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Taller de bacte II
1. Investigue la clasificación general de los microorganismos anaerobios
Si bien se considera bacteria anaerobia aquel germen que puede crecer sólo en ausencia de oxígeno, la sensibilidad frente al oxígeno varía ampliamente de una especie a otra. Así, distinguimos bacterias microaerófilas, aerotolerantes y anaerobios estrictos u obligados.
· Las bacterias microaerófilas resultan dañadas por niveles altos de oxígeno como el atmosférico (21%) y requieren niveles bajos de O2 para crecer, en el rango de 2 a 10%.
· Anaerobios aerotolerantes son aquellos microorganismos que toleran exposiciones breves al oxígeno atmosférico desarrollando óptimamente en condiciones anaerobias. 
· Los anaerobios estrictos no toleran el oxígeno y mueren en su presencia, por tanto sólo desarrollan en condiciones anaerobias.
· Debido a que constituyen un grupo muy heterogéneo, se las clasifica teniendo en cuenta su morfología, tinción de Gram y presencia o no de esporas
2. ¿Cuáles son los efectos adversos para los anaerobios?
· En primer lugar, el oxígeno es un poderoso agente oxidante, es decir, un ávido receptor de electrones, por lo tanto su presencia en solución es incompatible con potenciales redox bajos. En esta situación el flujo de electrones se ve interferido por un receptor extraño al usual de los gérmenes provocando shunts letales. 
· En segundo lugar, el oxígeno puede interactuar directamente con enzimas o cofactores, a través de la oxidación de grupos químicos sensibles (por ej.: sulfhidrilos), causando inactivaciones irreversibles.
· En tercer lugar y aparentemente, la causa más importante de la oxígeno-toxicidad, se atribuye a la producción de sustancias tóxicas derivadas de la reducción parcial de la molécula de O2. Estos productos son el radical superóxido, peróxido de hidrógeno y radical hidroxilo. Estos productos son extremadamente tóxicos porque son agentes oxidantes poderosos y provocan destrucción de constituyentes celulares rápidamente
3. ¿Cuáles son los factores condicionantes para el desarrollo de las infecciones anaeróbicas?
En general, las infecciones provocadas por gérmenes anaerobios son de origen endógeno, es decir con punto de partida en la flora normal del huésped. Las excepciones estarían dadas por síndromes histotóxicos provocados Clostridium perfringens que puede adquirirse de la flora ambiental. Dado que las bacterias anaerobias se comportan como oportunistas, su patogenicidad depende de factores bacterianos propios y del huésped.
Factores del huésped: el desarrollo de infecciones por anaerobios se ve favorecido por la disminución del potencial redox local (120 mV) debido a isquemia o necrosis (arterioesclerosis, diabetes, traumatismos), por alteración de la integridad de las mucosas que les sirven de barrera (neumonía por aspiración), por caída de las defensas locales o generales y por desequilibrio de la flora normal por causas diversas (hormonales, iatrogénicas, etc.).
Factores de virulencia: los factores de virulencia más importantes en gérmenes anaerobios son aquellos que también se encuentran en bacterias aerobias. En primer lugar, la capacidad de adherirse e invadir superficies epiteliales como en Prevotella y Fusobacterium. En segundo lugar, la producción de toxinas y enzimas que favorecen la necrosis tisular. Bacteroides, Prevotella, Peptostreptococcus poseen fibrinolisina, lipasa, heparinasa, proteasas, hialuronidasa y coagulasa. Cocos y bacilos grampositivos liberan fosfatasas y DNAsas. Las especies más aerotolerantes producen catalasa y superóxidodismutasa que aumentan la sobrevida hasta la instauración de una atmósfera anaerobia. Por último, cabe citar a las endotoxinas tipo lipopolisacárido presentes en Veillonella y Fusobacterium y el polisacárido capsular de B. fragilis que ha sido estudiado en relación con la formación de abscesos y a su propiedad inmunogénica que implica una inmunidad mediada por células más que por inmunoglobulinas.
Sinergismo bacteriano: en muchos casos, la acción patógena de estos gérmenes sólo se puede justificar si se los considera como un modelo polimicrobiano, donde el anaerobio se asocia sinérgicamente a un aerobio o a otro anaerobio. Tal es el caso de la denominada gangrena sinérgica de Meleney, una infección cutánea destructiva e insidiosa en la cual se ven involucrados S. aureus y un estreptococo microaerófilo, habiéndose comprobado que cada uno por separado en animales de laboratorios, no producen esta lesión, pero sí su combinación. Los mecanismos involucrados serían: - Disminución del potencial redox por consumo de oxígeno por parte del otro germen presente. - Síntesis de sustancias necesarias para el crecimiento de anaerobios como ser vitamina K. - Producción de enzimas tóxicas para el huésped o sus defensas y competencia con opsoninas.
4. ¿Cuáles son los indicios o características clínicas que sugiere una infección por anaerobios?
Existen situaciones clínicas en las que los anaerobios desempeñan un papel importante. Las infecciones anaeróbicas están caracterizadas por la formación de abscesos y la destrucción tisular. Estos gérmenes pueden formar parte de cualquier tipo de infección bacteriana. Los anaerobios son responsables del 20% de todas las bacteremias, y cursan con una mortalidad de 19 %, siendo su origen más frecuente el intrabdominal y el germen B. fragilis. Las manifestaciones clínicas sistémicas son las comunes a otros procesos infecciosos que desencadenan la respuesta inflamatoria sistémica.
Enfermedades
Frecuentes: Absceso periamigdalino, intrabdominal y cerebral, infecciones odontológicas, otitis media crónica, mastoiditis, neumonía por aspiración, empiema, peritonitis y apendicitis. Ulceras, celulitis, mionecrosis, fascitis necrotizante y osteomielitis crónica
Raras: Peritonitis primaria, sinusitis, otitis aguda, cistitis, pielonefritis, osteomielitis aguda
5. ¿Cuáles son las muestras adecuadas para el aislamiento de microorganismos anaerobios?
· Orina: Punción suprapúbica
· Heces
· Sangre, LCR y otros líquidos orgánicos
· Tracto respiratorio inferior: Aspiración traslaríngea, toracocentesis y broncoscopía
· Oído: Timpanocentesis
· Cavidad oral y dientes
· Aparato genital: Hisopado de endocérvix y Bartolinitis
· Pus, exudados y quemaduras
· Muestras de cirugía
6. ¿Cuáles son las muestras que no deben ser procesadas para el aislamiento de microorganismos anaerobios? 
· Orina de chorro medio
· Esputo expectorado
· Heces (sólo para investigar Clostridium difficile), ni hisopados rectales
· Hisopado faríngeo y nasofaríngeo
· Hisopado de encías
· Hisopado vaginal
· Superficie de úlceras
7. Según la naturaleza de la muestra, ¿cuáles son las recomendaciones que se deben seguir con el objeto de minimizar errores?
Como las especies encontradas en las diferentes infecciones son, con la excepción de algunos clostridios, las mismas que se hallan en la microflora habitual, para que los estudios microbiológicos tengan valor es necesario que las muestras sean tomadas de forma que la flora normal no las contamine. Por ello que no se deben estudiar muestras nasales, orales, de vías respiratorias bajas recogidas por procedimientos que no impidan su contacto con bacterias de otras localizaciones, cutáneas, vaginales, urinarias tomadas por micción o sondaje o digestivas, salvo para procesos muy concretos, como botulismo, diarrea asociada a antimicrobianos y toxiinfección por C. perfringens. En los abscesos cerrados, empiemas, infecciones de cavidades cerradas y líquidos habitualmente estériles las muestras se deben tomar, si es posible, por punción percutánea-aspiración, empleando las medidas de desinfección preconizadas para los hemocultivos, o en el transcurso de prácticas quirúrgicas. En estas y en otras situaciones se desaconseja el uso de torundas. Las muestras de sangre se deben sembrar en frascos de hemocultivos para anaerobios siguiendo las directrices marcadas en el procedimiento correspondiente para este análisis microbiológico. Las muestras quirúrgicas y las biopsias también son idóneas para la investigaciónde bacterias anaerobias. En las infecciones abiertas es necesario recurrir a muestras representativas, que deben ser de la parte profunda, tomadas quirúrgicamente por aspiración percutánea o tras la eliminación de los tejidos necróticos superficiales por curetaje o por aspiración. En su defecto, se puede tomar la muestra con un hisopo de la base de la lesión. El uso del broncofibroscopio ha mejorado la toma en neumonías (catéter telescopado protegido o lavado broncoalveolar) y la punción transtraqueal ha caído en desuso
8. ¿Qué medios de transporte se deben utilizar para bacterias anaerobias?
En el transporte de una muestra para la búsqueda de bacterias anaerobias se debe evitar la presencia de oxígeno, aunque estas pueden sobrevivir varias horas, incluso días, en un medio de transporte adecuado, dependiendo de su naturaleza. En general, en las muestras purulentas pueden sobrevivir más tiempo que en los líquidos claros. Para el transporte en anaerobiosis se encuentran disponibles en el mercado tubos, frascos y viales con una atmosfera anaerobia que contienen un medio de transporte reducido y resarzurina como indicador de la presencia de oxígeno.
· Sistema Culturette
· Sistema Scott de doble tubo
· Sistema Port-a-Cult
9. ¿Cuál es la importancia de realizar un examen directo de la muestra (frotis directo coloreado con Gram) y cuáles son las características morfológicas de los microorganismos anaerobios?
La tinción de Gram es de una gran utilidad en el diagnóstico microbiológico presuntivo, ya que proporciona información acerca de los tipos de bacterias existentes, cantidad relativa de las mismas, presencia de leucocitos, etc. La morfología y afinidad tintorial de los bacilos anaerobios gramnegativos varía según las diferentes especies. Las de Bacteroides, por lo general, aparecen como bacilos pleomorficos que se tiñen débilmente con la tinción de Gram; las formas cocobacilares son sugestivas de especies pigmentadas de Prevotella o Porphyromonas. Fusobacterium nucleatum suele presentarse como un bacilo gramnegativo fino y fusiforme y a menudo dispuesto en parejas, unidos por un extremo. Hay que señalar que también Fusobacterium periodonticum, y las especies microaerÛfilas de Capnocytophaga muestran estas caracterÌsticas. Fusobacterium mortiferum se presenta como un bacilo muy pleomorficos, con filamentos que contienen zonas hinchadas, o formas redondas y de tinción irregular. Este tipo de morfología se puede observar asimismo en Fusobacterium ulcerans y, ocasionalmente, en Fusobacterium necrophorum. La presencia de pequeños cocos gramnegativos son indicativos de Veillonella. Los bacilos grampositivos anaerobios adoptan múltiples formas y pueden aparecer grampositivos o "gramvariables". Las esporas de Clostridium se ven raramente en las tinciones de los exudados. Un bacilo grampositivo grueso, de forma rectangular y sin esporas es sugestivo de Clostridium perfringens. Un bacilo grampositivo ramificado es sugestivo de Actinomyces o Propionibacterium. Para establecer un diagnóstico presuntivo de una infección por anaerobios es importante que el microbiólogo correlacione el origen de la muestra con los morfotipos observados en la tinción de Gram.
10. medios de cultivos (selectivos, no selectivos y medios de enriquecimiento) utilizados para el aislamiento primario de los microrganismos anaerobios
Medios no selectivos:
Por lo general los anaerobios son bacterias muy exigentes. Se emplean medios complejos que llevan: hidrolizados de carne, peptonas, extracto de levadura, hemina, vitaminas, etc. El medio requiere sustancias reductoras como tioglicolato, glucosa, ácido ascórbico, cisteína, hierro, etc.
Como ejemplos: 
· Medio Tioglicolato enriquecido (MTE)
· Medio de Schaedler
· Agar sangre para anaerobios con L-cistina, hemina y vitamina K: Medio no selectivo de uso general. 
· Agar chocolate: Utilizado principalmente para aislar especies de Neisseria y Haemophilus; sin embargo, se puede requerir también para el aislamiento de anaerobios exigentes.
Medios selectivos
· Agar alcohol fenil etílico con sangre: Aislamiento de anaerobios obligados Gram positivos. 
· Agar Columbia con colistina y ácido nalidíxico (CNA): Aislamiento de anaerobios obligados Gram positivos.
· Agar KVLB (kanamicina, vancomicina, sangre lacada): Aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos anaerobios 
Caldos de enriquecimiento:
· Caldo tioglicolato (enriquecido con L-cistina, hemina y vitamina K)
· Caldo de carne picada 
Caldos de enriquecimiento que se pueden usar como suplemento de medios sólidos particularmente si la muestra escasa (se pueden añadir unas gotas de parafina líquida para mantener mejor la atmósfera anaerobia). Subcultivar en medio para anaerobios.
11. ¿cuál es el procesamiento para la incubación primaria de muestras liquidas, muestras de tejidos y muestras tomadas con hisopos?
Las muestras clínicas deben ser obtenidas del sitio infectado usando procedimientos que garanticen el mantenimiento de una atmósfera carente de oxígeno y eviten contaminación con flora endógena. En general el procedimiento recomendado es aspiración con aguja del material purulento o por biopsia después de desinfección apropiada. Estas muestras deben ser procesadas en el laboratorio lo más rápido posible, manteniendo en todo momento su estado libre de oxígeno. La obtención de muestras son aceptables solo en casos de incluir un medio de transporte apropiado para anaerobios y sean sembradas antes de 30 minutos de obtenida la muestra. Las muestras para cultivos anaeróbicos nunca deben ser refrigeradas. La aspiración directa con aguja es el mejor método de obtener una muestra representativa para cultivo. Los especímenes obtenidos de los líquidos normalmente estériles tales como sangre, líquido cefalorraquídeo o peritoneal, se recogen después de la descontaminación cuidadosa de la piel. El procesamiento inicial incluye su preparación, examen directo e inoculación en los medios de cultivo apropiados.
· Preparación. Tras el examen inicial, la muestra se procesa con las máximas precauciones y lo antes posible, siendo aconsejable que no transcurran más de 30 minutos desde su recepción. Si es posible, la preparación se deber· hacer en una cámara de anaerobiosis para minimizar su oxigenación. El material purulento se mezcla bien con la ayuda del agitador Vortex. Las muestras de tejido o de biopsia se homogeneizan, ya sea con un bisturí, cortando trozos muy finos hasta obtener una consistencia homogénea, o en un mortero estéril añadiendo 1 mililitro de caldo. En el caso de que la muestra se haya obtenido con torunda, se exprime en un pequeño volumen de caldo mediante movimientos rotatorios sobre las paredes del tubo y este caldo se procesa como una muestra líquida. Cuando se investiga la presencia de Clostridium se puede realizar un enriquecimiento, que consiste en eliminar todas las formas vegetativas y conservar las esporas tratando la muestra con calor o alcohol 
· Inoculación de la muestra. Una vez homogeneizada con la ayuda de una pipeta Pasteur se deposita una gota, si la muestra es purulenta, o 2- 3 gotas, si no lo es, en cada uno de los medios de cultivo utilizados, una gota en un portaobjetos para la tinción de Gram y el resto en un medio líquido de enriquecimiento. 
· Examen directo. Proporciona de forma inmediata información semicuantitativa acerca de los microorganismos presentes y un diagnostico presuntivo de la existencia de bacterias anaerobias, lo cual es importante para establecer una terapia inicial, ya que el proceso de aislamiento e identificación puede demorarse varios días. 
· Examen macroscópico. Consiste en la observación de los siguientes datos: mal olor (productos finales del metabolismo de bacterias anaerobias), fluorescencia roja a la luz ultravioleta (produccion de protoporfirina por las especies pigmentadas de Prevotella y Porphyromonas), exudados sanguinolentos, exudados de color negruzco (presencia de bacilos gramnegativos pigmentados), existencia de tejidos necróticos, gas en los tejidos, existencia de gránulosde "azufre" en el exudado (presencia de Actinomyces spp. y Propionibacterium propionicus), exudados purulentos, etc. 
· Examen microscópico. La tinción de Gram
· Medios de cultivo. Para conseguir una recuperación optima de bacterias anaerobias es fundamental elegir correctamente los medios de cultivo primarios. La mayoría de estas bacterias requieren para su crecimiento vitamina K1 y hemina. Para su aislamiento e identificación presuntiva se aconseja utilizar una combinación de medios enriquecidos no selectivos, selectivos y diferenciales.
12. Mencione los sistemas de anaerobiosis que se pueden utilizar para el crecimiento y aislamiento de estos microorganismos
Estufa de anaerobiosis: Son estufas de cultivo en las que se retira el oxígeno con una bomba de vacío y el oxígeno residual con nitrógeno gas. A menudo se añade tanto CO2 como nitrógeno a la estufa, pues muchos anaerobios necesitan cantidades pequeñas de CO2 para crecer mejor.
13. ¿En que se basa la identificación final de los microorganismos anaerobios?
Hasta donde debería llegar la identificación de los aislamientos anaerobios en un laboratorio de microbiología clínica? Probablemente es deseable una identificación lo más precisa posible. La identificación a nivel de género y especie de todos los aislamientos clínicos ayudaría a conocer con precisión su implicación en diferentes enfermedades infecciosas, su sensibilidad a los antibióticos y los posibles mecanismos de resistencia existentes. Sin embargo conseguir identificar la especie (e incluso en ocasiones el género) de todos los aislamientos es una tarea prácticamente imposible y seguramente ni siquiera necesaria. No obstante sería conveniente que al menos en algunos laboratorios con mayor capacidad se intentara su identificación con la mayor precisión posible. La dificultad en la identificación de la totalidad de las bacterias anaerobias aisladas tiene un doble origen. En primer lugar taxonómico, ya que las clasificaciones utilizadas cambian constantemente debido a la introducción de estudios geonómicos. Los análisis del RNA 16S han demostrado que muchos de los géneros definidos por caracteres fenotípicos eran muy heterogéneos y contenían géneros diversos, y que muchas especies, definidas igualmente sobre bases fenotípicas, estaban mal encuadradas en el esquema taxonómico. En segundo lugar la gran dificultad de los laboratorios de microbiología clínica estriba en el alto coste y tiempo requeridos para asignar sus aislamientos, por medio de caracteres fenotípicos, a géneros y especies definidos sobre bases genéticas, ya que es imposible recurrir de forma ordinaria a estudios del RNA 16S y a técnicas de amplificación geonómica con cebadores específicos. Cada laboratorio debe intentar estudiar tantos caracteres fenotípicos como le sea posible y que le permitan llegar a una identificación adecuada. Los caracteres fenotípicos habitualmente estudiados, aparte de los morfológicos y de sensibilidad citados, son los derivados de la actividad metabólica: producción de indol, descomposición del H2O2 (catalasa), capacidad sacarolitica y/o proteolítica, detección de determinados enzimas y caracterización de productos finales de su metabolismo.
Si se considera necesario y es posible completar, se debe comprobar o confirmar la información obtenida realizando individualmente las siguientes pruebas, indicadas en cada caso:
· Reducción de nitratos en un caldo que los posea (Veillonella, grupo B. ureolyticus/Campylobacter, Propionibacterium, Eggerthella...).
· Detección de lecitinasa y/o lipasa (Clostridium, Fusobacterium, Prevotella, pigmentadas).
· Detección de ureasa (grupos B. ureolyticus/ Campylobacter, Bilophila/ Sutterella, Clostridium). 
· Estímulo del crecimiento por determinados suplementos: (formato/ fumarato en el grupo B. ureolyticus/ Campylobacter, arginina en Eggerthella...) 
· Detección de los productos finales del metabolismo (Fusobacterium, cocos gramnegativos y grampositivos, bacilos grampositivos no esporulados y Clostridium.