EJERCICIOS RESUELTOS DE MACROMOLÉCULAS-BIOQUIMICA (2)

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Teoría de cromatografía
Parámetros de retención
· Volumen de retención. Es el volumen que ha pasado por la columna desde la introducción de una muestra hasta la salida de cierto componente, se observa como un pico en el cromatograma.
· Tiempo de retención. Misma definición que el , pero, en vez del volumen, el tiempo que ha pasado.
· Relación de flujo volumétrico.
· Factor de retención o partición.
· Volumen de retención. Volumen de fase móvil en la columna.
· Número de volúmenes de retención necesarios para eluir el compuesto de interés.
· Factor de retardación. Es la relación no lineal entre la velocidad del componente y la de la fase móvil. Se usa particularmente en cromatografía que no es de columna.
La separación de dos compuestos es posible solo cuando sus velocidades valores de y, por ende, sus valores de y , difieren en cierta cantidad. Adicionalmente, otros parámetros relacionados al ancho de los picos son necesarios para especificar la resolución de dos compuestos. 
Teoría de los platos teóricos
· Número de platos teóricos.
· Ancho del pico a mitad de la altura de dicho pico.
· Ancho del pico en la base de dicho pico.
· Área del pico.
· Altura del pico.
Estas ecuaciones son solo válidas para picos razonablemente simétricos, pero no para picos con cola. Para aplicarlas no es importante si se utiliza o , pero sí es importante medirte los anchos en las mismas unidades que Por último, el número de platos teóricos puede ser utilizado para caracterizar el rendimiento de una columna, ya que los picos se vuelven más angostos mientras más cantidad de platos teóricos tenga dicha columna.
· Altura de un plato teórico.
· Largo de la columna.
La altura de un plato teórico también permite describir la calidad de una columna, ya que el número de platos teóricos de dicha columna es aproximadamente proporcional al largo de esta. Así, para una buena columna, el valor de es bajo.
La ecuación de van Deemter
· Factor de flujo linear.
· Término Eddy. Describe el ampliamente de los picos debido a la complicada geometría de una columna empacada, es proporcional al diámetro de las partículas empacadas en la columna .
· Este término resulta de la difusión de la muestra a lo largo de la columna.
· Este término se origina de varios parámetros dinámicos como la transferencia lenta de moléculas hacia dentro o fuera de los poros o dentro de la fase estacionaria, proporcional a y equilibrios no instantáneos, proporcional a .
Según está ecuación, es la suma de tres contribuciones independientes que dependen del factor de flujo de la fase móvil. La gráfica de esta ecuación mostrará una un mínimo a un cierto factor de flujo óptimo, al cual el un máximo número de platos es obtenido. En la práctica, en especial para cromatografía líquida de macromoléculas, este óptimo es imprácticamente bajo. Entonces, lo que se busca es jugar con los térmicos de la ecuación, modificando los factores a los cuales son proporcionales hasta alcanzar un óptimo práctico.
Resolución
· Resolución de pico de un par de picos en particular, es decir, la distancia entre los máximos de los picos dividida por la media del ancho de pico.
· , los picos están incompletamente separados. 
· , los picos se tocan solo en la base.
· , los picos estarán separados en sus bases cierta distancia.
Entonces, las condiciones de separación óptimas son alcanzadas cuando para cualquier par de interés, pero la resolución es innecesariamente buena y la separación puede ser más rápida si .
· Media de los factores de retención de los dos picos . Si , el aumento de resolución es marginal y va a resultar en separaciones más lentas. Si , la resolución es innecesariamente lenta.
· Separación relativa de los factores de retención . Si , la separación no es posible.
Esta ecuación muestra que la resolución depende de tres factores más o menos independientes: La selectividad, la retención y el número de platos. La selectividad es usualmente la más importante porque un pequeño cambio de esta genera un gran cambio en la resolución.
Retención en cromatografía de adsorción
Isotermas de adsorción
El concepto central de la adsorción es la isoterma de adsorción, un gráfico de la concentración de la muestra en la superficie de adsorción de la fase estacionaria frente a la concentración de la misma en la fase móvil .
La forma curva se origina en la competencia entre las moléculas de la muestra por los sitios de adsorción. Suponiendo que el adsorbente tiene un número fijo de ligandos o sitios de adsorción iguales a los que las moléculas de proteína de la muestra se unen uno a uno de forma reversible, entonces aplica el siguiente equilibrio:
Para la mayoría de los equilibrios de adsorción se debe considerar la competencia de dos contraligandos diferentes, uno de los cuales es la molécula de muestra y otro es un componente del eluyente:
 es una constante de selectividad, el cociente de las constantes de asociación relevantes. Pueden resolverse ambos para , lo que lleva a la ecuación de la isoterma de adsorción de Langmuir:
· Para el caso del segundo equilibrio se debe tener en cuenta la igualdad entre y .
· La capacidad de unión o del adsorbente, es decir, la cantidad de sitios por unidad de área o peso. Está dada por:
Para una concentración de eluyente fija, la ecuación de Langmuir también es válida para equilibrios de competencia. En aplicaciones prácticas de purificación de proteínas puede haber moléculas que interfieren, pero el modelo de Langmuir todavía se aplica con una constante condicional que incorpora las influencias de estas moléculas competidoras.
Los supuestos sobre los que se basan las derivaciones anteriores pueden no ser del todo aplicables en todos los casos: Los sitios de adsorción pueden ser desiguales, puede haber sitios múltiples de unión y puede haber interacciones entre las moléculas adsorbidas.
Retención cromatográfica
Asumiendo una isoterma de adsorción de Langmuir, la expresión adecuada del volumen de retención es:
Esto se da cuando la concentración de las muestras es grande debido a que las partes más concentradas son más retardadas que las más lentas y los picos resultan con colas. En cambio, para el caso de análisis donde las muestras son lo suficientemente poco concentradas, el denominador es despreciable y se obtienen las siguientes expresiones:
· Área total o peso del adsorbente en la columna o, dependiendo de la definición de .
· Número total de sitios de adsorción en la columna.
El volumen de retención aquí es independiente de la concentración de la muestra y está determinada únicamente por los parámetros de la columna y por la constante de equilibrio . Este caso se denomina cromatografía lineal, caracterizada por una simple descripción teórica de retención de pico y dispersión. El término lineal se refiere al hecho de que es equivalente a la suposición de una isoterma de adsorción lineal.
Cromatografía de exclusión molecular
Selectividad
Una estrategia de separación debería, en general, centrarse en obtener una alta selectividad en lugar de una alta eficiencia, a menos que la dilución del pico sea un factor crítico. La selectividad de un material es, a diferencia de otros tipos de soportes, no ajustable cambiando la composición de la fase móvil, sino que es una propiedad inherente del material, y el volumen de separación de la columna está limitado por el volumen total de los poros de las partículas empaquetadas.
La curva de selectividad del material de separación se obtiene trazando el volumen de elución, o alguna función del mismo, frente a una expresión del tamaño del soluto. A menudo, el coeficiente de distribución está relacionado con el logaritmo de la masa molecular del soluto y se calcula a partir de:
· Es una variable independiente de la columna que expresa la sensación relativa del volumen de poro por parte del soluto. Así, para solutos muy pequeños y para solutos muy grandes.
· Volumen de retención o elución.
· Volumen y tiempo de vacío extra-partícula.
· Volumen de líquidoembebido en las partículas.
· Volumen total de líquido.
Resolución
El objetivo final de cualquier separación es la resolución aceptable de un conjunto de componentes de una muestra. Se requiere un para una separación total (en la práctica) de picos de forma gaussiana de igual concentración, lo que significa que están separados por o un .
La distancia pico a pico está relacionada con la selectividad y el volumen de poro del material , es decir, la ecuación de se puede reorganizar para:
Se busca que el material tenga una diferencia máxima entre y , es decir, máxima selectividad para los componentes de interés. La selección de una resina de alto volumen de poros mejora aún más la resolución. Además, es proporcional a las dimensiones de la matriz y el tamaño de las partículas influirá en el ensanchamiento de los picos. Por supuesto, la estrategia de optimización está relacionada con la situación de separación.
El volumen de la muestra contribuirá considerablemente al ancho del pico de la muestra, a menos que el volumen sea pequeño en comparación con la dispersión volumétrica causada por la propia columna. Esto significa mantener la concentración y el volumen tan bajos como lo permita la sensibilidad del detector.
Una desventaja inherente de la es que la muestra no se adsorbe y, por lo tanto, no se concentra. Por otro lado, esto también significa que generalmente no se requiere un paso de reequilibrio entre las aplicaciones de muestra, lo que aumenta el rendimiento.