INFORME 4 PREPARACION PARA MUESTRA DE MICROBIOLOGIA

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PRACTICA 4
PREPARACIÓN DE MATERIAL DE MICROBIOLOGÍA Y ESTERILIZACIÓN 
I. INTRODUCCIÓN: 
La limpieza y esterilización de material de laboratorio es un método de eliminación total de todo tipo de organismo que asegura la ausencia absoluta de cualquier forma viviente. Una esterilización deficiente o manipulación incorrecta de materiales y medios de cultivo conlleva a contaminaciones, resultados erróneos o pérdida del material biológico. A través de ello es que se requieren correctas prácticas de laboratorio para su adecuado manejo. 
Los procesos que se llevarán a cabo será la esterilización por calor seco o húmedo que mayormente se utilizan en los laboratorios de Microbiología. Por un lado, el calor seco destruye a los microorganismos por oxidación, al exponerlo directamente a la flaca mediante un mechero en horno a 150 – 180 °C, durante una hora. El otro método de esterilización en calor húmedo se da en condiciones de 15 libras de presión, 121 °C y 15 minutos de tiempo en la autoclave luego de que se elimina la columna de aire en su interior e ingrese el vapor de agua. Estos métodos se aplican en la esterilización de asas de inoculación y para todo tipo de material de vidrio y quirúrgico.
Esta presente práctica se realiza en el laboratorio de Microbiología de la Universidad Nacional Autónoma de Tayacaja Daniel Hernández Morillo, donde se toca el tema principal de la limpieza y preparación de material de laboratorio para la esterilización mediante el uso de la autoclave y el procedimiento en calor húmedo y calor en seco para la eliminación de microorganismos y su próximo uso en análisis o determinación de nuevos cultivos que se verá en las próximas practicas de laboratorio.	
II. OBJETIVOS:
· Preparar el material a esterilizar correctamente
· Esterilizar el material a calor húmedo
III. MATERIAL Y MÉTODO
2.1 MATERIAL
· Tubos de ensayo 18x13
· placas Petri
· 2 pipetas de 5 mL y 10 Ml
· 2 matraz Erlenmeyer 250 mL
· Papel Kraft
· Algodón
· Gasa
· Hilo pabilo
· Plumón marcador
· Tijera
· Masking tape
· Regla de 20 cm
· Autoclave
2.2 PROCEDIMIENTO
a) Limpieza del material a esterilizar
· Colocar el material en recipientes que contengan soluciones detergentes apropiadas (detergentes alcalinos o neutros) procurando que el material este sumergido en su totalidad.
· De contener materia orgánica, dejar reposar 24 horas; de contener sales, someterlo a un ligero calentamiento con HCl concentrado por 30 minutos.
· Lavar el material con escobillas o esponjas.
· Enjuagar con abundante agua corriente y finalmente con agua destilada por tres veces.
b) Preparación del material a esterilizar
· Envolver con papel Kraft los tubos de ensayo, matraz Erlenmeyer, pipetas y placas de Petri como indique el docente.
· Colocar los materiales en contenedores apropiados para su esterilización en autoclave.
· Todos los materiales deben ser identificado y rotulados.
c) Esterilización
Esterilización por calor húmedo (15lb, 121°C x 15 – 20 minutos)
· Este proceso se aplica al material que no resiste temperaturas arriba de135° C.
· Todo material a tratar en forma individual o conjunta debe cubrirse perfectamente con material permeable, resistente al calor, no debe usarse papel aluminio o celofán.
· Operar el esterilizador (autoclave) de acuerdo a las instrucciones del equipo. De manera general el procedimiento es el que se indica a continuación: meter el material en la autoclave, cerrarla, dejar calentar con la válvula abierta y esperar a que el aire del interior de la autoclave sea desplazado totalmente por el vapor de agua, lo que se habrá conseguido cuando a través de la válvula salga una columna continua de vapor de agua. Cerrar la válvula y esperar a que la presión suba hasta 15 lb/in2 (15 psia) y una temperatura de 121 °C. Mantener estas condiciones de 15 a 20 minutos (condiciones generales requeridas para esterilizar el material).
Esterilización por calor seco (180°C x 1 hora)
· Este proceso se aplica a todo material cuya resistencia térmica sea superior a los 150 °C (material de vidrio o metal con cierre hermético, cera, vaselina, aceite, talco).
· Todo material a tratar de forma individual o conjunta debe cubrirse perfectamente con papel aluminio o colocarse en recipientes de acero inoxidable. No usar fibras sintéticas o de algodón.
IV. RESULTADOS
a) Limpieza de material a esterilizar
El procedimiento de la limpieza y la remoción de materia extraña del ambiente, es de mucha importancia especialmente en la parte superficial y objetos. Se usó un lavado manual de los instrumentos de laboratorio como indica en la Figura 1. 
Figura 1. Lavado manual de instrumentos de laboratorio
El propósito de la limpieza es disminuir la biocarga a través de arrastre mecánico, donde se aplicó detergente para su limpieza y desinfección sin embargo antes del lavado se capacitó a los estudiantes para manipulación de agentes químicos. Para su limpieza se realizó la acción mecánica que consiste en lavar con escobillas y agua a presión, el uso de detergentes para disminuir la biocarga y partículas de polvo. 
Posteriormente se utilizó una solución de ácido clorhídrico (HCL), en casos de presencia de sales en los instrumentos de laboratorio, que permite la destrucción de los microorganismos presentes en implementos, equipos. Asimismo, se muestra en la Tabla 01 el mecanismo de acción y aplicaciones del ácido Clorhídrico utilizado en la práctica de laboratorio.
Tabla 01
Mecanismo de acción y aplicaciones del ácido clorhídrico (HCl) 
	Agente
	Mecanismo de acción
	Aplicaciones
	Ácido inorgánico: Ácido clorhídrico (HCl)
	Produce un pH de 2.5 o inferior. Elimina los precipitados inorgánicos de las superficies. Irritante para la piel y las membranas mucosas
	Solución al 0.5 % Muy corrosivo para los metales, pero pueden inhibirse parcialmente con productos anticorrosivos.
 Fuente: Alejos (s.f.). Manual de Desinfección y esterilización.
Los desinfectantes son sustancias químicas aplicadas sobre objetos y superficies; los antisépticos son sustancias químicas aplicadas sobre la piel y mucosas (Alejos, s.f.) 
Por ultimo se enjuagó el material con agua destilada 3 veces, con el fin de que este quede libre de cualquier residuo que pueda llegar a afectar la precisión de los resultados de los análisis y demás pruebas de laboratorio.
b) Preparación del material a esterilizar
La preparación del material a esterilizar está estimada como el mas alto nivel de seguridad de eficacia biocida, por ende, la destrucción de microorganismos o sus formas de resistencia. Se envolvió con papel Kraft los tubos de ensayo, matraz Erlenmeyer, pipetas y placas Petri como indica la Figura 2.
			
Figura 2. Preparación de material para esterilizar
Una vez envuelto con papel Kraft se utiliza la autoclave para la total desinfección, por medio del calor húmedo en paredes gruesas con cierre hermético que permite usar vapor de presión y temperatura elevada. Es considerado el método mas efectivo para una esterilización porque actúa coagulando las proteínas en los microorganismos, provocando su eliminación. Los factores más importantes en el proceso son (Esquiche, 2008):
· La eficacia y rapidez del equipo para remover el aire de la cámara y sustituirlo por vapor evitando fluctuaciones de la temperatura.
· El vapor debe proceder de agua limpia, sin contaminantes y generarse con un porcentaje de agua líquida muy bajo (menor del 3%).
· El vapor debe estar en contacto directo con todo el material, el apilamiento excesivo o incorrecto pueden disminuir la eficacia del proceso.
· Las piezas deben estar limpias, el vapor no penetrará una costra de suciedad.
En la figura 2 se observa la preparación de los materiales de laboratorio con envoltura de Papel Kraft para el proceso de esterilización.
Figura 3. Preparación de material para esterilizar
c) Esterilización
Esterilización en calor húmedo
En el proceso de esterilización existe de dos formas, la primera es a base de calor húmedo que se da a 15lb de presión, 121 °C por 15 o 20 minutos, este método es el más utilizado, ya que a través de su mecanismo destruye todos los microorganismos por desnaturalización de las proteínas, enzimas y desestabilización de membranas, esto se da por dos razones (Ramos, 2006):
· El agua es un compuesto químico muy reactivo y posee muchas estructuras biológicas como ARN, ADN, proteínas, etc, que son producidas por eliminación de agua. Las estructuras secundarias y terciarias de las proteínas se estabilizan por puentes de hidrógeno intramoleculares, pudiendo ser reemplazadas, como rotas por el agua a altas temperaturas.
· El vapor de agua posee un nivel de transferencia de calor mas elevado que el aire. Se libera energía durante la condensación, haciendo que los materiales húmedos conduzcan el calor más rápido.
Se debe usar la temperatura para controlar y monitorear el proceso; la presión se usa para que la temperatura sea óptima (Pharmacopoeia, 2019).
Se realizó el procedimiento como indica en las instrucciones del equipo, donde se metió el material a la autoclave, se cerró y se dejó calentando con la válvula abierta, donde se espera que el aire interno sea expulsado por el vapor de agua que se encuentra en su interior de la autoclave. Posteriormente se cerró la válvula y la presión empezó a ascender a 15 lb, a una temperatura de 121 °C. Se recomienda para el proceso de autoclave dejar 15 minutos que son las condiciones requeridas.
Existen varios métodos de esterilización que pueden usarse teniendo en cuenta la composición del material como lo indica la Tabla 02, por ello es que los materiales de laboratorio, siendo de vidrio se esterilizan por Autoclave a 121 °C a 15 minutos.
Tabla 02
Métodos de esterilización según la composición del material
	Material
	Autoclave (121 °C/ 20 min)
	Via Seca (160 °C)
	Óxido de Etileno (Gas)
	Formalina
	Rayos X Rayos Gamma
	Acero inoxidable
	SI
	SI
	SI
	SI
	SI
	Vidrio
	SI
	SI
	SI
	SI
	SI
	PLASTICOS
	
	
	
	
	
	PP (Polipropileno
	SI
	NO
	SI
	SI
	SI
	PE (Polipropileno)
	SI
	NO
	SI
	SI
	NO
	PS (Poliestireno)
	NO
	NO
	SI
	SI
	SI
	Teflón
	SI
	SI
	SI
	SI
	NO
	PVC
	NO
	NO
	SI
	SI
	NO
	PMP
	SI
	NO
	SI
	SI
	NO
	ABS
	NO
	NO
	SI
	SI
	SI
Fuente: Esquiche (2008). Esterilización de material de laboratorio
Todo este procedimiento obtuvo resultados óptimos para posteriores cultivos, sin presentar problemas de contaminación.
Esterilización a calor seco
La segunda forma de esterilización es por calor seco que se realiza a 180 °C por una hora, este mecanismo se aplica solo a materiales que poseen alta resistencia térmica sea superior a 150 °C como los materiales de vidrio o metal con cierre hermético, cera, vaselina, aceite, talco. Todo este material se cubrió con papel aluminio o recipientes con acero inoxidable, no usar fibras sintéticas o algodón como indica la Figura 4.
Figura 4. Colocación del material en la autoclave
El proceso de esterilización en calor seco provoca la desnaturalización de proteínas, lesiones por oxidación y efectos tóxicos por niveles elevados de electrolitos. Los microorganismos entran en contacto con el calor transmitido por el material, lo cual produce un efecto letal (Vignoli, 2002).
Este proceso se requiere una temperatura más alta que el calor húmedo y mayor tiempo de exposición. Por ello, el método es conveniente para materiales secos que no pueden ser esterilizados por vapor debido a sus efectos nocivos o falta de penetración. Los materiales incluyen: cristalería, polvos, aceites, instrumentos metálicos o medios resistentes a elevadas temperaturas
La tabla 03 indica los métodos, fuentes y tipos de agentes esterilizantes empleados en microbiología, donde se observa que para que exista una esterilización en calor seca tiene que existir una fuente de acción directa de la llama, o por generador de calor.
Tabla 03
Método, fuente y tipo de agentes esterilizantes empleados en Microbiología
	Método
	Fuente
	Tipo
	Calor Seco
	Acción directa de la llama
	Esterilizador al rojo
	
	
	Flameado
	
	
	Incineración
	
	Acción directa por generador de calor
	Estufa de calor seco
	Calor húmedo
	Acción de agua caliente
	Baño Maria hirviendo
	
	
	Calentamiento repetido
	
	
	Ebullición directa
	
	Acción de vapor de agua
	Autoclavado
	Radiación
	Ionizantes
	Rayos X y Gamma
	
	No ionizantes (ultravioleta
	UV 260 nm (ADN/ ARN)
	
	
	UV 280 - 230 nm (proteínas)
	Filtración
	Filtros
	Filtros de diferente composición, tamaño de poro y estructura
Fuente: Vignoli (2002). Esterilización en calor seco
V. DISCUSIÓN
En el presente informe de laboratorio da a conocer la importancia de la limpieza y esterilización de los materiales de laboratorio para un próximo análisis o determinación de algún cultivo, es importante tener en cuenta los factores críticos para que se lleven a cabo el proceso de esterilización, teniendo en cuenta las consideraciones generales que tiene que tener una temperatura de 121 °C a 15 minutos en la esterilización en calor húmedo, sin embargo, Esquiche (2008) menciona que para que el proceso de esterilización resulte con óptimos resultados tiene que ser de 20 minutos en la autoclave, esto es referido todo lo contrario a Vignoli (2002) que indica que para que el proceso de esterilización se lleve a cabo perfectamente se tiene que dar como mínimo 10 minutos en la autoclave. Esto es relevante en la investigación ya que poniendo en práctica en el laboratorio nos hemos dado cuenta que en 15 minutos es suficiente para que se lleve una esterilización completa sin rastros de contaminación en el material de laboratorio.
VI. CONCLUSIONES
Se preparó el material correctamente mediante el uso del Papel Kraft, se envolvió y se usó la autoclave en condiciones de calor húmedo y seco para eliminar todo tipo de microorganismos en el proceso de esterilización.
Se esterilizó el material de laboratorio en calor húmedo usando a 121 °C de temperatura, y 15 minutos de espera en la autoclave, este proceso se fundamenta por el vapor de agua que desnaturaliza las proteínas eliminando completamente los microorganismos del material a utilizar.
VII. BIBLIOGRAFIA
Alejos, J. (s.f.). Manual de desinfección y esterilización. 
Esquiche, J. (2008). Esterilización del material del laboratorio. 
Pharmacopoeia, K. (2019). Influencia de la presión y temperatura en la esterilización. 
Ramos, M. (2006). Preparación del material para el trabajo de Microbiología. Limpieza y esterilización. 
Vignoli, P. (2002). Esterilización en calor seco. 
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