establezca el equilibrio entre ambas fases está dada por la fórmula:
El término crece si no hay caminos uniformes por la calidad del empaque de la columna. Luego, el término aumenta si es muy baja ya que esto le da tiempo al frente para difundirsey borronearse. Por último, el término aumenta si es muy alta debido a que esto provoca que el efecto de partición no tenga tiempo de ocurrir. Entonces una alta altura mínima se contrarresta utilizando una fase estacionaria de particular pequeñas y uniformes y un empaque homogéneo y una ni tan elevada que impida los procesos de equilibrio ni tan lenta que dé lugar al fenómeno de difusión.
· Capacidad: Relaciona el coeficiente de partición del mayor de los dos componentes. Si la fase estacionaria está en exceso, depende de la fase móvil. 
· Selectividad: Relaciona los coeficientes de partición de ambos componentes mediante , siempre el mayor sobre el menor. Depende de la fase estacionaria y a veces de la móvil.
No es sencillo optimizar un soporte, por lo que se utilizan los diseños controlados que permiten controlar la velocidad y la composición de la fase eluyente y programar la recolección de las fracciones. Este es el diseño experimental de los equipos .
Cromatografías de aplicación en separación y caracterización de macromoléculas
La fase estacionaria o matriz siempre está constituida por una matriz inerte (bases inorgánicas o polímeros sintéticos u orgánicos, que suelen ser polisacáridos) y, en el caso de la cromatografía de adsorción, hay un grupo químico unido covalentemente a esa matriz cuyas características definen la capacidad de retención.
Cromatografía de filtración por geles o tamiz molecular
No se producen interacciones intermoleculares con la matriz porque esta no posee grupos químicos específicos. En cambio, la propiedad separativa es el tamaño y forma (radio de Stokes) de la partícula y la matriz está constituida por partículas porosas, cuya capacidad de tamizado o exclusión molecular depende del tamaño de poro.
Se debe tener en cuenta que en volumen de muestra debe ser de un del volumen total de la columna, sino no alcanzarán a diferenciarse los caminos recorridos, que la columna debe tender a la máxima longitud y mínima sección y que es suficiente con que las condiciones de equilibrado y elusión sean consistentes con la estabilidad de la muestra.
Toma relevancia el rango de fraccionamiento de la columna que se expresa como un rango de masas mínimo y máximo en los que se pueden resolver los componentes. Este depende de la forma y tamaño (radio de Stokes) y es diferente para proteínas globulares o polímeros no globulares.
Las moléculas grandes que son totalmente excluidas de los poros eluyen primero en el , por lo que . Las moléculas pequeñas que penetran completamente el , eluyen a un volumen , por lo que . Las moléculas intermedias, eluyen a un volumen , de lo que se sigue:
Este tipo de cromatografía permite la separación o purificación de las moléculas según su radio de Stoke, el acondicionamiento de muestras mediante un desalado de la solución o un cambio de buffer utilizando un rango de fraccionamiento pequeño para separar las macromoléculas de las moléculas pequeñas que hacen al medio, y también permite la determinación de masas moleculares mediante la construcción de una curva de calibrado que relaciona el logaritmo de las masas moleculares patrones en función de los para comparar con los valores obtenidos en la cromatografía.
Cromatografía de intercambio iónico
En el intercambio catiónico la fase estacionaria tiene partículas fijas cargadas positivamente (intercambiador catiónico) o negativamente (intercambiador aniónico) asociadas a contraiones móviles cargados negativamente o positivamente que son desplazados por los analitos que quedan entonces adheridos a la matriz. Así, la propiedad separativa es la carga y su distribución en la macromolécula, lo que depende del de trabajo.
El proceso tiene cuatro etapas: Equilibrado de la muestra y columna, siembra y adsorción, elusión y regeneración. Se debe tener en cuenta la masa de proteínas en relación a la capacidad de la matriz, la fuerza iónica , el de equilibrado, el de elusión y el modo de elusión (isocrático o con variación de condiciones).
En el equilibrado el conviene que sea una unidad por encima (para intercambio aniónico) o por debajo (para intercambio catiónico) del de las proteínas a retener y una baja para que las proteínas puedan desplazar los contraiones. Se hace la siembra en las condiciones de equilibrado y luego se procede a hacer la elusión, perturbando la interacción electroestática mediante el aumento de la o llevando el al . Por último, se realiza la regeneración lavando con alta para barrer todo lo que haya quedado y luego lavando con baja para recuperar las condiciones necesarias para retener analitos.Los cambios de pueden hacerse de manera escalonada o continua (gradiente). La forma de gradiente da mayor resolución y, además, permite ver en qué condición aparece el pico del compuesto deseado en los que registran el perfil de elusión.
Cromatografías de fase reversa e hidrofóbica
En la fase reversa el equilibrado se da por la interacción entre una matriz que tiene un medio orgánico continúo y una fase móvil que tiene un bajo porcentaje de solvente orgánico, por lo que las partículas tienen mayor afinidad por la matriz y tienden a adherirse a ella. Para la elución hace un gradiente de porcentaje orgánico creciente para que la fase móvil sea capaz de desplazar las partículas por el aumento de la afinidad hidrofóbica.
En el equilibrado de la cromatografía hidrofóbica la matriz tiene parches hidrofóbicos fijos y la fase móvil es un medio acuoso con alta fuerza iónica, por lo que las partículas se adhieren a los parches por afinidad hidrofóbica. Para la elución se hace un gradiente de fuerza iónica decreciente para debilitar las interacciones hidrofóbicas y permitir que las partículas sean desplazadas por la fase móvil.
Cromatografías de afinidad
Es el tipo de cromatografías más sofisticadas donde la capacidad de retención tiene que ver con la propiedad funcional de un (ligando bioespecífico) o una química específica de componente que forma un par de elevada: Los ligandos unidos covalentemente a la matriz son reconocido específicamente por el compuesto deseado, como ser una enzima.
El ligando puede ser bioespecífico de estrecha especificidad (receptor, inhibidor, activador, antígeno, anticuerpo o sustrato), bioespecífico de amplia especificidad (cofactor o lectina) o (ion metálic o colorante).
	Comparación ligando boespecífico y 
	Propiedad
	Metal específico
	Bioespecífico
	Estabilidad del ligando
	Alta
	Baja
	Capacidad
	Alta
	Baja
	Condiciones de elusión
	Media
	Extrema
	Recuperación del ligando
	Completa
	Incompleta
	Selectividad
	Baja o media
	Alta
	Costo
	Bajo
	Alto
En un solo paso se puede lograr la purificación: El equilibrado se da con un buffer de unión que permite la absorción del compuesto deseado evitando que se absorban los demás, luego se cambian las condiciones para llevar a cabo la elución, rompiendo las interacciones específicas, y la reequilibración. Hay dos formas de romper la unión para realizar la elusión: Modificando la composición del buffer o utilizando competidores que desplacen la macromolécula, para que eluya libre o unida al competidor.
Las matrices con ligandos específicos no se consiguen comercialmente pero sí se obtienen matrices activadas a las cuales se puede unir el ligando de interés mediante variadas reacciones.
Cromatografía de metal inmovilizado 
Es un tipo de cromatografía de afinidad donde se tiene un ión metálico acomplejado con un grupo quelante, el cual a su vez está unido a través de un brazo espaciador a una matriz polimérica. El ión metálico permite la unión y separación de proteínas con parches de histidina, triptófano o cisteína, por lo que es el método más utilizado para proteínas recombinantes con etiquetas de .
La especificidad de la retención depende del conjunto y de la estructura tridimensional de la proteína, pero la misma matriz polimérica puede utilizarse con diferentes metales. Además, los metales de transición poseen afinidades y requerimientos estructurales diferentes para coordinar los grupos presentes en proteínas:La afinidad mayor es por residuos de histidina y, en general, a mayor afinidad por estos residuos, menor es la especificidad .
Las etapas del proceso son: Equilibrado de la muestra y columna, siembra y adsorción, elusión y, por último, regeneración. Debe impedirse la unión de las proteínas por interacciones iónicas adicionando para aumentar la y la elusión normalmente se efectúa por competencia con imidazol.
	Resumen de condiciones cromatográficas
	Condición de partida
	Técnica
	Condición final
	Baja , adecuado
	Intercambio iónico
	Alta , cambio de 
	Alta 
	Hidrofóbica
	Baja 
	Volumen de muestra pequeño
	Filtración por geles
	Muestra diluida, cambio de buffer si se requiere
	Condiciones específicas de unión
	De afinidad
	Condiciones específicas de elusión
Parámetros hidrodinámicos
Los métodos hidrodinámicos de separación y caracterización son aquellos en los que la macromolécula se desplaza en medios fluidos debido a distintos tipos de fuerzas generadas por gradientes propios o fuerzas externas aplicadas. Ese movimiento va a depender de los parámetros hidrodinámicos, que a su vez dependen de parámetros moleculares como la forma, el volumen o tamaño, la flexibilidad, la hidratación, etc.
El conocimiento de los parámetros hidrodinámicos ayuda a predecir el comportamiento de las macromoléculas en cromatografía de filtración por geles, movilidad electroforética y centrifugación. Viceversa, el resultado de aplicar algunos de esos procesos aporta información acerca de los parámetros.
Más allá de que se conozca la verdadera forma y tamaño de una proteína, resulta imposible generar ecuaciones que contemplen la estructura particular de cada una para analizar los distintos fenómenos que dependen de esta. Por eso se recurre a modelos de partículas que se aproximen a las formas reales, como el modelo conformacional que incluye:
· Conformación globular: Biopolímeros que presentan una estructura definida y compacta debido a las fuertes interacciones entre las cadenas laterales de los monómeros. Su forma se próxima a una esfera o a un elipsoide de revolución, que se generan por la rotación de la elipse sobre uno de sus ejes: Si se genera sobre el eje mayor se genera un elipsoide tipo oblato y si lo hace sobre el eje menor , uno tipo prolato.
· Conformación elongada: Macromoléculas que tienen forma próxima a una barra o filamento, como el , los polisacáridos y algunas proteínas. Las propiedades de sus disoluciones dependen fundamentalmente de la longitud de la banda, mientras que el diámetro desempeña un papel menos importante.
· Conformación de ovillo estadístico o : Forma variable y azarosa que toman los polímeros sintéticos, polisacáridos y proteínas y desnaturalizados debido a los constantes impactos con las moléculas de disolvente. Debido a que son conformaciones random, solo se pueden establecer propiedades medias.
Coeficiente de 
Las moléculas se mueven constantemente y de manera azarosa debido a la energía de agitación térmica. Si la distribución del conjunto de moléculas es homogénea, todas las partículas tendrán las mismas posibilidades de traslación en todos los sentidos y no habrá movimiento neto. Pero, si existe una diferencia de concentración, se producirá un movimiento neto tal que disminuya el gradiente de concentración: Desde la zona de mayor concentración a la de menor, dentro de una solución, o de la solución menos concentrada a la más, si hay dos soluciones separadas por una membrana.
La primera ley de Fick determina, si solo se tiene en cuenta la difusión y en una dirección, que el flujo de una partícula está dado por:
Donde es el coeficiente de difusión que es inversamente proporcional al coeficiente de fricción , el cual depende de las dimensiones y la forma de la partícula, por lo que el coeficiente de difusión también. Existen fórmulas que permiten el cálculo de para diversas formas geométricas, pero la esfera da el menor porque tiene la menor superficie para una determinada masa. Esto está dado por la ley de Stokes: 
Conociendo la masa, el coeficiente de hidratación y el volumen específico parcial de una molécula, no se puede calcular su forma ni predecir su comportamiento hidrodinámico. Para lograrlo se asumen un modelo de molécula compacta, cuya estructura interna no permite movimientos de una parte de la molécula con respecto a otra o permite movimientos muy pequeños, geométrica e hidratada.
Donde es la masa de la partícula, es el volumen de la partícula hidratada, es la masa molecular de la partícula, es el número de Avogadro, es el coeficiente de hidratación, es el volumen específico parcial de la partícula y es el volumen específico del solvente libre.
Generalmente se conocen la masa y el volumen específico parcial, pero no la hidratación. Esto limita a que solo se pueda calcular el mínimo coeficiente de fricción que podría tener la partícula, porque el solo se puede calcular asumiendo que la partícula tiene una determinada forma geométrica y no está hidratada, lo cual no necesariamente cumple.
En general, porque la partícula no es de la forma asumida (esférica), está hidratada o ambas y, además y son valores promedios para estos parámetros para proteínas nativas. Así, para partículas esféricas de igual densidad o volumen específico e hidratación, el radio y crecerán con la raíz cúbica de la masa. De lo contrario, la relación no posee una dependencia predecible.
Radio equivalente
Para las formas reales que adoptan las macromoléculas en general la relación no posee una dependencia predecible, salvo que se pueda aproximar a otras formas geométricas pero la relación es más compleja. O sea, no se puede inferir un radio, una masa o un volumen exactos a partir de un comportamiento hidrodinámico que depende de la forma y el tamaño y viceversa.
El radio equivalente para cualquier propiedad hidrodinámica es el radio de la esfera equivalente que posee el mismo valor de una determinada propiedad en solución, que la de la macromolécula bajo consideración. Como muchos fenómenos de interés dependen del coeficiente de fricción, el radio equivalente o de Stokes se define como el radio de la esfera que tiene el mismo coeficiente de fricción que la partícula.
En general, las otras propiedades hidrodinámicas aparecen dependiendo del radio de Stokes. Si se conoce el valor del coeficiente de fricción real, el radio de Stokes se calcula despejando de la ecuación de Stokes, y si se supone que la macromolécula es una esfera y no está hidratada, se puede obtener el valor del igualando su volumen al de una esfera no hidratada:
La movilidad electroforética depende del radio de Stokes: Si se asumen formas semejantes, no necesariamente esféricas, se puede establecer una relación experimental utilizando patrones de formas parecidas o induciendo en todas las macromoléculas una misma forma. El también depende de : A medida que una proteína se desnaturaliza aumenta el y disminuye , por lo que se deben utilizar patrones de forma semejante si se utilizará para conocer la masa.
Potencial 
Las proteínas, los ácidos nucleicos y algunos polisacáridos se pueden considerar macroiones con forma, carga y distribución de cargas particulares para cada uno. En las proteínas la carga se origina en los grupos y en los grupos amino y carboxilo terminales, en los ácidos nucleicos se originan en los fosfatos y en los polisacáridos en los residuos azúcar oxidados o sustituidos por ser grupos ácidos o básicos.
Los macroiones, además de estar hidratados, se rodean de una nube iónica de carga opuesta y de densidad decreciente hacia el seno de la solución con los cuales se mueven en conjunto. El ion central y la nube iónico general un potencial eléctrico en la superficie de corte denominado potencial , el cual depende de y de la fuerza iónica de la solución:
Electroforesis
La electroforesis es el transporte de partículas (migración) a través de un disolvente mediante un campo eléctrico, lo cual se basa en que la mayoría de los biopolímeros poseen carga eléctrica. Para caracterizar una macromoléculase determina la velocidad con que se mueve en la electroforesis y se la utilizada para calcular la masa molecular, distinguir moléculas por su carga neta o forma, detectar cambios de aminoácidos de restos polares o no polares y separar distintas especies moleculares.-
Si una partícula con carga suspendida en un medio aislante se encuentra en un campo eléctrico , se moverá a una velocidad constante determinada por el balance entre la fuerza eléctrica y la resultante del rozamiento con el medio . Luego, la movilidad electroforética se define como la velocidad que toma la partícula por unidad de campo:
De acuerdo a la variante técnica que se utilice, la electroforesis permite la separación y el análisis en función de:
· Libre: Según la relación 
· Según el y el absoluto.
· Según el , es decir, la masa molecular.
· Isoelectroenfoque: Según el .
Electroforesis libre
La corrida electroforética se da en un medio alcalino no muy diluido, donde la movilidad electroforética depende de la relación y de la fuerza iónica y la viscosidad del medio. Por lo que dos moléculas con igual no podrán separarse.
Electroósmosis
La electroósmosis implica la migración del líquido respecto del sólido por la acción de un campo eléctrico: Si un sólido adquiere cargas fijas y se pone en contacto con un líquido, se genera un potencial eléctrico y se forma la doble capa eléctrica. Al aplicar un campo eléctrico, el líquido se desplaza por los iones hidratados acumulados cerca de la superficie con una velocidad que depende del potencial del sólido, por lo que depende del y la fuerza iónica.
Este fenómeno puede estar presente cuando se realiza una electroforesis sobre soporte de acetato de celulosa o agarosa y en electroforesis capilar, lo que influye en la magnitud y sentido de la migración de las moléculas a separar según las características del soporte.
Electroforesis sobre soporte
La función del medio soporte es, principalmente, evitar las perturbaciones mecánicas y las corrientes de convección que pueden producirse por cambios de temperatura o por la elevada densidad de las disoluciones. Además, algunas veces adsorbe varias de las especies moleculares o actúa como un tamiz molecular que puede contribuir a la separación.
· Papel: La electroforesis a bajo voltaje ha sido utilizada para el análisis de mezclas proteicas, pero hoy en día ha sido superada por la electroforesis en gel además de que es ineficaz para moléculas pequeñas (aminoácidos y nucleótidos) porque la carga reducida hace muy lenta la separación, lo que genera considerable difusión. En la de alto voltaje la velocidad de separación aumenta, pero se necesita refrigeración por alta intensidad de corriente.
· Acetato de celulosa: Esta evita el efecto de adsorción del papel, puesto que la mayoría de los grupos hidroxilos adsorbentes de la celulosa están esterificados con acetato. Esto provoca una mayor resolución, una separación a bajo voltaje más rápida y una mayor sensibilidad porque se reduce la tinción del fondo.
· .
· Electroforesis en geles de poliacrilamida :
Las moléculas migran a través de los poros del medio que ejercen un efecto de tamiz, por lo que sufren un retraso adicional que depende de su radio de Stokes y del tamaño del poro:
El efecto de tamiz molecular está presente en todos los medios gelosados, pero la porosidad en geles de poliacrilamida está controlada: A medida que aumenta la concentración de acrilamida, disminuye el tamaño del poro y aumenta el efecto tamiz.
La metodología de aplicación de esta técnica es:
1) Para la gelificación del medio se utiliza el monómero acrilamida junto con como entrecruzante, como catalizador y persulfato de amonio como iniciador de radicales libres. Se debe polimerizar en ausencia de oxígeno y, en general. se mantiene constante la relación .
2) Conexión a cubas.
3) Siembra y separación por aplicación de diferencia de potencial (electroelusión) con fuente de poder.
4) Revelado por tinción o funcional o transferencia y revelado inmunoquímico.
Este tipo de electroforesis puede ser discontinua, donde el medio contiene un gel de apilamiento y otro de separación: La relación de movilidades de las especies aniónicas y los cambios de entre ambas zonas producen un efecto de apilamiento que luego permite la separación con mayor resolución.
Todas las zonas tienen el catión , los reservorios tienen el anión , en el gel de apilamiento el anión son las proteínas y el de separación tiene le anión . El en el gel de apilamiento es menor que en el de separación, la relación de movilidades es y, mientras esta se mantenga, los componentes no se mezclan.
El campo eléctrico cambia entre el gel de apilamiento y el de separación, lo que hace que las proteínas queden atrapadas entre y y formen bandas muy compactas. Al aumentar el , la movilidad de pasa a ser mayor que la de las proteínas, por lo que se mueve delante de estas y les permite pasar al gel de separación, donde se mueven en un medio de conductividad E constante y se separan en función de su movilidad.
El separa según parámetros diferentes dependiendo de las condiciones en que se realice:
· nativo: Separa en base a la relación y absoluto, por lo que se pueden separar dos proteínas con igual pero distinto .
· Se agrega el detergente que desnaturaliza las proteínas y las separa en sus subunidades (si no están unidas por puentes disulfuro) de manera tal que les confiere una relación y forma semejantes. De este modo, la movilidad será en función del absoluto, por lo que se puede asumir que será en función de la masa molecular. Esto permite determina la masa molecular de la banda correspondiente a la proteína utilizando patrones de masa molecular adecuados:
· Si la proteína es monomérica será, la banda corresponderá a su masa molecular.
· Si la proteína es oligomérica y las subunidades son iguales, se visualizará una única banda que corresponderá a la masa molecular de la subunidad.
· Si la proteína es oligomérica y las subunidades no son iguales, se visualizará una banda por subunidad.
· en condiciones reductoras: Además de agregar el detergente , se agrega un reductor que reduzca los puentes disulfuro y permite que se separen aquellas proteínas oligoméricas que el por sí solo no podía separar.
· desnaturalizante con urea: La urea desnaturaliza y disocia las subunidades, pero no cambia sustancialmente la carga, aumenta el y, si la proteína es monomérica, se observa una disminución de la movilidad respecto de la nativa. Se realizan electroforesis en gradientes de urea para separar según a qué concentración se desnaturaliza cada proteína
Isoelectroenfoque 
Las proteínas son anfolitos, por lo que su carga neta depende del y existe un valor al cual presentan carga nula, el punto isoeléctrico, donde no se moverán si se las somete a un campo eléctrico. Entonces, si se coloca una mezcla de proteínas en un gradiente de , estas se moverán hasta llegar al punto del gradiente donde y se detendrán, quedando separadas según su . Así, este método permite separar mezclas que por otros métodos resultaría imposible y dejando las proteínas significativamente concentradas.
El método empleado para producir un gradiente estable de pH consiste en distribuir polianfolitos sintéticos de bajo peso molecular que cubran un amplio margen de puntos isoeléctricos. Estos polianfolitos son usualmente mezclas de polímeros de ácidos carboxílicos y aminas alifáticas.
Electroforesis bidimensional
Permite separar por dos principios distintos, lo más común es por isoelectroenfoque y . Así, componentes con el mismo que aparecen en la misma banda en la primera dimensión, se separan en función de sus masas en la segunda.
En primer lugar, se realiza un isoelectroenfoque y, a continuación, el gel se gira en otra dimensión y se añade SDS al buffer para realizar un . Finalmente se tiñe el gel y se mide la intensidad de cada una de las manchas.
Determinar la identidad de cada mancha no es tarea fácil. Si se realiza en condiciones estándar, el patrón del gel puede compararse conlos patrones obtenidos por laboratorios de referencia. Para la identificación experimental se pueden extraer las manchas del gel e hidrolizar por digestión enzimática la proteína para obtener pequeños péptidos que pueden ser analizados por espectrometría de masas.
Electroforesis combinada con otras reacciones
Luego de la separación electroforética, las bandas pueden ser transferidas para luego ser sometidas a una reacción de identificación. Un ejemplo de esto es la electroforesis combinada con transferencia y reacción inmunoquímica: Se realiza la electroforesis, las bandas se transfieren a un papel de nitrocelulosa donde se las someterá a una reacción inmunoquímica utilizando uno o más anticuerpos, de los cuales uno debe estar marcado.
Electroforesis de ácidos nucleicos y polisacáridos
Los principios son los mismos que para proteínas, pero dada la estructura molecular, presentan particularidades en la separación y tinción.
Los poseen una relación semejante y los doble hebra de gran tamaño pueden considerarse como ovillos cuya carga es proporcional a la longitud y al coeficiente friccional, por lo que en electroforesis libre presentan movilidad independiente de su longitud y no se separan. En medios gelosados, si se asume que la forma es semejante o se desnaturalizan y se usan patrones adecuados, se la movilidad depende esencialmente de la masa molecular.
Para el se emplean geles de agarosa o acrilamida , siendo estos últimos de mayor resolución, y la visualización se realiza en a partir de la unión a colorantes fluorescentes. Las cubas de agarosa son en general horizontales, el gel se encuentra sumergido en el buffer de corrida y el orden de migración es:
Sedimentación por centrifugación
La centrifugación es un método analítico y preparativo que utiliza la fuerza centrífuga para aumentar hasta en cinco órdenes de magnitud la fuerza de gravedad para sedimentar partículas y macromoléculas.
Así, la fuerza centrífuga aplicada por la centrífuga depende de la velocidad angular que alcance y del radio del rotor. Esta fuerza compite con las fuerzas de flotación y de fricción que sufren las partículas y se oponen a la sedimentación de las mismas:
Así, que la partícula sedimente o flote dependerá de su volumen específico, que es la inversa de su densidad, en relación a la del solvente. Este fenómeno también queda definido por el coeficiente de sedimentación, el cual caracteriza la sedimentación de una partícula durante la centrifugación, se mide en y depende de la masa y forma de la partícula.
Las centrífugas se pueden clasificar según los intervalos de velocidad angulas en los que pueden trabajar:
· Centrífugas comunes: Hasta .
· Supercentrífugas: Hasta.
· Ultracentrífugas: hasta .
También pueden clasificarse según el método y los usos que se les pueden dar:
· Analíticas: Determinación de la de una proteína en estado nativo y/o del estado oligomérico, verificación de la homogeneidad en masa y conformación de una muestra, detección y cuantificación de agregados en muestras de proteínas, detección de cambios conformacionales, estudio de la formación y estequiometría de complejos fuertes entre macromoléculas y determinación del coeficiente de .
· Preparativas: Separación de fracciones celulares y subcelulares.
A su vez, los métodos se pueden clasificar según:
· Velocidad de sedimentación:
· De frente: Se parte de una solución homogénea donde los componentes se desplazan como un frente hacia el fondo según sus . Con fines preparativos, permite el fraccionamiento subcelular, pero solo se obtienen fracciones enriquecidas. Con fines analíticos permite estimar el de una partícula estableciendo la posición del frente dentro del tubo a distintos tiempos o, a partir del , estimar el tiempo necesario para sedimentar la partícula a una determinada velocidad.
· De zona: Es un método preparativo en el que las partículas se separan de acuerdo a su coeficiente de sedimentación. La densidad del gradiente no supera a la de la macromolécula o partícula.
· Equilibrio de sedimentación:
· Sin gradiente de densidad: Es un método analítico en el cual se establece un equilibrio entre la difusión y la sedimentación. Así, una vez alcanzado el equilibrio, se evalúa la concentración a diferentes radios para trazar la curva de calibrado y poder calcular sin necesidad de conocer .
· Con gradiente de densidad o isopícnico: La densidad del gradiente supera a la de la macromolécula en algún punto hacia el fondo del tubo, por lo que la separación es en función de la densidad. Es un método preparativo que se utiliza para células y fracciones subcelulares.
Aminoácidos
Los aminoácidos son los boques fundamentales de péptidos y proteínas, constituyentes de fosfolípidos (serina), mensajeros químicos e intermediarios en procesos metabólicos.
Los aminoácidos que conforman los péptidos son los , donde el carbono tiene estructura tetraédrica y cuatro sustituyentes: Un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo variable de uno a otro. Excepto en la , los cuatro sustituyentes son diferentes: El carbono es asimétrico por lo que los presentan isómeros y son compuestos quirales. En los sistemas biológicos están presentes solo los .
Los se clasifican en base a las propiedades fisicoquímicas de sus grupos :
· Polares:
· Ácidos o negativamente cargados: Sus grupos tiene grupos ácidos que se desprotonan.
· Neutros o no cargados: Sus grupos no son ionizables.
· Básicos o positivamente cargados: Sus grupos tienen grupos básicos que se protonan.
· No polares: Por lo general, su grupo es una cadena hidrocarbonada. Se pueden clasificar en alifáticos y aromáticos.
Todos los aminoácidos absorben en la región y los grupos de los aromáticas lo hacen, además, en la región . Esto último permite la determinación de la concentración de una proteína en solución ya que, según la ley de , la luz absorbida es proporcional a la concentración del analito en disolución:
Existen poco comunes que son derivados de comunes. Algunos son producto de modificaciones postraduccionales, en las que se agrega algún grupo funcional al grupo , y otros tienen su codón codificante, como la y la . Estos últimos solo se encuentran en proteínas, luego hay otros poco comunes que se encuentran en solución porque participan en otras vías metabólicas.
Comportamiento 
Los aminoácidos presentan actividad y actúan como ácidos débiles polipróticos, es decir, son polianfolitos. Este tipo de compuestos tienen un valor de en el cual tienen carga neta nula, es decir, cargas equilibradas. Este punto se denomina punto isoeléctrico y su importancia radica en que en este punto la solubilidad en agua es mínima. En el caso de los aminoácidos, la especie molecular con carga neta nula se denomina y es la especie en la que se encuentran todos los aminoácidos al celular.
A pesar de que los grupos ácidos y básicos están presentes en la misma molécula, presentan perfiles de distribución como si fueran entidades separadas: La carga de estos dependerá del de la solución y de sus valores de respectivos. Para calcular el en base a esto, se calcula el promedio de los valores de entre los que se encuentra la especie .
Hidrofobicidad
Algunos aminoácidos tienen grupos que pueden ser más o menos hidrofóbicos dependiendo de la estructura completa de la cadena lateral. Existen tablas que asignan valores de hidrofobicidad para los distintos aminoácidos, incluyendo los que no tienen grupos hidrofóbicos, lo que permite identificar zonas más o menos hidrofóbicas en una proteína. Algunas asignan valores negativos a los aminoácidos hidrofóbicos y valores positivos a los hidrofílicos, otras lo hacen a la inversa.
Reacciones
Todos los aminoácidos pueden dar las reacciones propias de los ácidos carboxílicos y las amidas: El grupo ácido puede formar amidas, amidas sustituidas y ésteres y el grupo amino puede formar aminas sustituidas o funcionar como una base de Schiff. Además, las cadenas laterales muestran reactividad única, como la formación de puentes disulfuro entre dos cisteínas.La reacción más importante es la polimerización por condensación, mediante la cual se forma un enlace amida entre el grupo amina de un aminoácido y el grupo ácido de otro, con liberación de una molécula de agua. Esta reacción lleva a la formación de polipéptidos, biopolímeros de aminoácidos, unidos por enlaces peptídicos. 
Polipéptidos
Los polipéptidos se clasifican según la cantidad de residuos de aminoácidos, que son moléculas resultantes de la pérdida de una molécula de agua como consecuencia de la polimerización, que contengan:
· Oligopéptidos o polipéptidos: residuos de aminoácidos.
· Proteínas: residuos de aminoácidos, lo que equivalente a .
Todos los polipéptidos tienen un extremo con un grupo amino libre, denominado extremo amino terminal o , y un extremo con un grupo ácido libre, denominado extremo carboxilo terminal o . Por convención, la secuencia de aminoácidos de un polipéptido se escribe en el sentido .
Existen polipéptidos con características inusuales, como el glutatión que presenta un enlace peptídico entre el grupo amino de una y el grupo carboxilo de la cadena lateral de un , las microcistinas que son cíclicas o la insulina que se sintetiza como un único polipéptido que luego es clivado para formar dos subunidades individuales.
Características estructurales del enlace peptídico
El enlace peptídico tiene característica de doble enlace debido a sus estructuras de resonancia, por lo que el ángulo de torsión alrededor de este se encuentra restringido a valores cercanos a en la conformación trans (mayor libertad estructura), pero puede adoptar valores cercanos a en la conformación cis.
Además, están los ángulos de torsión o ángulos diedros alrededor del enlace ) y que determinan la estructura secundaria: En una cadena extendida y aumentan a medida que se gira alrededor de estos enlaces en sentido horario. Cuando los dos enlaces peptídicos que flanquean un están en el mismo plano, , pero esto está prohibido por impedimento estérico entre el oxígeno del grupo carbonilo y el hidrógeno del grupo amino.
En un diagrama de Ramachandran se resumen los posibles pares de valores para los ángulos diedros para los distintos aminoácidos, desde las posiciones permitidas óptimas hasta las no permitidas desde el punto de vista estérico.
Niveles estructurales de las porteínas
Las proteínas están compuestas por , denominados proteicos, y tienen cuatro niveles de organización estructural:
· Estructura primaria: Es la secuencia de aminoácidos de la cadena polipeptídica.
· Estructura secundaria: Se refiere a la disposición espacial que guardan entre sí residuos contiguos en la cadena que conforman estructuras de ángulos repetitivos. Las más comunes son:
· Hélice : Existen varios de tipo de hélice, la es la más común. Están estabilizadas por puentes hidrógeno entre los grupos del residuo y del residuo y son dextrógiras.
· Cadenas y hojas plegadas: Las cadenas son cadenas polipeptídicas extendidas unidas por una torción que se estabilizan mediante la formación de puentes hidrógeno entre cadenas vecinas. Las interacciones pueden darse de manera paralela o antiparalela, siendo esta última más estable.
· Giros : Presentan una estructura no repetitiva o irregular que, en general, involucra cuatro residuos unidos por puentes hidrogeno entre los residuos y . Hay tipo I y II que difieren por un giro de del enlace peptídico y suelen conectar cadenas antiparalelas.
Una misma secuencia puede formar distintas estructuras secundarias en contextos diferentes, así como también distintas secuencias pueden dar los mismos patrones de plegamiento. Cuando las estructuras secundarias comienzan a agruparse entre sí, dan lugar a estructuras supersecundarias que luego dan origen a una estructura terciaria estable.
· Estructura terciaria: Se refiere al plegamiento de la cadena peptídica sobre sí misma en el espacio, lo que agrupa las estructuras secundarias y le confiere a la proteína una estructura tridimensional que, a su vez, determina su función. Existen dos tipos:
· Proteínas fibrosas: Adoptan estructuras filamentosas, se agrupan en fibras y tienen un rol protector, conector o de soporte.
· Proteína durable, resistente al estiramiento, no reactiva e insoluble que está presente en todos los vertebrados superiores. Es una hélice de dos hélices y presenta una estructura pseudorepetitiva de siete residuos rica en que permiten la formación de puentes disulfuro entre las hélices y residuos y no polares que permiten la interacción hidrofóbica entre las hélices. Según el contenido de azufre, se clasifican en blandas y duras.
· Proteína extracelular más abundante de los vertebrados que se organiza en fibras solubles de gran fuerza tensil. Es una hélice de tres hélices que tiene y , que confiere estabilidad mediante la formación de puentes hidrógeno intermoleculares, además de residuos de y . 
· Proteínas globulares: Poseen una forma compacta, dada fundamentalmente por interacciones hidrofóbicas, con un interior hidrofóbico y un exterior hidrofílico o, para proteínas de membrana, a la inversa. Su forma hace que aminoácidos no contiguos en la estructura primaria sean próximos es la disposición . Se clasifican en distintas familias en base a sus estructuras secundarias, como las hemoproteínas que presentan un grupo hemo.
· Estructura cuaternaria: Esta estructura la presentan proteínas que están compuestas por dos o más cadenas polipeptídicas individuales, las cuales se unen por interacciones no covalentes.
Todos los tipos de interacciones estabilizan los distintos niveles estructurales, aunque algunos predominan en determinado nivel: Los puentes hidrógeno son fundamentales para las estructuras secundarias, las fuerzas de Van der Waals y las interacciones hidrofóbicas lo son para las estructuras terciaria y cuaternaria y los puentes disulfuro intracatenarios estabilizan la estructura terciaria y los intercatenarios la cuaternaria.
En base a los niveles estructurales, se puede definir una cadena como la secuencia comprendida entre los extremos y una subunidad como las distintas cadenas que conforman una proteína con estructura cuaternaria. Además, las proteínas tienen un dominio estructural, que es la región de una cadena que presenta un plegamiento particular, generalmente asociado a una determinada función, y un dominio funcional, que es la región de una cadena asociada a una función, pero no siempre a un domino estructural.
Modificaciones postraduccionales 
Las son modificaciones químicas de las cadenas laterales de las proteínas que regulan su actividad, localización e interacción con otras moléculas. Aunque pueden ocurrir espontáneamente (reacciones redox, carbonilación, sulfinilación, etc.), generalmente están mediadas por enzimas.
· Fosforilación: La proteína enzimática toma una molécula de y transfiere su fosfato a un residuo de cerina, trionina o triosina en la proteína blanco, dando lugar a la proteína fosforilada y liberando . Las proteínas fosforiladas son más reactivas y pueden ser defosoforiladas por la proteína enzimática .
· Glicosilación: Se da la unión de un oligosacárido a distintos grupos funcionales de las cadenas laterales, como al grupo amino de un residuo de o al oxhidrilo de residuos de o .
· Ubiquitinación: Consiste en la adicción de , una proteína con distribución ubicua que modifica la función de la proteína. En primer lugar, la proteína enzimática cataliza la unión de la ubiquitina a la proteína , la cual transfiere la ubiquitina a la proteína enzimática , la cual, finalmente, la transfiere a una molécula blanco con ayuda de la proteína enzimática . También se puede dar la poliubiquitinación que indica que la proteína debe ser degradada.
· Otros: , metilación, , lipidación, proteólisis.
Proteínas conjugadas
Estas proteínas contienen grupos prostéticos, estructuras orgánicas o inorgánicas complejas, no proteicas y unidas mediante enlaces covalentes o no covalentes fuertes al resto de la proteína. A la proteína se la llama y al conjunto se lo llama .
Plegamientode proteínas
Las proteínas cumplen diferentes funciones celulares según su estructura: Una vez que son producidas, se pliegan para adoptar la estructura tridimensional necesaria para cumplir su función biológica.
En general, todas las proteínas tienen regiones ordenadas (hélices , láminas , etc.) y otras desordenadas (loops). Sin embargo, existen las proteínas intrínsicamente desordenadas que carecen de una estructura fija u ordenada y, en su lugar, cubren un espectro de estados desde parcial hasta completamente ordenados ya que tienen regiones fijas y otras flexibles. Esta dinámica es crucial para que pueda cumplir con su función biológica y, además, pueden adoptar una forma fija luego de unirse a otra macromolécula.
Proceso de plegamiento
El proceso comienza con la síntesis de la proteína en los ribosomas. Una vez sintetizada, la proteína desplegada es liberada al medio donde puede plegarse correctamente, plegarse incorrectamente o ser degradada. La proteína mal plegada puede llevarse a la forma correctamente plegada por las proteínas chaperonas, puede ser degradada por el complejo proteico o pasar a formar parte de un agregado proteico o complejo de inclusión, un cuerpo de proteínas unidas por interacciones hidrofóbicas debido a que exponen los residuos hidrofóbicos al malplegarse.
Para que el plegamiento sea correcto, la síntesis debe transcurrir en el medio adecuado y a la velocidad adecuada. Además, que la proteína sea estable y mantenga esta conformación depende de las características fisicoquímicas del medio y de distintas variables, como y temperatura.
El proceso de plegado es bastante ineficiente, muchas de las proteínas sintetizadas nunca adquieren su conformación correcta. En el caso de las proteínas de secreción, el plegado en el es la etapa limitante debido a la cantidad de proteínas por minuto que debe procesar este orgánulo.
Etapas del proceso de plegamiento
· Episodios iniciales: Formación de estructuras secundarias de manera muy rápida después de iniciado el proceso, por lo que se conoce como fase de estallido. En proteínas globulares la fuerza de plegamiento es la expulsión de las moléculas de agua del interior (colapso hidrofóbico), lo que genera un glóbulo fundido similar a la proteína nativa pero con sus cadenas laterales desordenadas, una estructura más fluctuante y una estabilidad termodinámica marginal. 
· Episodios intermedios: Se dan la estabilización de las estructuras secundarias y la formación de la estructura terciaria de manera relativamente lenta .
· Episodios finales: La proteína adopta la forma nativa mediante una serie de movimientos complejos, la formación de puentes hidrógeno y expulsión de las moléculas de agua remanentes. Es un proceso lento, de varios segundos.
Teoría clásica del plegamiento proteico
Las proteínas se pliegan mediante una serie de intermediarios bien definidos constituidos por tramos cortos de estructura secundaria formados el azar, lo cuales actúan como núcleos de estabilización de regiones ordenadas adicionales y crecen por difusión, colisión al azar y adhesión. Luego de alcanzar cierto tamaño, estas regiones crecen de manera cooperativa hasta formar un dominio similar al nativo y, finalmente, mediante una serie de ajustes relativamente pequeños, el dominio se rearregla a la conformación nativa.
Teoría del paisaje del plegamiento proteico
El plegamiento se produce sobre una superficie de energía o un paisaje que representa los estados de energía conformacional disponibles para un dado polipéptido: La coordenada horizontal representa una conformación particular (valores de los ángulos diedros y de torsión de las cadenas laterales de cada aminoácido) y la vertical la energía libre interna del polipéptido en esa conformación particular.
La superficie tiene forma de embudo: El vértice representa el estado nativo (mínimo de energía) y el ancho en cualquier altura por encima de este indica el número de estados conformacionales con una determinada energía libre, es decir, la entropía del polipéptido.
Los polipéptidos se pliegan por medio de una serie de ajustes conformacionales que reducen su energía libre y su entropía hasta alcanzar el estado nativo. No existe una única vía o un conjunto de vías relacionadas, lo que implica que la superficie de energía no sea lisa sino rugosa, con mínimos y máximos locales de energías. Una proteína puede caer en un mínimo local y no lograr salir de ahí, por lo que queda incorrectamente plegada.
La superficie de energía de una proteína que se pliega según la visión clásica debería mostrar un surco radial profundo con una pendiente hacia el vértice, lo que indica que el plegamiento es relativamente rápido. Pero, la búsqueda de dicho surco demandaría mucho tiempo, lo que implica que el inicio del proceso demandaría varios segundos.
Proteínas que intervienen en el plegamiento
· Isomeriza un enlace a uno .
· Enzima presente en el de los eucariotas que cataliza la formación y ruptura de puentes disulfuro entre cisteínas durante el plegamiento.
· Chaperonas: Participan en el plegamiento de las proteínas, previenen la agregación y colaboran en el replegamiento. En bacterias existen dos mecanismos:
· Chaperonas: Se unen a una proteína mal plegada, la despliegan y ayudan a replegarla correctamente o la derivan a una chaperonina.
· Chaperonina: Captan una proteína desplegada, liberan fosfato por hidrolisis de para replegarla correctamente y, por último, captan otra proteína desplegada al tiempo que liberan la primer proteína replegada.
Proceso de desnaturalización proteica
La desnaturalización es el paso de una proteína en su estado nativo a su estado desnaturalizado por aumento de temperatura, cambio de o agregado de agentes caotrópicos . El estado es el estado desplegado donde se pierde la funcionalidad y cambian la forma, los parámetros hidrodinámicos, la hidratación y las propiedades espectroscópicas de la proteína.
La desnaturalización es un proceso cooperativo que generalmente se puede estudiar como un equilibrio entre dos estados con estados intermedios parcialmente plegados y generalmente indetectables. Así, se puede determinar la constante de equilibrio experimentalmente midiendo alguna variable a medida que varía alguna propiedad desnaturalizante (concentración de , temperatura, etc.).
A partir de la constante de equilibrio se puede calcular la diferencia de energía libre entre ambos estados. En general, esta diferencia es pequeña y negativa debido a la formación de enlaces no covalentes y a que se pasa a un estado más ordenado . Esto determina que el estado nativo sea la conformación de mínima energía en determinadas condiciones.
Renaturalización de proteínas recombinantes
La producción de proteínas nativas en forma recombinante lleva a una elevada producción, pero en forma de cuerpos de inclusión insolubles. La ventaja es que se obtiene la proteína en grandes cantidades, relativamente pura y menos susceptible a la degradación por , pero en forma insoluble y desnaturalizada.
Entonces, en un primer paso se solubiliza la proteína en condiciones desnaturalizantes, generalmente utilizando agentes caotrópicos, y luego se cambian las condiciones lentamente para permitir que la proteína se repliegue correctamente. Esto se puede lograr mediante:
· Dilución.
· Intercambio de solvente por diálisis o cromatografía de exclusión molecular.
· Adsorción reversible a un soporte cromatográfico que puede servir sólo para inmovilizar, aislar y permitir el cambio de condición, o puede tener un ligando específico que facilite el plegamiento. 
Solubilidad de proteínas
Los múltiples grupos que adoptan una conformación hidratada determinada determinan las propiedades de solubilidad particulares de cada macromolécula, por lo que esta depende de la concentración de sales disueltas, de la polaridad del solvente, de la presencia de detergentes o solventes orgánicos, del y de la temperatura. Además, los agentes caotrópicos o que afectan la estructura del agua también afectan la solubilidad.
Con el agregadode sal se da el fenómeno de , por el cual la solubilidad de una proteína incrementa debido a que los iones de las sales estabilizan los iones de las porteínas. Luego, si se continúa aumentando la concentración de sales disueltas, se llega a un punto en que se da el fenómeno de , por el cual las sales compiten por la solvatación del agua y disminuyen la solubilidad de la proteína.
En general, se usan sales con iones divalentes para precipitar proteínas debido a que, con menores concentraciones, tienen un mayor efecto sobre la fuerza iónica y, por ende, un mayor efecto sobre la solubilidad de las proteínas.
Métodos de cuantificación de proteínas
· Método Kjeldahl: Es un método de referencia que consiste en la mineralización del y la subsiguiente cuantificación del amonio liberado. Es muy laborioso y requiere grandes cantidades de muestra, por lo que no es el método de elección para trabajar con proteínas.
· Método Biuret: Se basa en la formación de un complejo coloreado entre la proteína y en medio alcalino con posterior reducción a frente a la oxidación de algunos aminoácidos y formación de un nuevo complejo de distinto color, por lo que se cuantifica midiendo los cambios de absorbancia.
· Método Lowry: Es un método que presenta alta sensibilidad y que resulta de la combinación de la reacción de Biuret con la reacción de reducción del reactivo de frente al y algunos aminoácidos. El resultado es un cambio de color del complejo formado por el reactivo de , cuya absorbancia puede ser medida.
· Reacción del : Se basa en la reacción de Biuret pero el cambio de color se da por la formación de un complejo entre el y el .
· Método de Bradford: Se utiliza un colorante que en medio acido tiene un color y, al unirse a los reactivos básicos de la proteína, cambia de color. La absorbancia del complejo dependerá de la proteína, por lo que este procedimiento no es exacto debido a que el patrón utilizado no tendrá la misma absorbancia que la proteína estudiada.
· Absorbancia a .
· Cuantificación específica: Se basa en un en el cual se adhiere sobre una superficie un anticuerpo específico para la proteína de interés, lo cual se incuba con una muestra que contiene dicha proteína. Luego se agrega un segundo anticuerpo también específico para la proteína de interés, pero que, además, tiene unida una enzima. Dicha enzima convierte un sustrato en un producto colorido cuya absorbancia es proporcional a la concentración de la proteína de interés.
Enzimas
Unidades de actividad enzimática
· cantidad de enzima necesaria para convertir en producto por segundo en condiciones de concentración de sustrato saturante; temperatura, y fuerza iónica óptimos para la enzima en cuestión.
· Cantidad de enzima necesaria para convertir en producto por minuto en condiciones de concentración de sustrato saturante; temperatura, y fuerza iónica óptimos para la enzima en cuestión.
Estas unidades luego se refieren en un cierto volumen de muestra: o . Esto significa que la solución presenta, por cada mililitro, la cantidad de enzima capaz de catalizar la conversión de de sustrato por segundo o minuto, respectivamente, en condiciones de concentración de sustrato saturante y , temperatura y fuerza iónicas óptimos. Esta nomenclatura nos acerca a la idea de concentración de la enzima en términos de su funcionalidad, siendo la forma usual de expresión de concentración enzimática.
Cada experimentador puede generar una definición propia de unidad enzimática en función de las características del sistema de estudio o de la facilidad para el manejo de los datos. La definición de esa unidad de actividad debe incluir: Cantidad de sustrato, condiciones de temperatura, , fuerza iónica y sales utilizadas.
La medida de actividad enzimática se utiliza para calcular el rendimiento del procedimiento de purificación y la de actividad específica el grado de purificación. Específicamente, el rendimiento da cuenta del porcentaje de la cantidad de enzima de interés que se ha podido recuperar después de la purificación respecto a lo que había en el material de partida y el grado de purificación refleja en forma cuantitativa cuántas veces se ha logrado purificar la enzima luego del procedimiento de purificación. La determinación de rendimiento y grado de pureza se pueden realizar respecto de un paso anterior de la marcha de purificación según:
Velocidad inicial de reacción
Es la velocidad que se mantiene constante por un periodo de tiempo y es distinta de cero debido a que se da en el intervalo de tiempo donde la reacción inversa a la catalizada por la enzima no tiene lugar. Puede calcularse de la pendiente de la gráfica que evalúa la cantidad de sustrato transformado o producto formado en el tiempo en el intervalo de tiempo correspondiente:
La velocidad de la reacción depende de concentración inicial de sustrato en la mezcla de reacción, la cantidad de enzima, la temperatura y buffer por lo que todas estas variables deben ser definidas. En esas condiciones se podrá hallar un valor de actividad enzimática, para lo cual será necesario realizar cálculos para convertir el resultado en la unidad definida y a un volumen de “extracto enzimático” o al “volumen de enzima” agregado en la mezcla de reacción.
La medida debe realizarse en condiciones de velocidad inicial de reacción, ya que así será despreciable la reacción inversa y la velocidad de reacción será la velocidad instantánea de reacción y constante. Durante los cálculos previos del diseño experimental se considera que la condición de se mantendrá mientras no se haya consumido más del del sustrato.
Acoplamiento con ensayos radiométricos
Caracterización estructural: Se realiza cortes con proteasas específicas que luego son analizados según su masa. A partir de los cortes y sabiendo los péptidos obtenidos, se reconstruye la secuencia.
Si las enzimas no pueden atacar los extremos libres, es un péptido cíclico. Si no pueden atacar por un único extremo, dicho extremos puede tener una modificación postraduccional.
Hipótesis sobre la relación en proteínas
· Hipótesis de (Fisher): Plantea la existencia de un único estado o estructura para representar la conformación nativa de la proteína y que el sustrato es perfectamente complementario al sitio de unión de la proteína.
· Modelo de ajuste inducido (Koshland): Plantea la existencia de un único estado o estructura para representar la conformación nativa de la proteína que puede sufrir cambios conformacionales para adaptarse a la presencia de un sustrato u otros ligandos. Es decir, la presencia del sustrato induce un cambio conformacional en la proteína.
· Modelo de o selección conformacional (Manod): Plantea que el estado nativo de una proteína no es único, sino que está formado por distintos confórmeros en equilibrio. Los distintos confórmeros están presentes previo al agregado de sustrato, ya que este selecciona el confórmero que muestra mayor afinidad, unirse a este y, así, desplazar el equilibrio conformacional hacia ese confórmero.
La relación puede ser una propiedad degenerada: Estructuras distintas pueden tener la misma función y la misma estructura puede tener varias funciones.
Gran parte de las enzimas son promiscuas: Pueden procesar más de un sustrato por similitud (química, conformacional, etc.) que pueden ser artificiales o no tener importancia biológica, pero con distintas capacidades de unión y/o catalíticas. Las enzimas son capaces de procesar varios sustratos que tienen importancia biológica.
Significado de los parámetros de la ecuación de 
· Velocidad máxima : Es la máxima velocidad inicial que puede alcanzar la enzima, lo cual se da cuando se alcanza el punto de saturación de la misma. Matemáticamente define la asíntota horizontal, de manera que cuando porque pero nunca . Depende la pureza de la enzima, por lo que debe determinarse sobre la enzima pura.
· Constante de Es una relación de constantes cinéticas que concide con la a la cual , tiene unidades de concentración porque , pero no es una concentración de sustrato.Químicamente es la constante de disociación del complejo , por lo que es inversamente proporcional a la afinidad de la enzima por el sustrato. Matemáticamente define la asíntota vertical de la de la función hiperbólica dada por la ecuación de . Depende del , la temperatura y la estructura del sitio activo de una manera impredecible, ya que cambiará de acuerdo a cómo estos parámetros afecten a las constantes cinéticas de las cuales depende. No depende del grado de pureza de la enzima.
· Constante catalítica o número de recambio Representa el número de ciclos catalíticos que la enzima es capaz de producir por unidad de tiempo, por lo que da idea de la eficiencia catalítica.
· Constante de especificidad La eficiencia catalítica está relacionada con la etapa de unión al sustrato y con la etapa catalítica, por lo que indica la afinidad de la enzima por el sustrato y la velocidad de formación del producto. Esto permite utilizarla para distinguir con qué grado de eficiencia una enzima puede utilizar distintos sustratos (enzimas promiscuas).
 son constantes que depende de temperatura, , fuerza iónica y demás condiciones del medio, por lo que se deben especificar todas las condiciones de la determinación de las mismas.
Inhibición y activación
Un efector es una molécula capaz de unirse a la enzima y provocarle un cambio conformacional tal que modifique la estructura o el estado de ionización del sitio activo y, por el ende, su capacidad catalítica. Estos pueden ser endógenos o exógenos y pueden inhibir o activar las enzimas, de manera que se clasifican en inhibidores y activadores.
Inhibidores
Se clasifican según cómo se unan a la enzima en:
· Reversibles: La unión del inhibidor es reversible a la del sustrato, por lo que una alta puede desplazar el equilibrio hacia la formación de complejo .
· Irreversibles: Llevan a la enzima a estado permanentemente inactivo. Esto quiere decir que disminuyen la cantidad de enzima activa, por lo que se verá realmente disminuida y no se verá afectado.
Se clasifican según el grado en el que bloquean la actividad enzimática en:
· Lineales: Forman un complejo incapaz de producir .
· Parciales o hiperbólicos: Forman complejos que poseen una actividad reducida.
Se clasifican según qué lugar dentro de la estructura de la enzima constituya su sitio de unión en:
· Competitivos: Son moléculas que se unen a la enzima de tal manera que bloquean el acceso del sustrato al sitio activo. Muchos tienen una estructura similar a la del sustrato y otros pueden unirse a la vecindad del sitio activo y taponarlo. La unión del inhibidor es reversible y alternativa a la del sustrato, por lo que una alta puede desplazar el equilibrio hacia la formación de complejo y no varía.
· Acompetitivos: Son moléculas que se unen reversiblemente al complejo para formar el complejo inactivo. Existe un orden secuencial: Primero debe unirse el sustrato para que luego pueda unirse el inhibidor, ya que este es incapaz de unirse a la enzima libre.
· De tipo mixto: Combinan las propiedades de los inhibidores competitivos y acompetitivos, ya que pueden unirse a la enzima libre y al complejo y dar lugar a dos complejos inactivos: y .
· Es un caso especial de la inhibición de tipo mixto en la que el inhibidor tiene la misma afinidad por la enzima libre que por el complejo .
Activadores
Son efectores que deben unirse a la enzima para que esta tenga actividad catalítica. De acuerdo con sus mecanismos de reacción, pueden clasificarse en:
· Esenciales: Deben unirse a la enzima libre para formar un complejo capaz de unir el sustrato y catalíticamente activo.
· De tipo mixto: La unión del activador puede darse a la enzima libre y al complejo .
Reacciones con más de un sustrato
Formación de complejos ternarios
En este mecanismo de reacción, ambos sustratos ocupan el sitio activo en algún momento y a la vez. La entrada de los reactivos y la salida de los productos puede darse al azar o de manera secuencial, pero siempre el complejo ternario es el único activo.
Para ambos mecanismos se utiliza la aproximación del equilibrio rápido y se tiene en cuenta que las constantes de asociación del segundo sustrato y de disociación del primer producto se verán afectadas por la presencia del otro sustrato o producto.
En el mecanismo del complejo ternario al azar, todas las reacciones están en equilibrio menos la etapa lenta. Por el contrario, en el mecanismo del complejo ternario de orden obligatorio, solo las constantes de entrada del primer sustrato y la constante de salida del segundo producto pueden considerarse constantes de disociación debido a que no están afectadas por la presencia de otros sustratos o productos.
Formación de enzimas sustituidas
En este mecanismo de reacción, uno de los sustratos ingresa a la enzima, transfiere un grupo a esta y sale, luego ingresa el segundo sustrato, la enzima le transfiere el grupo y se liberan los productos. De esta manera, no se forma un complejo ternario, por lo que las constantes de asociación y disociación no se ven afectadas, pero se forman dos complejos activos con distintas constantes catalíticas: .
Representaciones gráficas
La cinética de las enzimas multisustrato puede analizarse manteniendo todos sus sustratos a saturación menos uno, calcular los parámetros cinéticos de ese, luego hacer lo mismo con otro, y así sucesivamente. El problema surge en que las intersecciones de las normalizaciones de la ecuación de no dan directamente los parámetros cinéticos, sino que deben realizarse gráficos secundarios para encontrarlos.
Efectos del y la temperatura en la catálisis enzimática
Estos parámetros son tan fundamentales que no puede expresarse una unidad de actividad si no se informa a qué pH y temperatura fue medida. Afectan a la estabilidad de la enzima y a sus constantes cinéticas, por lo que afectan la velocidad de reacción y la proporción de enzima activa. Además, afectan al sustrato y al curso de la reacción. En específico, el determina la proporción de sustrato en la forma iónica adecuada.
Efectos del 
Las curvas del estado de ionización de las enzimas suelen tener una forma de campana, ya que son varios los grupos con diferentes pKa presentes en su estructura. Dado que el sustrato también puede asumir distintos estados de ionización, es posible que la curva de campana de la enzima se superponga con una curva de estado de ionización del sustrato. De la intersección de ambas curvas surgirán los pH a los cuales la reacción es posible, y el porcentaje de actividad vendrá dado por el porcentaje de formas activas en el estado de ionización correcto de la enzima.
El estado de ionización de la enzima también puede afectar la unión del sustrato o la catálisis, de manera que puede tener efectos en y . Así, para que la comparación del efecto del sobre la actividad enzimática sea válida, es necesario comparar valores tanto de como de a distintos .
Efecto de la temperatura
La velocidad de las diferentes reacciones catalizadas por enzimas se incrementa con la temperatura en función de la energía de activación de dichas reacciones. Además, a esto se le agrega que todas las enzimas se desnaturalizan de forma irreversible cuando se las calienta por encima de las temperaturas fisiológicas.
La desnaturalización aporta que se genere un equilibrio entre la enzima activa y la inactiva, ya que la velocidad puede analizarse considerando solo la primera. De aquí pueden plantearse constantes de equilibrio y cinéticas que varían con las ecuaciones de van´t Hoff y Arrhenius, respectivamente, de manera de plantear ecuaciones que permitan conocer el efecto de la temperatura sobre las velocidades de reacción y la energía de activación.
Para la mayoría de las reacciones enzimáticas, depende de varias contantes de velocidad que varían de manera diferencial con la temperatura, de manera que la energía de activación estimada será un valor aparente. Además, la representación de Arrhenius puede no ser lineal y una caída brusca indica desnaturalización de la proteína.
Ensayo de la estabilidad frentea la temperatura
El efecto de la temperatura depende también del tiempo de incubación de la enzima a distintas temperaturas, ya que la desnaturalización será más rápida cuanto mayor sea la temperatura. Así, a través del ensayo de estabilidad, se podrá identificar una temperatura óptica en la que se observa que el valor máximo de la actividad enzimática se mantiene constante por un período de tiempo por lo menos tan largo como el que dura el ensayo.
En este ensayo se preparan mezclas de reacción de igual composición y se las incubada a diferentes temperaturas. A partir de los resultados, se obtiene una gráfica de la evaluación a cada temperatura de la variación de la concentración de producto en función de tiempo, de la cual se definen la o las temperaturas a las que se detecta el valor más alto de .
Para establecer la temperatura óptima se realiza un ensayo de estabilidad que implica incubar las mezclas de reacción sin sustrato a distintas temperaturas por un tiempo igual o el doble del empleado en el ensayo de actividad. Una vez finalizada la incubación, se adiciona el sustrato y se incuba a la temperatura en que se detectó el valor más alto de .
 
Cooperativismo y alosterismo
El cooperativismo y el alosterismo son propiedades generales de las proteínas: No todas las proteínas son cooperativas pero la gran mayoría son alostéricas. Además, una proteína puede ser sólo cooperativa, sólo alostérica o tener ambas propiedades.
El cooperativismo se define como la capacidad que tiene una proteína de cambiar sus constantes de unión para un determinado ligando en función de la concentración de ese ligando. Por otro lado, el alosterismo se define como la capacidad que tiene una proteína de cambiar sus constantes de unión para un determinado ligando en función de la concentración de otro ligando. (modulador alostérico) que se une en un sitio distinto al sitio activo (sitio alostérico).
De esta manera, para que exista cooperativismo es necesario que la proteína tenga al menos dos sitios de unión al ligando que se influencien uno con otro para facilitar o dificultar la unión del ligando. Por otro lado, para que exista alosterismo, es necesario que exista al menos un sitio alostérico.
La evidencia experimental más común de la existencia de cooperativismo es el alejamiento del comportamiento micaeliano al graficar , donde se observa un comportamiento sigmoidal en lugar de una hipérbola cuadrática típica. Existen proteínas con cooperativismo positivo, que favorecen la unión de ligando, y negativo, que desfavorecen la unión de ligando.
Para comprobar si la proteína tiene comportamiento alostérico se realiza nuevamente el ensayo, pero sumando la concentración de otro ligando. La diferencia entre ambas curvas (a una determinada concentración de sustrato) pone de manifiesto la presencia de alosterismo.
 
 
Modelo de Monod
El modelo se basa en que la proteína se encuentra en solución representada por dos confórmeros en equilibrio, de forma que uno tiene mayor afinidad por el sustrato y de manera que, en ausencia del sustrato, prevalece el confórmero con menor afinidad. Este modelo está planteado sólo para proteínas oligoméricas y supone que dichas proteínas tienen la misma constante de afinidad para cada uno de sus sitios en el respectivo confórmero. 
En el caso del cooperativismo, el sustrato seleccionará (se unirá preferencialmente) al confórmero con mayor afinidad por sobre el otro, al cual se unirá en mucho mayor medida. Así, la población del confórmero con mayor afinidad irá aumenta al ir aumentando la concentración de sustrato y, de esta manera, aumentará la población de sitios más afines al sustrato.
En el caso del aloterismo, los moduladores alostéricos son moléculas orgánicas que simplemente estabilizan diferencialmente a un confórmero en detrimento de otro, de manera que la concentración de sitios más o menos afines por el sustrato aumente en relación a la concentración de los otros sitios.
Modelo de Koshland
Este modelo se plantea en base al modelo de ajuste inducido y suponiendo una proteína oligomérica donde cada subunidad contiene un sitio de unión al ligando. La unión del ligando induce un cambio conformacional en la subunidad que se propaga hacia las otras subunidades vacías, alterando su afinidad y dando lugar a estructuras “intermediarias” donde algunas subunidades cambiaron y otras no.
Ambos modelos ajustan correctamente las curvas sigmoidales de la gran mayoría de las enzimas y proteínas cooperativas y/o alostéricas. Aun así, numerosas evidencias experimentales dan amplio soporte al modelo de Monod y, en los últimos años, se han publicado modelos que funcionarían como una mezcla de los dos. La evidencia experimental crucial para determinar si una proteína funciona siguiendo un modelo u otro consiste en determinar la presencia del pre-equilibrio de los confórmeros o la presencia de los intermediarios conformacionales a medida que se une sustrato.