PARCIAL RESUELTO DE QUIMICA BIOLÓGICA (2)

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QUÍMICA BIOLÓGICA – Bioquímica y Lic. en Biotecnología 
Guía de Trabajos Prácticos 
Año 2018 
 
 
Año 2018 
 
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TRABAJO PRÁCTICO GLOBALIZADOR 
“CAMBIOS METABÓLICOS INDUCIDOS POR DIETA RICA EN SACAROSA” 
 
OBJETIVOS 
 Observar alteraciones metabólicas inducidas por una dieta rica en sacarosa administrada a 
animales de experimentación. 
 Determinar parámetros bioquímico-metabólicos en suero y tejido hepático. 
 Evaluar el metabolismo de hidratos de carbono y lípidos mediante la aplicación e 
interpretación de pruebas in vivo 
 Comparar los resultados obtenidos en el lote experimental respecto de su control. 
 
 
METODOLOGÍA 
ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN 
Se utilizan ratas macho de la cepa Wistar, mantenidas en bioterio a una temperatura estable 
de aproximadamente 22 °C, con ciclo de luz-oscuridad de 12 hs (luz: 7 – 19 hs) y libre acceso al 
agua y a la dieta estándar de laboratorio. Al alcanzar 180-200 g de peso corporal, las ratas se 
dividen aleatoriamente en dos lotes, experimental y control, y se dejan en ayuno durante 12-14 
hs, con el objetivo de que acepten el cambio de dieta. 
 Lote experimental: ratas alimentadas con dieta rica en sacarosa (DRS) 
 Lote control: ratas alimentadas con dieta estándar de laboratorio o dieta control (DC) 
 
 Los animales fueron alimentados con sus respectivas dietas durante un período de 180 días. 
 
COMPOSICIÓN DE LAS DIETAS 
 
Componentes 
DC DRS 
g/100g E (Kj/g) g/100g E (Kj/g) 
Almidón 62,5 - 
Sacarosa - 62,5 
Proteínas (caseína) 17,0 17,0 
Aceite de maíz (ω6) 8,0 8,0 
Clorhidrato de colina 0,2 0,2 
Metionina 0,3 0,3 
Sales y vitaminas 4,5 4,5 
Fibra 7,5 7,5 
Dato: 1 cal equivale a 4,18 J. 
 
Ambas dietas son isocalóricas y proveen aproximadamente 16,3 kJoules/g de dieta seca. 
La mezcla de sales y vitaminas son las recomendadas por el Instituto Americano de Nutrición 
(AIN – 93 M) para ratas adultas jóvenes. 
 
Calcular E (kJ/g) para cada dieta. 
 
 
 
 
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SEGUIMIENTO DE LOS ANIMALES 
 
El seguimiento de los animales que se llevará a cabo durante el período experimental 
comprende las siguientes actividades: 
 
1) Construcción de Curvas de peso: representan la variación del Peso (g) en función del Tiempo 
(días). Para ello, los animales son pesados 1 vez por semana. Con los datos obtenidos, se deberán 
confeccionar las curvas de peso para ambos lotes. 
 
2) Cálculo de la Comida Efectiva (CE): representa la comida que efectivamente es ingerida por 
los animales y debe ser expresada en base seca (es decir sin el contenido de agua). Para calcularla, 
se procede de la siguiente manera: 
 
DÍA 1: 
 Pesar las ratas y obtener el peso promedio de cada lote. 
 Ofrecer una determinada cantidad de comida en un recipiente tarado (CO). 
 Llevar a estufa a 60 °C hasta peso constante (aproximadamente una semana), una alícuota 
(A) de alrededor de 10 g de la misma comida, a fin de conocer el porcentaje de humedad y 
poder expresar la CO en base seca de la siguiente manera: 
 
A g comida húmeda (AH)  A g comida seca (AS) 
CO g comida húmeda (COH)  CO g comida seca (COS) 
 
De esta manera, al cabo de una semana podrá calcularse: 
HHH
H
S
S COfCO
A
A
CO  
donde fH es el factor de humedad de la dieta. 
 
DÍA 2: 
 Retirar la comida remanente en el recipiente, pesar y expresar en base seca (R1), utilizando 
el mismo fH calculado anteriormente. 
 Recolectar la comida desperdiciada, separándola de la materia fecal; colocar en un recipiente 
previamente tarado, llevar a estufa a 60 °C hasta peso constante y pesar. Este valor 
corresponde al remanente seco (R2). 
 
La CE ingerida por el lote será: 
 
SS RCOCE  
Donde 21 RRRS  
Para conocer la cantidad ingerida por un animal se tiene en cuenta el número de ratas de cada 
lote (CE expresada en gr/rata/día). La CE expresada en kJ/rata/día se denomina ingesta calórica. 
 
 
 
TOMA DE MUESTRA 
Finalizado el período experimental, se pesa y se anestesia la rata con una solución 10mg/mL 
de pentobarbital sódico (dosis: 60 mg/kg de peso corporal). Se extrae sangre de la vena cava 
inferior, se separa el suero y se conserva a -20 °C hasta el momento de las determinaciones. 
 
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Se extraen trozos de lóbulos distintos del hígado, congelándolos inmediatamente con una 
pinza Wollemberger enfriada a la temperatura de la nieve carbónica. Se extrae el resto del hígado 
y se pesa, sumándole el peso del trozo congelado para obtener el peso total del hígado. Se muele 
el tejido con nieve carbónica en un mortero previamente enfriado y se conserva a -80 °C hasta 
su utilización. Se extraen también los tejidos adiposos epididimal, retroperitoneal y mesentérico. 
Se registra el peso de cada uno con el fin de calcular el Índice de adiposidad visceral según la 
siguiente fórmula: 
 
Cálculo del Índice de Adiposidad Visceral 
El índice de adiposidad visceral (IAV) se define como la relación entre el peso de los tejidos 
adiposos viscerales respecto del peso corporal total, y se calcula como: 
 
100
)(
)()()(dim



gtotalcorporalPeso
gPesogPesogPeso
IAV
omesentériconealretroperitalepidi
 
 
 
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS DE TEJIDO 
Con el tejido hepático obtenido de cada rata se preparan homogeneizados en el momento del 
análisis de cada parámetro. Trabajando entre 0 y 4 °C se pesa rápidamente una alícuota del tejido 
triturado (mT) en un tubo de homogeneizado frío y tarado. Se agrega una cantidad de agua 
destilada fría (vagua) en función de la dilución que se desee efectuar a la muestra. Por convención 
se considera que el Peso Específico del tejido es igual al del agua, es decir, 1 g de tejido es igual 
a 1 mL de tejido. De esta manera, el factor de dilución fD para cualquier muestra de tejido es: 
 
aguaT
T
D
vm
m
f

 
 
La mezcla de tejido y agua se homogeneiza en homogeneizador. A partir de los homogenatos 
obtenidos, se toma el volumen requerido para las determinaciones o para efectuar una dilución 
mayor en aquellos procedimientos que lo requieran. 
 
 
DETERMINACIONES 
 
A partir de las diferentes muestras de sangre y tejidos que se obtienen de las ratas alimentadas 
con DC y DRS, se procederá a realizar un conjunto de determinaciones durante todo el desarrollo 
de la asignatura. Estas pruebas permitirán estimar parámetros bioquímicos-metabólicos, con el 
objetivo final de evaluar los cambios metabólicos inducidos por la DRS en un modelo animal. El 
conjunto de técnicas empleadas en el presente trabajo práctico incluye: 
 
 
 
 
 
 
 
 
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A. Pruebas 
relacionadas con el 
metabolismo de 
hidratos de carbono 
Basales 
 Glucosa en suero 
 Glucógeno en tejido hepático 
Dinámicas (in vivo) 
 Test de tolerancia endovenoso a la glucosa 
 Test de tolerancia endovenoso a la insulina 
B. Pruebas 
relacionadas con el 
metabolismo de 
lípidos 
Basales 
 Triglicéridos en suero 
 Triglicéridos en tejido hepático 
Dinámicas (in vivo) 
 Velocidad de secreción de VLDL-TG 
 Test de tolerancia grasa endovenoso 
C. Pruebas 
relacionadas con el 
metabolismo 
 
Basales 
 Determinación de la actividad de la enzima 
Glucosa-6-P Deshidrogenasa 
 Dosaje de proteínas 
 Determinación de los niveles de masa proteica del 
receptor activado por proliferadores 
peroxisomales– PPARα – en tejido hepático 
 
ANÁLISIS DE DATOS 
Los resultados obtenidos a partir de cada uno de los parámetros analizados, se procesarán de 
la misma manera. 
En cada caso, se deberá expresar el resultado final para cada lote (DC y DRS) como: 
 
SEMx  
 
donde x es el promedio de n réplicas, que se calcula como 



n
i
in
x
x
1
 
 
y SEM es el Error Estándar de la Media, que es igual a 
n
SSEM  
 
Donde la Desviación Standard S se calcula según la expresión 
1
)( 2




n
xx
S
i
 
 
 
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Para comparar los resultados de los parámetros estudiados entre el lote DRS respecto del lote 
DC, se utilizará el Prueba t de Student (t -Test). El parámetro t de Student se calcula mediante la 
expresión: 
 
 
2
2
2
1
21
SEMSEM
xx
t


 
 
 
Este parámetro debe correlacionarse con los grados de libertad en la Tabla de Distribución “t” 
de dos colas para obtener así los niveles de probabilidad P. En todos los casos, los grados de 
libertad para n réplicas, se calculan como n1  n2 – 2. 
A partir de los valores de p se podrá señalar lo siguiente: 
Si P > 0.05  no existe diferencia significativa 
Si P < 0.05  sí existe diferencia significativa 
 
 
 
BIBLIOGRAFÍA 
 Chicco, A.; Bernal, C.; Soria, A.; Giangrossi, G.; Lombardo, Y. B. (1999). “Dietary Effects of 
Partial or Total Substitution of Sucrose for Starch on Glucose and Lipid Metabolism in 
Dyslipidemic Rats”. Nutrition Research 19: 281- 293 
 
 Rossi, A.S.; Oliva, M.E.; Ferreira, M.R.; Chicco A.; Lombardo Y.B. (2012). “Dietary chia seed 
induced changes in hepatic transcription factors and their target lipogenic and oxidative 
enzyme activities in dyslipidaemic insulin-resistant rats”. Br J Nutr 5: 1-11. 
 
 Reeves, P.; Nielsen, F.; Fahey, G. (1993). “AIN-93 Purified diets for laboratory rodents: final 
report of the American Institute of Nutrition” pp: 1939-1951. 
 
 Novelli, E.L.; Diniz, Y.S.; Galhardi, C.M.; Ebaid, G.M.; Rodrigues, H.G.; Mani, F.; Fernandes, 
A.A.; Cicogna, A.C. and Novelli Filho J.L. (2007). “Anthropometrical parameters and markers 
of obesity in rats.” Lab. Anim. 41:111-119. 
 
 Glantz, S.A. (2005).” Bioestadística”. 6ta Edición. McGraw-Hill Medical Pub. Division, New 
York 
 
 
 
 
 
 
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Rossi%20AS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22947172
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Oliva%20ME%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22947172
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ferreira%20MR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22947172
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Chicco%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22947172
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Lombardo%20YB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22947172
 
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A. PRUEBAS RELACIONADAS CON EL METABOLISMO DE HIDRATOS DE CARBONO 
 
Contenidos teóricos mínimos necesarios para la realización y aprobación de esta sección: 
 Glucosa y Glucógeno: estructuras, propiedades químicas y funciones generales. 
Generalidades acerca de su síntesis y degradación in vivo. (Glucólisis, neoglucogénesis, 
glucogenólisis, glucogenogénesis). 
 Insulina: función principal. 
 
GLUCOSA EN SUERO 
 
OBJETIVO 
Determinar la concentración de glucosa en suero (glucemia) de ratas en estado alimentado 
por el método enzimático colorimétrico de punto final Glucosa Oxidasa/Peroxidasa (GOD/POD). 
 
INTRODUCCIÓN 
La glucosa es un alcohol polihidroxilado con una función aldehído. Es el monosacárido más 
importante ya que cumple funciones estructurales y metabólicas. Se obtiene a través de la 
alimentación como tal y/o como resultado de la degradación de oligosacáridos y polisacáridos. 
El organismo también la sintetiza a partir de precursores (neoglucogénesis). 
Se almacena principalmente en el hígado como glucógeno. Este órgano, junto con diversas 
hormonas tiene un papel primordial en el mantenimiento de los niveles de glucosa en sangre 
(glucemia) para contribuir a la homeostasis. 
 
FUNDAMENTO 
La glucosa es determinada por oxidación aerobia en una reacción catalizada por la enzima 
glucosa oxidasa (GOD). Como producto de esta reacción se forma ácido glucónico y se genera 
estequiométricamente peróxido de hidrógeno (H2O2). 
 
 
 
 
 
 + O2 + H2O + + H2O2 
 
 
 
 D-glucosa Ácido glucónico 
 
La GOD presenta marcada especificidad por la D-glucosa y se la emplea para la determinación 
cuantitativa de la misma. El H2O2 generado en la reacción puede medirse cuantitativamente 
utilizando peroxidasa (POD) más un sustrato cromogénico adecuado. En presencia de POD, 4-
aminofenazona (4-AF) y fenol, el H2O2 forma una quinoneimina, de color rojo, con un pico de 
absorción a 505 nm. La intensidad de color es proporcional a la concentración de glucosa de la 
muestra. 
 
 
 GOD 
CHO
H C OH
OH C H
H C OH
H C OH
CH2OH
COOH
H C OH
OH C H
H C OH
H C OH
CH2OH
 
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La reacción catalizada por la enzima POD es la siguiente: 
 
 2 H2O2 + 4-AF + fenol Quinoneimina + 4 H2O 
 
Alternativamente, el H2O2 producido en la primera reacción puede ser medido mediante 
métodos electroquímicos ó midiendo el consumo de O2 de la reacción utilizando un eléctrodo 
para oxígeno disuelto. 
 
REACTIVOS* 
a) Standard: Solución de glucosa 1 g/L. 
b) Enzimas GOD/POD: Solución de glucosa oxidasa (1.000 U/mL) y peroxidasa (120 U/mL). 
c) Reactivo 4-AF: Solución de 4-aminofenazona 25 mmol/L en Buffer Tris 0,92 mol/L pH: 7. 
d) Reactivo fenol: Solución de fenol 55 mmol/L. 
 
* Las concentraciones de reactivos y la composición de los buffers pueden variar según la marca 
y/o lote del kit comercial utilizado. 
 
Preparación del reactivo de trabajo 
− De acuerdo al volumen de trabajo, colocar en una probeta de capacidad adecuada, alrededor 
de las ¾ partes de agua destilada del volumen final a preparar. 
− Agregar la cantidad correspondiente de Reactivo 4-AF, y de Reactivo de Fenol. 
− Llevar a volumen final con agua destilada. 
− Agregar la cantidad correspondiente de GOD/POD previamente homogeneizadas. Mezclar 
por inversión sin agitar. 
− Conservar en refrigerador (2-10 C) y en frasco color caramelo. La estabilidad del reactivo es 
de un mes a partir de la fecha de su preparación. 
 
Proporciones de los reactivos, para 100 mL de volumen final: 
− Reactivo 4-AF: 5 mL 
− Reactivo Fenol: 5 mL 
− Enzimas: 300 μL 
 
Tener en cuenta: las proporciones de los reactivos pueden variar según la marca y/o lote del kit 
que se utilice. Para ello, previamente consultar el protocolo del mismo. 
 
MUESTRAS 
 
Suero de ratas alimentadas con DC y DRS. 
Interferencias: hemólisis visible. 
 
 
TÉCNICA OPERATORIA 
 
Tener en cuenta: todas las muestras deben estar perfectamente descongeladas y 
homogeneizadas antes de su utilización. 
 
 
POD 
 
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1- Preparar tubos con las inscripciones “B” (Blanco), “S” (Standard) y “M” (Muestra) y agregar: 
 
 B S M 
Muestra - - 10 l 
Standard - 10 l - 
Reactivo de trabajo 1 mL 1 mL 1 mL 
 
2- Mezclar e incubar 10 minutos en baño de agua a 37 C. 
3- Leer en espectrofotómetro a 505 nm. El color de reacción final es estable 1 hora. 
La reacción colorimétrica sigue la ley de Beer hasta una concentración de 4,5 g/L de glucosa. 
 
 
CÁLCULOS 
Para calcular la concentración de glucosa en cada muestra, se aplicará el “Método de un 
Standard”. Para ello, el factor unitario que relaciona concentración con unidades de absorbancia 
se calcula como: 
 
BS
S
AA
C
f

 
 
Donde CS corresponde a la concentración del Standard, AS es la absorbancia del Standard y AB es 
la absorbancia del blanco. 
Una vez obtenido el factor y a partir de la absorbancia de la muestra (AM), la concentración de 
glucosa incógnita (CM) se calcula entonces como: 
 
  )(/BMM AAfLgC  
 
RESULTADOS 
Expresar en g/L y en mM. 
Dato: PM glucosa = 180 g/mol 
 
VALOR DE REFERENCIA 
Ratas machos Wistar alimentadas con DC = 6 – 7 mM 
 
 
BIBLIOGRAFÍA 
 
 Trinder, P. (1969). ”Determination of Glucose in Blood using Glucose Oxidase with an 
alternative oxygen acceptor”. Ann. Clin. Biochem. 6: 24-27. 
 
 Tietz, N.W. (1985).”Guía Clínica de Pruebas de Laboratorio”. Editorial Panamericana. 
 
 Pesce, A. and Kaplan, L. (1990). “Química Clínica”. Métodos. Editorial Panamericana. 
 
 
 
 
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TEST DE TOLERANCIA ENDOVENOSO A LA GLUCOSA 
 
OBJETIVO 
Determinar la velocidad de desaparición de la glucosa plasmática (Kg) luego de una sobrecarga 
endovenosa de glucosa, en ratas ayunadas. 
 
FUNDAMENTO 
La concentración de glucosa plasmática es un parámetro altamente regulado. La 
administración de una sobrecarga de glucosa es una herramienta utilizada para evaluar los 
mecanismos involucrados en la homeostasis de la misma; además, es útil para evaluar la 
utilización de glucosa periférica global. 
La Tolerancia a la Glucosa (desaparición de la glucosa plasmática) depende principalmente de 
dos procesos: uno mediado por la insulina y otro independiente de la hormona. En condiciones 
fisiológicas, la desaparición de la glucosa plasmática está mediada principalmente por la acción 
de la insulina. Sin embargo, en condiciones experimentales como la propuesta, donde las 
concentraciones de glucosa plasmáticas exceden por mucho las concentraciones habituales 
(concentraciones suprafisiológicas), la situación es diferente. En este caso, un mecanismo 
distinto al de la insulina es el mayor responsable de la disponibilidad de la glucosa. Esto se conoce 
comúnmente como efecto de la glucosa per se. (Mac Arthur y col, 1999; Paccini y col, 2001). 
Luego de una administración endovenosa, la variación de los niveles de glucosa plasmática (G) 
en función del tiempo (t) se caracteriza por un aumento inicial muy rápido. El valor de glucemia 
alcanza un pico máximo durante los primeros minutos posteriores a la inyección, luego del cual, 
ocurre una fase de decrecimiento que sigue una cinética de primer orden. A continuación se 
muestra una representación gráfica de este proceso en forma genérica. 
 
 
 
La fase de decrecimiento exponencial de la curva puede modelarse de la siguiente manera: 
Considerando que luego de alcanzado el pico, la variación de la glucemia en función del tiempo 
decrece exponencialmente, siguiendo una cinética de primer orden: 
 
GK
dt
dG
g (1) 
 
t (min) 
G (mM) 
Gmáx 
G(t) 
Glucemia basal 
(ayuno) 
 
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Resolviendo esta ecuación (1), se obtiene que la variación de G en función de t durante la fase 
de decrecimiento exponencial está representada por: 
 
 
tK
máx
geGtG

)( (2) 
 
donde )(tG es la concentración de glucosa a tiempo t ; máxG corresponde al pico de glucemia 
que se alcanza a los pocos minutos de administrar la solución de glucosa y gK es la constante 
de desaparición de la glucosa, cuyo valor permite evaluar la tolerancia del animal a la sobrecarga 
endovenosa. 
Aplicando logaritmo natural a la ecuación (2) se obtiene: 
 
tKGtG gmáx  ln)(ln 
 
De esta manera, se puede calcular Kg como la pendiente de la gráfica ln G vs. t. 
 
ANIMALES Y MATERIAL NECESARIO 
- Ratas macho Wistar de los distintos lotes experimentales, ayunadas 12-16 hs. 
- Anestesia: Pentobarbital sódico 60 mg/kg de peso corporal (solución 20 mg/ml). 
- Material de cirugía. 
- Tabla de disección. 
- Cánulas, agujas y jeringas heparinizadas. 
- Solución fisiológica: 9 g NaCl en 1000 mL de agua destilada. 
- Solución de glucosa: 0,5 g de glucosa/Kg de peso corporal (solución 25g/100ml). 
 
Calcular la cantidad a inyectar (en mL) de anestesia y de solución de glucosa, según el peso del 
animal. 
 
MUESTRAS 
Plasma de rata extraído a distintos tiempos. 
 
PROTOCOLO EXPERIMENTAL 
1- Los animales tendrán un ayuno de 12 a 16 hs. Durante toda la prueba se debe mantener al 
animal en un ambiente con una temperatura estable. 
2- Anestesiar intraperitonealmente los animales con la solución de pentobarbital sódico 
calculada según la dosis y el peso del animal. 
3- Canular ambas venas yugulares y extraer de una de una de ellas una alícuota de sangre (0,2-
0,3mL) correspondiente a la muestra basal con jeringa heparinizada. 
4- Administrar lentamente por la misma vena yugular la solución de glucosa calculada según la 
dosis y el peso del animal. 
5- Extraer muestras de sangre de la vena yugular opuesta a los 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50 y 60 
minutos posteriores a la inyección de glucosa, enjuagando las jeringas con solución fisiológica 
heparinizada. Luego de cada extracción, se reemplaza el volumen de sangre extraído por 
solución salina isotónica para mantener el volumen de sangre (volemia) del animal 
aproximadamente constante. 
 
 
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6- Recoger las muestras de sangre sobre hielo en tubos de microcentrífuga. El plasma obtenido 
por centrifugación se almacena a –20 C hasta su utilización. 
7- Dosar el contenido de glucosa en cada una de las muestras de plasma obtenidas mediante el 
método enzimático colorimétrico de punto final GOD/POD. 
 
RESULTADOS 
 Graficar la concentración de glucosa en función del tiempo. 
 Graficar ln G vs tiempo. 
 Calcular la constante de desaparición de la glucosa Kg (10-2 min-1). 
 
VALOR DE REFERENCIA 
Ratas machos Wistar alimentadas con dieta control, Kg = (2,61 ± 0,14) x 10-2 min-1. 
 
 
BIBLIOGRAFÍA 
 
 Paccini, G.; Thomaseth, K. and Ahrén, B. (2001). “Contribution to glucose tolerance of insulin-
independent vs insulin-dependent mechanisms in mice”. Am J Physiol Endocrinol Metab. 281: 
E693-E703. 
 
 Mc Arthur, M.D.; You, D.; Klapstein, K. and Finegood, D.T. (1999). “Glucose effectiveness is the 
major determinant of intravenous glucose tolerance in the rat”. Am J Physiol Endocrinol 
Metab. 276: E739-E746. 
 
 Frangioudakis, G.; Gyte, A.C.; Loxham, S.J.G. and Poucher, S.M. (2008). “The intravenous 
glucose tolerance test in cannulated Wistar rats: a robust method for the in vivo assessment 
of glucose-stimulated insulin secretion”. J Pharmacol Toxicol Methods, 57: 106-113. 
 
 Vranic, M.; Fono, P.; Kovacevic, N and Lin, B.J. “Glucose kinetics and fatty acids in dogs on 
matched insulin infusion after glucose load”. Metabolism 20: 954–967, 1971. 
 
 Ferreira, M.R.; Camberos, M.C.; Selenscig, D.; Martucci, L. de; Chicco, A.; Lombardo, Y. and 
Cresto, J. C. (2013). “Changes in hepatic lipogenic and oxidative enzymes and glucose 
homeostasis induced by an acetyl-L-carnitine and nicotinamide treatment in dyslipidaemic 
insulin-resistant rats”. Clin Exp Pharmacol Physiol. 40: 205-211. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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TRABAJO PRACTICO: TEST DE TOLERANCIA ENDOVENOSA A LA INSULINA 
 
OBJETIVO: Determinar la velocidad de desaparición de la glucosa plasmática (KITT) luego de una 
sobrecarga endovenosa de insulina en ratas ayunadas. 
 
FUNDAMENTO: 
 La resistencia a la insulina -también conocida como resistencia insulínica- es una 
alteración genética o adquirida de la respuesta tisular a la acción de la insulina. En términos 
fisiológicos se refiere a una inadecuada captación de la glucosa dependiente de insulina por parte 
de los tejidos, en especial, músculo y tejido adiposo. 
 La prueba clamp euglucémica-hiperinsulinémica (Glucose clamp technique), es 
considerada la técnica “estándar de oro” para medir la acción de la insulina in vivo principalmenteporque provee información acerca de la cantidad de glucosa metabolizada por los tejidos 
periféricos durante la estimulación con insulina. Presenta la desventaja de ser una técnica 
laboriosa e invasiva que requiere instrumental sofisticado y adiestramiento especial, por este 
motivo, han surgido métodos alternativos que permiten estimar la resistencia insulínica, entre 
ellos se encuentran: el índice HOMA-IR (homeostasis model assessment), el QUICKI (quantitative 
insulin sensitivity check index), el Test de tolerancia oral a la glucosa y el Test de tolerancia a la 
insulina. 
El Test de tolerancia a la insulina es un método simple para estimar la resistencia 
insulínica, se caracteriza por medir primariamente la utilización de la glucosa por los tejidos 
frente al estímulo de la insulina, es decir la acción insulínica periférica global. Dentro de las 
ventajas de la prueba se destaca su corta duración por lo que hay pocas probabilidades de que 
intervengan las hormonas contrarreguladoras que puedan interferir con los resultados, y además 
sus resultados ofrecen una correlación aceptable con los resultados de la clamp euglucémica-
hiperinsulinémica (método estándar). Con respecto a las desventajas, es una técnica invasiva que 
necesita de extracciones, tiene el riesgo de ocasionar hipoglucemia (aunque es baja debido a que 
en la actualidad se utilizan bajas dosis de insulina). 
El test consiste en la infusión de una dosis de insulina para medir el descenso de la 
glucemia obteniendo una constante denominada KITT (constante de desaparición de la glucosa). 
El grado de descenso de la glucosa tras la infusión de insulina es indicativo de la acción insulínica 
periférica global. La variación de los niveles de glucosa en función del tiempo sigue una cinética 
de primer orden. Así, la variación de glucosa en función del tiempo puede ser representada por 
la ecuación de la curva: 
dG = -KITT. G 
 dt 
 
donde (G) representa la glucemia y (t) el tiempo. Resolviendo esta ecuación se obtiene que la 
glucemia para un tiempo t estaría representada por la ecuación: 
 
C(t) = C0. e –KITT.t 
C(t) concentración de glucosa a tiempo t 
C0 concentración de glucosa a tiempo 0 
KITT constante de desaparición de la glucosa 
t tiempo considerado 
 
 
http://es.wikipedia.org/wiki/Insulina
http://es.wikipedia.org/wiki/Glucosa
 
 14 
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Año 2018 
 
Aplicando logaritmo natural la ecuación se transforma en: 
 
ln C(t) = ln C0 – KITT. t 
 
de esta manera se puede calcular el KITT como la pendiente de la gráfica ln Glucosa vs 
tiempo. 
ANIMALES Y MATERIALES NECESARIOS: 
- Ratas macho Wistar de los distintos lotes experimentales ayunadas 5 - 6 hs 
- Anestesia (Pentobarbital sódico: 60 mg/kg de peso corporal) 
- Material de cirugía 
- Tabla de disección 
- Cánulas, agujas y jeringas heparinizadas 
- Solución fisiológica: 0.9g NaCl en 100 ml de agua destilada 
- Solución de insulina: 0,75 U/kg peso corporal (Humulin R). Calcular la cantidad a 
inyectar según el peso del animal 
 
MUESTRAS: 
 Plasma de rata extraídos a distintos tiempos 
 
PROTOCOLO EXPERIMENTAL 
1- Los animales tendrán un ayuno de 5 a 6 hs. Durante toda la prueba se debe mantener al animal 
en un ambiente con una temperatura estable. 
2- Anestesiar intraperitonealmente los animales con la solución de pentobarbital sódico 
calculada según la dosis recomendada y el peso del animal. 
3- Canular la vena yugular y extraer de una de ellas una alícuota de sangre (0.2-0.3 ml) 
correspondiente a la muestra basal (tiempo=0) con jeringa heparinizada. 
4- Administrar la solución de insulina (0,75 U/kg peso corporal) por inyección intraperitoneal. 
5- Extraer muestras de sangre de la vena yugular a los 15, 30, 45 y 60 minutos posteriores a la 
inyección de insulina, enjuagando las jeringas con solución fisiológica heparinizada. Luego de 
cada extracción, se reemplaza el volumen de sangre extraído por solución salina isotónica para 
mantener la volemia del animal. 
6- Recoger las muestras de sangre sobre hielo en tubos de microcentrífuga conteniendo heparina 
(10 U/tubo) como anticoagulante. El plasma obtenido por centrifugación se almacena a –20 ºC 
hasta su utilización. 
7- Dosar el contenido de glucosa en cada una de las muestras de plasma obtenidas mediante el 
método enzimático de la glucosa oxidasa/peroxidada. 
 
 
RESULTADOS 
- Graficar la concentración de glucosa en función del tiempo. 
- Graficar ln Glucosa vs tiempo. 
- Calcular la constante de desaparición de la glucosa KITT (10-2 min-1) 
 
 
 
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VALORES DE REFERENCIA: 
KITT (ratas dieta control): 2,31 ± 0,03 10-2 min -1 
 
BIBLIOGRAFÍA 
 
 Perez Maraver, M., Montanya Mias, E. (2001) “Técnicas para el estudio de la resistencia 
insulínica. Una valoración crítica”. Av. Diabelol. 17: 179-186. 
 Ayala, J.E., Samuel, V.T., Morton, G.J., Obici, S. et. al. (2010) “Standard operating 
procederes for describing and perfoming metabolic test of glucose homeostasis in mice.” 
Disease Model & Mechanisms 3: 525-534. 
 McGuinness, O.P, Ayala, J.E., Laughlin, M.R. and Wasserman, D.H. (2009). “NIH 
experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and 
recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse”. Am. J. Physiol. 
Endocrinol Metab. 297: E849-E855. 
 D’Alessandro M.E., Oliva, M.E., Ferreira Cordoneda, M.R., Selencsig, D., Lombardo, Y.B. 
and Chicco, A. (2012). “Sucrose-rich feeding during rat pregnancy-lactation and/or alter 
weaning alters glucose and lipid metabolism in adult offspring”. Clinical and Experimental 
Pharmacology and Physiology. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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GLUCOGENO EN TEJIDO HEPATICO 
 
OBJETIVO 
Determinar el contenido de glucógeno en tejido hepático de ratas alimentadas por el método 
de hidrólisis ácida de Passonneau y Lauderdale. 
 
INTRODUCCIÓN 
El glucógeno es un polisacárido ramificado compuesto enteramente de -D-glucosa. La 
mayoría de las unidades de glucosa están unidas por enlaces -1,4 glucosídicos y las 
ramificaciones se forman por enlaces -1,6 glucosídicos. Es la forma principal de 
almacenamiento de hidratos de carbono, presentando la característica de ser fácilmente 
movilizable. 
Se encuentra en mayor proporción en el hígado (hasta 6 g/100 g) y su función en este tejido 
es regular la glucemia para asegurar la provisión constante de glucosa a los distintos tejidos, 
contribuyendo así a mantener su homeostasis. Por otra parte, el glucógeno del tejido muscular 
(1 g/100 g) provee el combustible (glucosa) para la contracción. Debido a su masa mayor, el 
músculo almacena 3 a 4 veces la cantidad de glucógeno que tiene el hígado como reserva. 
Existen distintos métodos para cuantificar glucógeno. En esta guía describiremos uno de ellos. 
 
FUNDAMENTO 
La extracción de glucógeno en tejidos se puede realizar mediante hidrólisis ácida y en caliente, 
la cual libera unidades de glucosa. La solución resultante se neutraliza y se centrífuga. La 
neutralización es necesaria para evitar la inactivación de las enzimas que se utilizarán 
posteriormente. En el sobrenadante obtenido se cuantifican espectrofotométricamente las 
unidades de glucosa liberadas, utilizando un método enzimático. 
 
REACTIVOS 
a) HCL 2M. 
b) NaOH 2M. 
c) Cinta indicadora de pH. 
d) Kit comercial para cuantificar glucosa por el método enzimático GOD/POD. 
 
MUESTRAS 
Tejido hepático de ratas alimentadas con DC y DRS. 
 
TÉCNICA OPERATORIA 
1- Pesar entre 150 y 200 mg de tejido hepático en tubo para homogeneizar. 
2- Adicionar 3,5 mL de HCl 2M. 
3- Homogeneizar. 
4- Llevar a tubos Falcon tapados en una gradilla a estufa 85-90 C durante1 hora. 
5- Enfriar en baño de hielo. 
6- Neutralizar con 3,2 mL de NaOH 2M y controlar con cinta indicadora de pH; agregar más 
volumen si fuera necesario. Registrar el volumen total utilizado (VT). 
7- Centrifugar a 7500 rpm durante 5 minutos. 
8- El sobrenadante se utiliza para la cuantificación de glucosa por el método enzimático 
GOD/POD. 
 
 
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CUANTIFICACIÓN DE GLUCOSA 
1- Preparar tubos con las inscripciones “B” (Blanco), “S” (Standard) y “M” (Muestra) y agregar: 
 
 B S M 
Muestra - - 10 l 
Standard - 10 l - 
Reactivo de trabajo 1 mL 1 mL 1 mL 
 
2- Mezclar e incubar 10 minutos en baño de agua a 37 C. 
3- Leer en espectrofotómetro a 505 nm. El color de reacción final es estable 1 hora. 
 
La reacción colorimétrica sigue la ley de Beer hasta una concentración de 4,5 g/L de glucosa. 
 
CÁLCULOS 
1- Calcular la concentración de glucosa en mol/ml. 
2- Calcular la concentración de glucosa-glucógeno por gramo de tejido húmedo (TH) de acuerdo 
a la siguiente expresión: 
 
1
cos )/()/cos(
 DmlmolCgTHglucógenoaglumolC agluM  
 
Donde: 
TV tejidode g
 tejidode g

D 
 
 
RESULTADOS 
Expresar en: 
 mol glucosa-glucógeno / g TH 
 mol glucosa-glucógeno / órgano total 
 
VALOR DE REFERENCIA 
Ratas machos Wistar alimentadas con DC = 220  20 mol glucosa-glucógeno / g TH. 
 
 
BIBLIOGRAFÍA 
 Passonneau, J. and Lauderdale, V. (1974). “A comparison of three methods of glycogen 
measurement in tissues”. Anal. Biochem. 60: 405-412. 
 
 Gustavo J. Hein, G.J.; Chicco, A. and Lombardo, Y.B. (2012). “Fish oil normalizes plasma 
glucose levels and improves liver carbohydrate metabolism in rats fed a sucrose-rich diet”. 
Lipids 47:141–150 
 
 
 
 
 
 
 
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B. PRUEBAS RELACIONADAS CON EL METABOLISMO DE LÍPIDOS 
 
Contenidos teóricos mínimos necesarios para la realización y aprobación de esta sección: 
 Principales lípidos estudiados: Triglicéridos, Fosfolípidos, Colesterol. Estructura. 
Propiedades químicas. Funciones generales. 
 Transporte de lípidos en el organismo: Lipoproteínas. Estructura general básica, principal 
lípido que transporta cada una y su origen. 
 Enzima Lipoproteína Lipasa (LPL), ubicación y función. 
 Conceptos generales de lipogénesis y lipólisis. 
 
 
TRIGLICÉRIDOS EN SUERO 
 
OBJETIVO 
 Determinar la concentración de triglicéridos (TG) en suero de ratas alimentadas por el método 
enzimático colorimétrico de punto final. 
 
INTRODUCCIÓN 
Químicamente, los TG son lípidos simples, no polares, insolubles en agua y solubles en 
solventes orgánicos. Son ésteres formados por alcohol trihidroxilado llamado glicerol y tres 
ácidos grasos saturados y/o insaturados. 
Los aceites vegetales y las grasas animales que consumimos en los alimentos están 
compuestos casi totalmente por TG; estos constituyen la forma molecular principal de reserva 
calórica en animales y semillas, cada gramo de grasa genera energía equivalente a 9 kcal 
(rendimiento de la oxidación completa). 
Desde un enfoque metabólico-nutricional, los TG plasmáticos pueden clasificarse según su 
origen: Exógenos: los que se obtienen de la dieta o Endógenos: aquellos que son producidos por 
síntesis y secreción hepática. Los exógenos, luego de ser degradados, se absorben en el intestino 
y se unen, en la célula de la mucosa intestinal, a proteínas, fosfolípidos y colesterol formando 
macromoléculas llamadas Quilomicrones, que por vía linfática llegan a la circulación y distribuyen 
TG a los tejidos. Los TG endógenos también se unen a proteínas, fosfolípidos y colesterol 
formando un complejo macromolecular llamado lipoproteína de muy baja densidad (VLDL por su 
sigla en inglés) y de esta forma son exportados por el hígado a la circulación donde también 
distribuyen TG a los tejidos. 
 
FUNDAMENTO 
El método se basa en la determinación del glicerol contenido en las moléculas de TG tras la 
hidrólisis enzimática, reacción catalizada por la enzima Lipasa. Luego de la hidrolisis de los TG, el 
glicerol generado en presencia de ATP es fosforilado por la enzima glicerol quinasa, generando 
glicerol-1P el cual es oxidado dando como producto H2O2. El H2O2 en presencia de peroxidasa, 4 
aminofenazona (4-AF) y clorofenol, forma una quinoneimina de color rojo, con un pico de 
absorción a 505 nm. 
El desarrollo de enzimas para catalizar la hidrólisis de los TG ha posibilitado el empleo de 
métodos totalmente enzimáticos. Estos métodos tienen la ventaja de ser rápidos, específicos y 
eliminan el uso de reactivos cáusticos, extracción con solventes, baño de altas temperaturas y 
mezclas de adsorción para la remoción de fosfolípidos. 
 
 
 
 19 
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La determinación enzimática por este método se basa en las siguientes reacciones: 
 
 Lipoproteina lipasa 
Triglicéridos Glicerol + Ácidos Grasos 
 Glicerol quinasa 
Glicerol + ATP Glicerol-1-P + ADP 
 
 
 
Glicerol fosfato oxidasa 
 
Glicerol-1-P + O2 Dihidroxiacetona-P + H2O2 
 Peroxidasa 
 2 H2O2 + 4–AF + clorofenol Quinoneimina + 4 H2O 
 
 
REACTIVOS 
a) Standard: solución de 2 g/L de glicerol. 
b) Buffer: solución de Buffer Goods conteniendo clorofenol, pH 7,5. 
c) Enzimas: viales conteniendo lipoproteína lipasa, glicerol quinasa, glicerol fosfato oxidasa 
(GOD), peroxidasa (POD), adenosina trifosfato (ATP) y 4-aminofenazona (4-AF). 
 
Preparación del reactivo de trabajo 
Disolver el contenido de un envase de reactivo “Enzimas”, en un envase conteniendo el 
reactivo “Buffer”. Mezclar suavemente hasta disolución completa. Homogeneizar y fechar. 
Mantener en heladera (2-10°C). 
 
Tener en cuenta: la preparación del reactivo de trabajo puede variar según la marca y/o lote del 
kit que se utilice. Para ello, previamente consultar el protocolo del mismo. 
 
MUESTRAS 
Suero de ratas alimentadas con DC y DRS. 
Interferencias: hemólisis intensa o sueros marcadamente ictéricos. 
 
TÉCNICA OPERATORIA 
Tener en cuenta: todas las muestras deben estar perfectamente descongeladas y 
homogeneizadas antes de su utilización (especialmente en los sueros lechosos). 
1- Preparar tubos con las inscripciones “B” (Blanco), “S” (Standard) y “M” (Muestra) y agregar: 
 
 B S M 
Muestra - - 10 l 
Standard - 10 l - 
Reactivo de trabajo 1 mL 1 mL 1 mL 
 
 20 
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2- Mezclar, incubar 5 minutos a 37 C y retirar del baño. 
3- Enfriar y leer en espectrofotómetro a 505 nm. El color de la reacción es estable 1 hora. 
 
El método sigue la Ley de Beer hasta una concentración de 10 g/L de TG. 
 
CÁLCULOS 
Para calcular la concentración de TG en cada muestra, se aplicará el “Método de un Standard”. 
Para ello, el factor unitario que relaciona concentración con unidades de absorbancia se calcula 
como: 
 
 
BS
S
AA
C
f

 
donde CS corresponde a la concentración del Standard, AS es la lectura del Standard y AB es la 
lectura del blanco. 
 
Una vez obtenido el factor y a partir de la lectura de la muestra (AM), la concentración de TG 
incógnita (CM) se calcula entonces como: 
 
  )(/ BMM AAfLgC  
RESULTADOS 
Expresar en mg/100ml y en mM 
Dato: PM trioleína = 885,41 g/mol 
 
 
VALOR DE REFERENCIA 
Ratas machos Wistar alimentadas con DC = 0,80 – 1,30 mM. 
 
 
BIBLIOGRAFÍA 
 Fossati, P. and Prencipe, L. (1982). “Serum triglycerides determined colorimetrically with an 
enzyme that produces Hydrogen peroxide”. Clin. Chem. 28/10, 2077-2080. 
 
 McGowan, M.W.; Artiss, J.D.; Strandbergh, D.R. and Zak, B. (1983). “A peroxidase-coupled 
method for the colorimetric determination of serum triglycerides”. Clin. Chem. 29/3, 538-542. 
 
 Burtis, C.A. and Bruns, D.E. (2015) “Tietz Fundamentals of ClinicalChemistry and Molecular 
Diagnostics”. Seventh edition. Ed Elsevier. 
 
 
 
 21 
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TRIGLICÉRIDOS EN TEJIDO HEPÁTICO 
 
OBJETIVO 
Determinar el contenido de triglicéridos en tejido hepático de ratas alimentadas, por el 
método de extracción de lípidos de Folch y el método de Lambert y Neish para el dosaje de 
triglicéridos. 
 
INTRODUCCIÓN 
 Las moléculas de triglicéridos (TG) representan la principal forma de almacenamiento de 
energía dentro de las células. El hígado, el órgano central del metabolismo lipídico, es capaz de 
captar AG del plasma y de realizar biosíntesis de AG de novo. En condiciones fisiológicas, el hígado 
almacena solo pequeñas cantidades de estos AG como TG. Estas bajas concentraciones de TG en 
hígado son atribuibles a un equilibrio preciso entre la adquisición AG no esterificados del plasma 
y la lipogénesis de novo, versus la eliminación de TG por oxidación de AG y la secreción de 
lipoproteínas ricas en TG. En un contexto de malnutrición (desbalance de nutrientes y/o energía), 
el metabolismo de los AG hepáticos está alterado, esto puede conducir a la acumulación de TG 
dentro de los hepatocitos, y posteriormente a una condición clínica conocida como enfermedad 
hepática grasa no alcohólica (EHGNA). 
 
 
Primera Parte: EXTRACCIÓN DE LOS LÍPIDOS TOTALES POR EL MÉTODO DE FOLCH 
 
FUNDAMENTO 
La extracción de los lípidos totales (TG, colesterol, fosfolípidos, etc.) presentes en una muestra 
de tejido o plasma se realiza con una mezcla de cloroformo/metanol y posterior filtrado y lavado 
del extracto con soluciones adecuadas de sales y solventes que posibilita la separación de las 
sustancias no lipídicas del mismo y gotas de agua. 
Por último, los fosfolípidos son removidos por adsorción con ácido silícico, debido a que 
interfieren al producir glicerol por saponificación. 
 
REACTIVOS 
a) Cloroformo. 
b) Metanol Absoluto. 
c) Mezcla extractante cloroformo/metanol: se prepara en el momento de usar manteniendo las 
proporciones 2/1 (v/v) respectivamente. 
d) Solución standard de TG: 200 mg de Trioleína/100 mL de cloroformo. 
e) Soluciones de lavado: 
 Solución de lavado I: CaCl2 0.02 % en la mezcla cloroformo/metanol/H2O: 3/48/47 (v/v/v). 
 Solución de lavado II: Cloroformo/metanol/ H2O: 3/48/47 (v/v/v). 
f) Ácido silícico 100 “Mesh”: Activado durante 2 horas a 110-120 C y guardado en recipiente 
hermético en desecador. 
 
MUESTRAS 
Homogeneizado de tejido hepático de ratas alimentadas con DC y DRS, diluido 1/10 con agua 
destilada fría. 
 
 
 
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TÉCNICA OPERATORIA 
 
1- Extracción de TG 
 
TUBO B S1 S2 S3 S4 M 
Solución Standard de Trioleína TAG (l) - 50 100 150 200 - 
Homogenato (dil.1/10) de hígado (l) - - - - - 200 
Cl3CH/ CH3OH 2:1 (mL) 4.00 3.95 3.90 3.85 3.80 3.80 
 
Se deja reposar el tubo bien tapado durante 30 minutos, agitando cada 10 minutos. 
Filtrar el homogenato a tubos de centrífuga, usando papel de filtro libre de grasas 
(previamente lavado con mezcla cloroformo/metanol 2/1). 
 
2- Lavado del extracto 
Se debe marcar el volumen contenido en los tubos. 
Se agregan 0,7 mL de la solución de lavado I y se mezcla. Se centrifuga hasta separación 
completa de fases (5 min a 2000 rpm). La fase superior se elimina por succión. 
Enjuagar la interfase agregando 0,7 mL de solución de lavado II, y mezclar nuevamente. 
Centrifugar hasta separación de fases (5 min a 2000 rpm) y descartar la fase superior por succión, 
eliminando la mayor cantidad posible. Si es necesario agregar gotas de metanol a la fase inferior 
hasta formar una sola fase. 
Llevar nuevamente al volumen inicial marcado con la mezcla cloroformo/metanol: 2/1 (v/v). 
 
3- Remoción de fosfolípidos 
 
TUBO B S1 S2 S3 S4 M 
Acido silícico (g) 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 
Agitar 30’’ – reposar 10’ - Agitar 30’’ 
Centrifugar 10’ 
 
Transferir 1,5 mL del sobrenadante a tubos cortos. 
Evaporar a sequedad en Baño María 65 – 70 C (en esta etapa se puede detener la reacción 
guardando los tubos tapados a –20 C). 
 
 
 
 
 
 
 
 23 
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+ H C
OH
O
IO32 H2OH C
O
H
2 IO4 +
CH2OH
CH2OH
CHOH 2+ +
 
Segunda Parte: DOSAJE DE TRIGLICÉRIDOS POR EL MÉTODO DE LAMBERT Y NEISH 
 
FUNDAMENTO 
El presente método se basa en la determinación del glicerol liberado por hidrólisis química de 
los triglicéridos (TG) extraídos en la etapa anterior. Posteriormente el formaldehído formado por 
oxidación del glicerol se detecta colorimétricamente a través de la reacción con ácido 
cromotrópico que da lugar a un cromóforo violeta de estructura desconocida, de acuerdo a las 
siguientes reacciones: 
 
A- Saponificación de los TG con KOH etanólico. 
 
 
B- Dosaje del glicerol por oxidación del mismo con peryodato (el exceso de peryodato se elimina 
por agregado de arsenito de sodio). 
 
 
 
 
 
 
 
 Ácido Fórmico Formaldehído 
 
C- El formaldehído producido se determina por reacción con ácido cromotrópico a 570 nm. 
 
 
 Ácido cromotrópico 
 
REACTIVOS 
a) Etanol absoluto. 
b) KOH 6 N. 
c) KOH etanólico: se mezclan en el momento de usar KOH 6 N y etanol, manteniendo las 
proporciones 0,5/9,5 (v/v) respectivamente. 
d) SO4H2 0.6 N. 
e) m-IO4Na 0.02 M. 
f) AsO2Na 0.2 M. 
C
H
O
H
OHOH
SO3HHO3S
+ Cromóforo violeta
CH2O COR1
CHO COR2
COR3CH2O
3 KOH+ 3R-COOK +
CH2
CH
CH2 OH
OH
OH
Etanol
65-70°C
 
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g) Reactivo de Color: diluir 300 mL de H2SO4 concentrado en 150 mL de agua destilada. (Esta 
solución concentrada de H2SO4 se realiza en baño de hielo, muy lentamente, con extrema 
precaución y con las adecuadas medidas de bioseguridad). 
Separadamente se disuelve 1 g de sal disódica de ácido cromotrópico (ácido 4,5-
Dihidroxinaftalen-2,7-disulfónico sal disódica), en 100 mL de agua destilada, se filtra y se 
agrega el H2SO4 diluido. Esta solución debe ser preparada dos días antes de ser usada. 
Guardar en frasco oscuro a 4 C. 
 
TÉCNICA OPERATORIA 
 
1- Saponificación de TAG: 
 
TUBO B S1 S2 S3 S4 M 
KOH etanólico (mL) 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 
 
Agitar – Llevar a Baño María 65 – 70 C en tubos tapados 10‘– Enfriar 
 
H2SO4 0.6 N (mL) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 
 
Agitar - Llevar a Baño María a 65 – 70 C para evaporar el alcohol 10‘– Enfriar 
 
Transferir 0,3 mL de la mezcla a tubos de ensayo. 
 
2- Dosaje de glicerol: 
 
 B S1 S2 S3 S4 M 
NaIO4 0,02 M (mL) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 
 
Agitar – Dejar reposar 10’ 
 
NaAsO2 0,2 M (mL) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 
 
Agitar – Dejar reposar 5’ 
 
Reactivo de color (mL) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 
 
Agitar y llevar a Baño María en ebullición 30‘. Enfriar. Leer en espectrofotómetro a 570 nm. El 
color es estable durante 2 horas. 
 
CÁLCULOS 
Construir una curva de calibrado: absorbancia en función de concentración de Trioleína (en 
g/tubo). La concentración de la muestra CM se calcula según la siguiente expresión: 
 
tuboLmolgPMD
gTHLtubogC
gTHmolC
Trioleína
M
/200)/(
/1000)/(
)/(





 
 
 
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Donde: 
10
1
D 
 
RESULTADOS 
Expresar en: 
 µmol/g TH 
 µmol/peso de órgano 
 µmol/100 g de rata 
 
PM Trioleína: 885,41 g/mol 
 
VALOR DE REFERENCIA 
Ratas machos Wistar alimentadas con DC = 10 - 14 µmol/g TH. 
 
BIBLIOGRAFÍA 
 
 Folch, J.; Lees, M. and Sloane Stanley, G.H. (1957). “A Simple method for the isolation and 
purification of total lipids from the animal tissues”. J Biol Chemistry. 226: 497-509. 
 
 Lambert, M. and Neish, A.C. (1950). “Rapid method for estimation of glycerol in fermentation 
solution”.Canadian J Res. 28b: 83-89. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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QUÍMICA BIOLÓGICA – Bioquímica y Lic. en Biotecnología 
Guía de Trabajos Prácticos 
Año 2018 
 
VELOCIDAD DE SECRECION HEPATICA DE LIPOPROTEINAS DE MUY BAJA DENSIDAD (VLDL-TG) 
 
OBJETIVO 
Estudiar la capacidad de secreción de VLDL-TG “in vivo” en ratas ayunadas por el Método 
Otway y Robinson. 
 
FUNDAMENTO 
Una técnica adecuada para determinar la velocidad de secreción hepática de triglicéridos (TG) 
“in vivo” es la descripta por Otway y col. La misma se basa en la inhibición de la clarificación de 
TG circulantes por la acción de un detergente no iónico: Triton WR 1339. El mecanismo por el 
cual el Tritón bloquea la remoción intravascular de las lipoproteínas de densidad menor de 1.006 
g/mL no está completamente dilucidado. Se ha sugerido que este agente inhibe selectivamente 
la lipoproteína lipasa (LPL) funcionalmente activa de los tejidos extrahepáticos, enzima 
directamente involucrada en la hidrólisis de TG provenientes de las VLDL y Quilomicrones. Por 
otro lado, el Triton formaría un complejo con los lípidos o apoproteínas de superficie de las 
partículas de VLDL previniendo su delipidación por la acción de la LPL. Además, está bien 
establecido que el Triton WR 1339 inhibe la remoción pero no interfiere con la síntesis y secreción 
de VLDL-TG. 
De lo expuesto, luego de la administración intravenosa de Tritón, la acumulación de TG en el 
suero aumenta linealmente en función del tiempo, representando una medida válida para el 
estudio de la velocidad de secreción de VLDL-TG por el hígado, ya que la contribución intestinal 
de TG (Quilomicrones) en condiciones de ayuno es despreciable. 
 
ANIMALES Y MATERIAL NECESARIO 
- Ratas macho Wistar de los distintos lotes. 
- Anestesia: Pentobarbital sódico 60 mg/kg de peso corporal (solución 20 mg/ml). 
- Material de cirugía y tabla de disección. 
- Triton WR 1339: 600 mg/kg de peso corporal. Preparar una solución de Triton: 150 mg/mL 
de Solución Fisiológica. 
- Cánulas, jeringas y agujas para extracción heparinizadas. 
- Solución Fisiológica: 9g NaCl en 1000 mL de agua destilada. 
 
Calcular la cantidad a inyectar (en ml) de anestesia y de solución de Triton, según el peso del 
animal. 
 
MUESTRAS 
Plasma extraído a distintos tiempos de los animales de los lotes DC y DRS. 
 
 
PROTOCOLO EXPERIMENTAL 
1- Ayunar los animales durante 12-16 horas. 
2- Mantener los animales a 37 C durante toda la experiencia. 
3- Anestesiar a los animales intraperitonealmente con la solución de pentobarbital sódico 
calculada según la dosis y el peso del animal. 
4- Canular la vena yugular y tomar una muestra de sangre basal (tiempo=0). 
5- Inyectar a través de la cánula la solución de Triton calculada según la dosis y el peso del 
animal. 
 
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Guía de Trabajos Prácticos 
Año 2018 
 
6- Realizar extracciones de sangre utilizando la otra vena yugular a 60, 90 y 120 minutos 
luego de la administración del Triton. Conservar las muestras a 4 C hasta finalizar la 
experiencia. 
7- Centrifugar las muestras y separar el plasma. 
8- Dosar el contenido de TG en cada una de las muestras obtenidas mediante la técnica de 
determinación enzimática de TG (ver guía de T.P. correspondiente). Para determinar [TG] 
a los 120 min., se debe diluir la muestra con solución fisiológica antes de procesar. A modo 
de ejemplo: para animales DC, D = 1/3 y para animales DRS, D = 1/4. 
 
RESULTADOS 
- Calcular la velocidad de secreción (VSTG) según la siguiente expresión: 
 
 
   
Pt
VTGTG
pesognmolVSTG
pt



100)(
min/100/
0
 
Donde: 
 0TG es la concentración de TG a tiempo 0; 
 tTG es la concentración de TG al tiempo t luego de la administración de Triton; 
pV es el volumen plasmático, que se considera 4% del peso del animal (valor expresado en ml); 
P es el Peso del animal; 
t es el tiempo del experimento luego de la administración de Triton. 
 
La expresión anterior supone que hasta el tiempo t considerado, la VSTG es aproximadamente 
constante. 
 
VALOR DE REFERENCIA 
Ratas machos Wistar alimentados con dieta control: 130 – 170 nmol/minuto/100 g rata. 
 
 
BIBLIOGRAFÍA 
 
 Otway, S. and Robinson, D. (1967). “The use of a non-ionic detergent (Triton WR 1339) to 
determine rates of triglyceride entry into the circulation of the rat under different physiological 
conditions”. J. Physiological 190, 321-330. 
 
 Otway, S. and Robinson, D. (1967). “The effect of a non-ionic detergent (Triton WR 1339) on 
the removal of triglyceride fatty acids from the blood of the rat” J. Physiological 170, 309-319. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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TEST DE TOLERANCIA GRASA ENDOVENOSO 
 
OBJETIVO 
Estudiar la capacidad de remoción de triglicéridos “in vivo” en ratas ayunadas por el Método 
de Lewis y Carlson. 
 
FUNDAMENTO 
El test de tolerancia grasa endovenoso consiste en la administración de una emulsión grasa 
artificial para el estudio de la capacidad de remoción de triglicéridos (TG) en diferentes estados 
metabólicos. Se ha comprobado que la emulsión grasa “Intralipid” (I) es un trazador útil para el 
estudio de la velocidad de remoción fraccional de los TG circulantes. Al ponerse en contacto con 
la circulación, la partícula lipídica de esta emulsión artificial adquiere Apo CII, Apo CIII y Apo A de 
lipoproteínas (HDL), constituyendo de esta manera un sustrato adecuado para ser degradado en 
forma similar a las VLDL y Quilomicrones por la Lipoproteina lipasa (LPL). 
Luego de la administración intravenosa de Intralipid, la velocidad de desaparición de la 
emulsión grasa desde la circulación (cuantificada como concentración de TG en función del 
tiempo) sigue una cinética de primer orden. La constante cinética k2 es la velocidad fraccional de 
remoción y su valor suele ser del orden 10-2 min -1. 
 
 
ANIMALES Y MATERIAL NECESARIO 
- Ratas macho Wistar de los distintos lotes. 
- Anestesia: Pentobarbital sódico 60 mg/kg de peso corporal (solución 20 mg/ml). 
- Material de cirugía. 
- Tabla de disección. 
- Cánulas, agujas y jeringas heparinizadas. 
- Solución fisiológica: 9g NaCl en 1000 mL de agua destilada. 
- Intralipid (I): 0,1 mL de Intralipid/100 g de peso corporal (solución al 10%). 
 
Calcular la cantidad a inyectar (en ml) de anestesia y de solución de Intralipid, según el peso 
del animal. 
 
 
MUESTRAS 
Plasma de rata extraídos a distintos tiempos de los lotes DC y DRS. 
 
PROTOCOLO EXPERIMENTAL 
1- Los animales tendrán un ayuno de 12-16 horas. 
2- Mantener los animales a 37 C durante toda la experiencia. 
3- Anestesiar los animales intraperitonealmente con la solución de Pentobarbital sódico 
calculada según la dosis y el peso del animal. 
4- Canular la vena yugular y tomar una muestra de sangre basal (tiempo = 0) con jeringa 
heparinizada. 
5- Inyectar a través de la misma vena yugular la solución de Intralipid calculada según la dosis y 
el peso del animal. 
 
 
 
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Año 2018 
 
6- Realizar extracciones de sangre (0,2-0,3mL) mediante cánula de la otra vena yugular a los 2, 
4, 6, 10, 20 y 30 minutos después de la administración del (I), enjuagando las jeringas con 
solución fisiológica heparinizada. 
7- Recolectar las muestras heparinizadas en tubos de microcentrífuga y conservarlas a 0-4C 
hasta el momento de finalizar el test. 
8- Centrifugar las muestras a 600 rpm durante 10 min. Separar el plasma cuidadosamente y 
trasvasarlo a otro tubo. Centrifugar nuevamente bajo las mismas condiciones para eliminar 
cualquier remanente de células rojas. 
9- Diluir los plasmas obtenidos a los distintos tiempos con solución fisiológica según 
corresponda. 
10- Medir turbidez por Nefelometría. 
 
RESULTADOS 
 Graficar UN (unidades nefelométricas) vs Tiempo. 
 Calcular k2(10-2 min –1). 
 
VALOR DE REFERENCIA 
Ratas machos Wistar alimentadas con Dieta Control, k2 = (6-12) x 10-2 min-1. 
 
 
BIBLIOGRAFÍA 
 
 Lewis, B.; Boberg, J.; Mancini, M. and Carlson, L.A. (1972). “Determination of the intravenous 
fat tolerance test with intralipid by nephelometry”. Atherosclerosis 15: 83-86. 
 
 Rossner, S. (1974). “Studies on an intravenous fat tolerance test. Methodological, 
experimental and clinical experiences with Intralipid”. Acta Med. Sand. Supp. I, 564: 1-24. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Año 2018 
 
C. PRUEBAS PARA EVALUAR PROTEÍNAS RELACIONADAS CON EL METABOLISMO 
 
Contenidos teóricos mínimos necesarios para la realización y aprobación de esta sección: 
 Aminoácidos: clasificaciones, estructura general, funciones. 
 Proteínas: estructura y funciones generales. 
 
 
ACTIVIDAD GLUCOSA-6-FOSFATO DESHIDROGENASA EN TEJIDO HEPATICO 
 
 
OBJETIVO 
Determinar la actividad de la enzima glucosa-6-fosfato deshidrogenasa en tejido hepático de 
ratas alimentadas por un método espectrofotométrico. 
 
INTRODUCCIÓN 
 
La glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH) es una enzima citoplasmática que cataliza el 
primer paso de la fase oxidativa de la vía de las pentosas fosfato en el cual se produce la 
deshidrogenación de la glucosa 6 fosfato (G6P) en el C1 para formar 6-fosfogluconato (6FG). En 
esta reacción el NADP+ se reduce a NADPH (la enzima es altamente específica para NADP+, la Km 
para el NAD+ es mil veces mayor que para el NADP+), por lo que esta reacción representa una de 
las principales fuentes intracelulares de NADPH. El NADPH además de jugar un rol clave en la 
protección de las células frente al estrés oxidativo es un elemento necesario para las biosíntesis 
reductoras tales como la síntesis de ácidos grasos, colesterol y hormonas esteroideas, por lo que 
la enzima es especialmente abundante en tejido adiposo, glándula mamaria en período de 
lactancia, hígado, eritrocitos entre otros. 
 
FUNDAMENTO 
 
La velocidad de una reacción catalizada por una enzima puede medirse con relativa facilidad, ya 
que en muchos casos no es necesario purificar o aislar la enzima. La medida se realiza siempre 
en las condiciones óptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc, y se utilizan 
concentraciones saturantes de sustrato. 
La reacción catalizada por la G6PDH es la reducción de NADP+ a expensas de la deshidrogenación 
de la glucosa-6-fosfato a 6-fosfogluconolactona: 
 
Glucosa-6-Fosfato + NADP+  6-fosfogluconolactona + NADPH 
 
La conversión de G6P a 6-fosfogluconolactona es proporcional a la producción de NADPH. La 
producción de NADPH es determinada midiendo espectrofotométricamente el incremento de la 
absorbancia a 340 nm. A esta longitud de onda, el NADPH posee un pico de absorción ultravioleta 
con un coeficiente de extinción de 6220 M-1 cm-1. Esta diferencia en el espectro de absorción 
ultravioleta entre la forma oxidada y reducida de la coenzima, hace que sea simple medir la 
conversión de una a otra en ensayos enzimáticos, midiendo la cantidad de absorción UV a 340 
nm mediante un espectrofotómetro. 
 
 
 
 31 
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Año 2018 
 
Por lo tanto, la velocidad de formación de NADPH es una medida de la actividad enzimática y la 
misma puede ser seguida por medio del incremento de absorbancia a 340 nm. Esta tasa de 
incremento luego se convierte en unidad de actividad y actividad específica de la G6PDH. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
El pH óptimo de reacción es 8.3 para la enzima de levaduras y eritrocitos. Entre pH 7,4 y 8,6 se 
observa poco cambio de la actividad enzimática, por tal motivo, las medidas se llevan a cabo a 
pH 7.5 debido a que este pH es el más cercano a las condiciones fisiológicas y permite realizar 
comparaciones con otras enzimas que usualmente se miden a ese pH. 
 
 
REACTIVOS 
a) Buffer de Homogenización pH= 8 (70 mM KHCO3, 85 mM K2HPO4, 9 mM KH2PO4, 1 mM DTT) 
b) Buffer Trietanolamina pH= 7.5 (50 mM, 0.53 mM EDTA) 
c) NADP 30 mM 
d) Glucosa-6-fosfato 40 mM 
 
MUESTRAS 
Tejido hepático de ratas alimentadas con DC y DRS. 
 
TÉCNICA OPERATORIA 
 Preparación del extracto 
1- Pesar entre 80 y 100 mg de tejido hepático en tubo de homogenización 
2- Adicionar 0,8- 1 mL de Buffer de homogenización 
3- Homogeneizar durante 2 minutos en baño de hielo 
4- Trasvasar a tubos de centrifuga de 2 ml 
5- Centrifugar a 15000 rpm por 20 minutos a 4ºC- 
6- Tomar cuidadosamente el sobrenadante 
 
 
 
 
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Año 2018 
 
Determinación de la Actividad de G6P-DH 
1- En cubeta UV de 3 ml pipetear: 
- 2.85 ml de buffer Trietanolamina 50 mM, PH = 7.5 
- 50 μl del sobrenadante del extracto 
- 50 μl de NADP+ 30 mM 
2- Incubar por 5 minutos a 25ºC en bloque seco 
3- Agregar 50 μl de glucosa-6-fosfato 40 mM 
4- Agitar por inversión 
5- Empezar a tomar el tiempo y registrar la absorbancia a 340 nm cada 1 minuto durante 
10 minutos. 
CÁLCULOS 
 
Una de las formas de expresión estándar de la actividad enzimática es la unidad internacional 
(U). La unidad internacional de actividad de la enzima G6PDH se define como la formación de 1 
μmol de NADPH en un minuto. Por tanto, la actividad G6PDH (es decir, la reducción de NADP+) 
determinada como velocidad (variación de la Absorvancia a 340 nm por minuto o ΔAbs340/min) 
debe convertirse en μmoles. 
 
La actividad enzimática se estima en unidades (U) usando la siguiente fórmula: 
 
Actividad (U / ml) = (μmol.min-1.ml-1) = velocidad x factor de dilución . 
 Coeficiente de extinción del NADPH 
 
Donde: 
 velocidad: ΔAbs340/min o pendiente de la recta Abs340nm vs tiempo (min) 
 Factor de dilución: ml totales del ensayo / ml de enzima (extracto) usado 
 Coeficiente de extinción del NADPH: 6220 M-1 cm-1= 6.22 mM-1 cm-1 (o 6.22 ml. Umol-
1.cm-1) 
 
Para estimar la actividad específica (U/mg de proteína) debe determinarse la cantidad de 
proteína en el extracto por un método estándar, como el ensayo de Lowry. Esta determinación 
se realizará en el trabajo práctico “Determinación de proteínas”, para lo cual cada comisión 
deberá conservar a -80°C una fracción de los extractos proteicos. 
La actividad específica se estima como la cantidad de unidades por mg de proteína usando la 
siguiente fórmula: 
 
Actividad específica (mU / mg proteínas) = U/ml x 1000 . 
 Concentración de proteínas en el extracto 
 
Donde: 
 Unidades de Actividad = μmol.min-1 
 1000= conversión de U a mU 
 Concentración de proteínas en solución = mg. ml-1 
 
 
 
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RESULTADOS 
Expresar en U/ml y mU/mg proteínas 
 
VALOR DE REFERENCIA 
Ratas machos Wistar alimentadas con DC = 22.57 ± 4,53 mU / mg proteína 
 
 
BIBLIOGRAFÍA 
 
- G.W. Lohr, H.D. Waller, Glucose-6-phosphate dehydrogenase, in: H.U.Bergmeyer (Ed.), 
Methods. Enzym. Anal. 1963, pp. 744-751. 
- Stryer 
- Hein GJ, Bernasconi AM, Montanaro MA, Pellon-Maison M, Finarelli G, Chicco A, Lombardo YB 
and Brenner RR. Nuclear receptors and hepatic lipidogenic enzyme response to a dyslipidemic 
sucrose-rich diet and its reversal by fish oil n-3 polyunsaturated fatty acids. Am J Physiol 
Endocrinol Metab 298: E429–E439 (2010). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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DETERMINACION DE PROTEINAS 
 
OBJETIVOS 
Determinar el contenido de proteínas totales por el método de Lowry en: 
a- Extracto proteico utilizado en la determinación de la actividad enzimática de la G6PDH 
b- Extracto de tejido hepático para la posterior cuantificación delreceptor nuclear denominado 
receptor activado por proliferadores peroxisomales α (PPARα) mediante la técnica de Western 
Blot 
 
INTRODUCCIÓN 
Las proteínas son las moléculas orgánicas más abundantes de la célula. Se encuentran en 
todos los tejidos vivos y están en íntima relación prácticamente con todos los fenómenos 
fisiológicos, formando parte de estructuras y cumpliendo las más diversas funciones. 
Son biopolímeros formados por una o más cadenas de polipéptidos, cuya unidad estructural 
son los -aminoácidos. Las distintas funciones que cumplen se deben a que sus propiedades 
están determinadas, en gran medida, por su estructura tridimensional. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FUNDAMENTO 
La técnica de Lowry se encuentra entre aquellas metodologías que se basan en la capacidad 
del cobre de formar complejos con las estructuras proteicas. Es una modificación de la reacción 
de Biuret en la que se emplea el reactivo Fenol de Folin, lo cual permite incrementar más de cien 
veces la sensibilidad de la técnica original. Debido a su sensibilidad, simplicidad y precisión este 
método es uno de los más utilizados para la determinación cuantitativa de proteínas, 
principalmente en mezclas proteicas complejas. 
Si bien el mecanismo de reacción que conduce al desarrollo de color no está completamente 
esclarecido se sabe que el ensayo involucra 2 pasos diferentes: 
 
Primer paso: Las proteínas son tratadas con una solución de ión cúprico en medio alcalino, 
formándose un complejo entre las uniones peptídicas y el cobre (reacción de Biuret). La reacción 
con cobre no es instantánea, pero se completa en 5-10 min a temperatura ambiente. 
 
Segundo paso: Se adiciona el reactivo de Fenol de Folin el cual consiste en una mezcla ácida 
fosfotúngstica-fosfomolíbdica que oxida compuestos fenólicos en condiciones alcalinas. La 
reacción que tiene lugar es compleja, pero en esencia involucra la reducción del reactivo de Folin 
y oxidación de los aminoácidos aromáticos de las proteínas. Se cree que el complejo proteína-
cobre provoca la reducción del reactivo de Folin con pérdida de 1, 2 o 3 átomos de oxígeno del 
tungstato y/o molibdato, y de esa manera se generan especies reducidas que tienen un color azul 
característico. El cobre facilitaría la transferencia de electrones. Los principales aminoácidos 
 
-aminoácido 
 
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cromogénicos son la tirosina y el triptófano y en menor medida la cistina, cisteína e histidina. Las 
uniones peptídicas son también cromogénicas. 
 
La intensidad del color del reactivo de Folin reducido incrementa con el tiempo hasta alcanzar un 
máximo a los 30 minutos de haber sido adicionado a la mezcla. El pico de absorción se encuentra 
entre 650 – 750 nm. 
La cuantificación de proteínas en una muestra puede ser estimada mediante la construcción de 
una curva de calibrado utilizando una solución standard de proteína (Ej: Albúmina sérica bovina 
– ASB). 
 
 
Figura 1. Fundamento del método de Lowry 
 
Algunas consideraciones acerca del método: 
 
 La reacción se realiza a pH 10 debido a que en esas condiciones se obtiene el máximo 
desarrollo de color. Sin embargo, a ese pH, el reactivo de Folin es reactivo por un corto 
período de tiempo (segundos). Se cree que la disminución de la reactividad se debe a la 
disociación de los aniones fosfomolibdato, con formación de ácido fosfórico, el cual provoca 
una disminución del pH. Por esta razón, cuando se adiciona el reactivo de fenol Folin es 
necesario agitar de inmediato los tubos (1-2 segundos) para garantizar que el mismo 
reaccione completamente. 
 Una de las desventajas del método es la presencia de sustancias interferentes: compuestos 
reductores, detergentes, altas concentraciones de iones sulfhidrilos, turbidez debido a 
concentraciones elevadas de lípidos, entre otras. Sin embargo, se han desarrollado diferentes 
estrategias para eliminar las interferencias y ampliar la utilidad de esta metología. 
 La reacción sigue la ley de Beer en un rango limitado de concentraciones. Permite la 
cuantificación en forma confiable de muestras cuyo contenido se encuentra entre 10 y 200 
μg de proteína. 
 El color producido en este ensayo depende de la composición de aminoácidos de las 
proteínas. El uso de ASB como standard da una medida aproximada de la concentración de 
proteínas. Para obtener la concentración absoluta de proteínas con esta metodología la curva 
de calibrado debería hacerse con la proteína en estudio. 
 
REACTIVOS 
a) Standard: Albúmina Sérica Bovina (BSA) 100 mg/100mL. 
b) Reactivo A: Disolver 30 g de CO3Na2 anhidro y 4 g de NaOH, en agua destilada y enrasar a 1L. 
c) Reactivo B: Solución de CuSO4.5H2O al 2%. 
d) Reactivo C: Solución de tartrato de Na y K al 4%. 
 
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 Mezcla Reactiva: preparar en el momento de usar teniendo en cuenta el orden en que se 
adicionan los reactivos  1 volumen de reactivo B + 1 volumen de reactivo C + 100 
volúmenes de reactivo A. 
e) Reactivo de Folin-Ciocalteu: Solución de tungstato y molibdato de Na en medio ácido. El 
reactivo de Folin debe ser ~ 1N en ácido para ello diluir al medio con agua destilada antes de 
usar. 
f) Buffer de lisis para extracción de proteínas (Tris-HCl 20 mM pH= 7,4; ClNa 150 mM, Triton X-
100 1%, inhibidor de proteasas 5µL/mL). 
 
MUESTRAS: 
a- Determinación del contenido proteico del extracto de tejido hepático utilizado en la 
determinación de la actividad de la enzima G6PDH: 
Realizar una dilución 1/20 del extracto de tejido hepático con el fin de obtener una dilución final 
1/600 
b- Determinación del contenido proteico del extracto de tejido hepático para la determinación 
del PPARα por Western Blot: 
Preparar un homogeneizado del tejido a una dilución 1/10 utilizando Buffer de lisis. Dejar reposar 
30 minutos a 4°C y luego centrifugar a 10 000 rpm a 4°C durante 30 minutos. Separar el 
sobrenadante. Llevar una alícuota a una dilución final de 1/600 con H2O destilada, el resto de la 
muestra se conserva a -80°C para ser procesada posteriormente por la técnica de Western Blot. 
 
TÉCNICA OPERATORIA: 
 
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS: 
 
TUBO B S1 S2 S3 S4 S5 M 
Standard (l) - 25 50 75 100 125 - 
H2O dest. (l) 200 175 150 125 100 75 - 
Homogenato (dil 1/600) (l) - - - - - - 200 
Mezcla reactiva (ml) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 
Agitar – Reposo 10 minutos 
Reactivo de Folin-C. (l) 250 250 250 250 250 250 250 
Agitar inmediatamente – Reposo 30 minutos 
 
Leer en espectrofotómetro a 660 nm. 
 
CÁLCULOS 
Construir una curva de calibrado: absorbancia en función de la concentración de ASB (en 
mg/mL) y calcular la concentración de proteínas en el extracto proteico (CM). 
 
CM (mg/mL)= CM (mg/mL)x D-1 
 
 
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RESULTADOS 
 Expresar en mg /mL 
 
VALOR DE REFERENCIA 
a- Extracto utilizado para la determinación de la G6PDH = 10-14 mg/ml 
b- Extracto utilizado para la determinación del PPARα = 18-25 mg /mL 
 
 
BIBLIOGRAFÍA 
 Lowry, O.H.; Rosebrough, N.J.; Lewis Farr, A. and Randall, R.J. (1951). “Protein measurement 
with the Folin Phenol reagent”. J. Biol. Chem. Vol.193. pp 265-275. 
 Peterson, G. (1979). “Review of the Folin phenol protein quantitation method of Lowry, 
Rosebrough, Farr and Randall”.An. Biochem. 100:201-209. 
 Ross, E. and Schatz, G. (1973). “Assay of protein in the presence of high concentrations of 
sulfhydryl compounds”. An. Biochem. 54:304-306. 
 Federici, M.; Hribal, M.; Perego, L.; et al. (2001). “High glucose causes apoptosis in cultured 
human pancreatic islets of Langerhans: a potential role for regulation of specific Bcl family 
genes toward an apoptotic cell death program”. Diabetes 50: 1290 – 1301.38 
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Guía de Trabajos Prácticos 
Año 2018 
 
 
 
CUANTIFICACION DE PPARα POR LA TECNICA DE WESTERN BLOT 
 
INTRODUCCION 
 
Los receptores activados por proliferadores peroxisomales (PPARs) forman parte de la 
superfamilia de receptores nucleares de hormonas. Estos receptores de naturaleza proteica se 
unen a regiones del ADN denominadas elementos de respuesta a PPAR (PPREs) y regulan la 
expresión de genes en respuesta a ligandos específicos. Hasta el momento, se han identificado 3 
isoformas las cuales han sido designadas PPARα, PPARδ (también llamado PPARβ) y PPARγ. 
El PPARα es el subtipo que se encuentra mayoritariamente en el hígado y juega un rol clave 
en la regulación de genes involucrados en diferentes procesos celulares tales como la oxidación 
de ácidos grasos, el metabolismo de lípidos y lipoproteínas, la respuesta inflamatoria y el estrés 
oxidativo. 
FUNDAMENTO 
El Western Blot es una de las herramientas analíticas y preparativas más ampliamente usadas 
en biología molecular y celular que combina el poder resolutivo de la electroforesis en gel con la 
especificidad de los anticuerpos y la sensibilidad de los métodos de detección. 
Puede ser empleado para determinar características importantes de una proteína: presencia 
y cantidad, PM relativo, eficiencia de extracción o purificación de una proteína dada, entre otras. 
Los pasos involucrados en esta metodología incluyen: 
 
1. Preparación del extracto proteico y determinación de la concentración de proteínas en el 
extracto (pasos desarrollados en el TP “determinación de proteínas”) 
 
2. Desnaturalización y reducción de las proteínas del extracto 
La mezcla de proteínas es desnaturalizada por calentamiento en presencia de un exceso de 
dodecil sulfato de sodio (SDS) y 2-mercaptoetanol. En estas condiciones el tiol rompe los puentes 
disulfuro que pudieran existir y el agente desnaturalizante hace que la proteína se desdoble 
en sus polipéptidos constitutivos, los que fijan SDS en una relación constante (1,4 g de SDS por 
gramo de polipéptido). A causa de ello la carga intrínseca del péptido se hace insignificante ante 
el exceso de carga negativa de SDS, como consecuencia, la carga de todas las moléculas será 
prácticamente idéntica (Figura 1). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
SDS 
 
 
 
2-ME 
 
 
 
calor 
 
 
Figura 1. Desnaturalización y 
reducción de proteínas del extracto 
 
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3. Separación de las proteínas de acuerdo a su peso molecular mediante electroforesis. 
La electroforesis en gel de poliacrilamida es un método de alto poder resolutivo que combina 
la migración en un campo eléctrico y el tamizado molecular a través de un gel de corrida. En 
presencia de SDS, las proteínas se separan en base a su tamaño molecular cuando se mueven a 
través de la matriz de poliacrilamida. Este método, conocido como SDS-PAGE permite, por 
comparación con sustancias de peso molecular conocido (patrones) que han sido corridas 
simultáneamente, determinar el peso relativo de los productos de análisis. 
 
Geles de poliacrilamida 
Los geles de poliacrilamida resultan de la polimerización en largas cadenas de la acrilamida 
monomérica y de su entrecruzamiento por medio de la N, N’-metilenbisacrilamida (o 
bisacrilamida). 
La polimerización de la acrilamida es iniciada con el agregado de persulfato de amonio (PSA) 
o de riboflavina, siendo el primero el más comúnmente usado. Para acelerar el proceso de 
polimerización se añade N, N, N’, N’tetrametilendiamina (TEMED). El TEMED cataliza la formación 
de radicales libres a partir de persulfato lo que en definitiva inicia la polimerización. El oxígeno 
inhibe la polimerización, ello hace que los reactivos a emplear deban ser previamente 
desgasificados. 
El tamaño del poro del gel de poliacrilamida está influenciado por la concentración de 
acrilamida total en la mezcla de polimerización, por lo que pueden conseguirse poros de 
diferentes diámetros según las condiciones de trabajo: el tamaño del poro efectivo diminuye al 
incrementarse la concentración de acrilamida. En un gel de determinado poro, el tamaño 
molecular y la carga neta serán los factores determinantes de la separación de las moléculas de 
una mezcla. Sin embargo en presencia de SDS la separación dependerá exclusivamente del 
tamaño molecular de la molécula. 
 
Sistema de Buffers discontinuos 
En los sistemas discontinuos, el buffer de los geles y el de los reservorios de los electrodos son 
diferentes. Normalmente los pH de ambas soluciones buffer son también distintos. 
Existen 2 geles distintos: 
 
•Gel de poro grueso, de concentración, de 
apilamiento o stacking: Buffer Tris-ClH pH: 6,8. 
Tamaño de poro grande (no restrictivo). 
•Gel de corrida o de resolución: Buffer Tris-glicina pH: 
8,8. Tamaño de poro restrictivo (aquí se separan las 
proteínas). 
Las muestras a analizar se siembran en un gel de poro 
grueso al que se ha hecho polimerizar por sobre el gel 
de corrida o gel de separación (Figura 2). 
La mayor ventaja de los sistemas de buffer 
discontinuos es que permite que volúmenes 
apreciables de muestras diluidas de proteínas puedan 
ser analizadas. 
 
 
 
Figura 2. Electroforesis en gel de 
poliacrilamida 
 
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4. Transferencia de las proteínas a membrana. 
Se puede obtener información acerca de la identidad de 
las proteínas si se transfieren electroforéticamente desde 
el gel a membranas. Aquí las proteínas quedan 
inmovilizadas y están accesibles para interaccionar con 
otras moléculas que permitan su identificación. 
 La transferencia se hace en una cuba con el gel en 
posición vertical, completamente sumergido entre dos 
paneles de electrodos (Figura 3). Las proteínas transferidas 
se unen a la superficie de la membrana facilitando el acceso 
para la reacción con los reactivos de inmunodetección. Las 
membranas pueden ser de nitrocelulosa, PVDF o nylon. 
 
Al buffer de transferencia se le adiciona metanol para 
prevenir el hinchamiento del gel durante la transferencia y para aumentar la unión de las 
proteínas a la membrana. 
Para evaluar la eficiencia de la transferencia se aconseja hacer una tinción no específica de las 
proteínas luego de transferidas. Para ello se prefiere Rojo Ponceau, que tiñe en forma reversible. 
También existen patrones de transferencia de proteínas (marcadores de PM ya coloreados), los 
cuales son muy útiles como marcadores de PM para identificar por comparación la banda de 
interés en la muestra incógnita y para monitorear la eficiencia del proceso de transferencia. 
 
5. Bloqueo de la membrana 
Luego de la transferencia, todos los sitios de unión remanentes en la membrana son 
bloqueados por inmersión de la misma en una solución que contiene un agente bloqueante. 
Generalmente se usa leche descremada o albúmina sérica bovina, aunque también se puede 
utilizar ovoalbúmina o hemoglobina. El bloqueo previene la unión inespecífica de proteínas a la 
membrana. 
 
6. Inmunodetección 
Incubación con el Anticuerpo primario específico contra la proteína de interés. 
Se procede a la incubación de la membrana con una solución de anticuerpo diluido que puede 
ser monoclonal o policlonal. 
 
Incubación con el Anticuerpo secundario conjugado. 
El complejo Antígeno-Anticuerpo primario es identificado con un Anticuerpo secundario o 
ligando específico para el primer Anticuerpo. 
 
 Desarrollo de la señal. 
Existen diferentes métodos de detección para poner en evidencia los complejos Ag-Ac 
formados algunos de los cuales se resumen a continuación: 
 
 
 
 
 
 
Figura 2Figura 2Figura 3. Electrotransferencia 
SOPORTE 
PLASTICO 
PAPEL DE 
FILTRO 
GEL 
MEMBRAN
A 
BUFFER DE 
TRANSFEREN
CIA DIRECCION 
DE 
TRANSFEREN
CATODO ANODO 
 
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