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Universidad de Buenos Aires - Facultad de Medicina INMUNOHEMATOLOGIA Prof. Lic. Marcelo Pedro Russo Contenido PRIMER MOMENTO .......................................................................................... 2 Ejercitación ................................................................................................. 2 Reacciones antígeno anticuerpo, condiciones “in Vitro” ........................................ 5 Fuerzas de unión entre el antígeno y el anticuerpo ........................................... 6 Dipolo – Dipolo ............................................................................................ 7 Interacciones dipolo-dipolo inducido ............................................................... 7 Pruebas de aglutinación ................................................................................... 8 Transposición del tema .................................................................................. 10 Seis variables en las pruebas de aglutinación ................................................... 11 Revelado de la prueba de aglutinación ............................................................. 14 Afinidad y avidez no son lo mismo ............................................................... 14 Implicamos el concepto de autoinmunidad-agregación .................................... 15 A la luz del concepto básico de adsorción-elución .............................................. 17 Particularidades de los antígenos Plaquetarios .................................................. 19 Membrana plaquetaria ................................................................................... 19 Antígenos plaquetarios .................................................................................. 23 Antígenos HLA en plaquetas ........................................................................... 23 Antígenos no plaquetarios específicos (APNE) ................................................... 25 Antígenos plaquetarios Humanos (HPA) ........................................................... 26 Bases físico-químicas en la formación de complejos [antígeno- anticuerpo] Eritrocitarios y Plaquetarios La presente guía revisará la importancia y los procesos fisicoquímicos para que se produzca la interacción antígeno anticuerpo, luego nos enfocaremos desde la perspectiva in Vitro de la interacción y en un TERCER MOMENTO, como ya hemos desarrollado las generalidades sobre los aspectos particulares de la expresión de los antígenos eritrocitarios (herencia, función y nomenclatura), entonces, avanzaremos también sobre los antígenos plaquetarios, completando así el recorte-objeto de estudio, e interés de esta cátedra sobre los procesos de defensa inmune específicos que tienen lugar tras las exposiciones del huésped a antígenos eritrocitarios y plaquetarios en diversos contextos clínicos. Universidad de Buenos Aires - Facultad de Medicina INMUNOHEMATOLOGIA Prof. Lic. Marcelo Pedro Russo PRIMER MOMENTO La reacción que produce el complejo [antígeno-anticuerpo] es necesaria para que la tolerancia inmune pueda cumplirse. Ejercitación ¿Qué es la tolerancia inmune? Hemos definido antígeno y anticuerpo, sería bueno recordar ¿qué son? El sistema inmune “competente” reconocerá las moléculas de los microorganismos o de otros tejidos alogénicos (no propios) pero no todas estas moléculas tendrán la misma capacidad inmunogénica. Las más inmunogénicas son las proteínas, seguido los hidratos de carbono, los lípidos y los ácidos nucleicos sólo son inmunogénicos cuando van unidos a proteínas o a carbohidratos, hay que tener ya presente que, en la rama humoral (inmunidad líquida), pueden actuar de inmunógenos todos los tipos moleculares que acabamos de citar, mientras que en la rama celular sólo lo son las proteínas. ¿Cuáles son las variables que determinan la inmunogenecidad desde la perspectiva de la molécula? Lo primero, por dar un orden, sería su carácter de no-propio Ante todo, la molécula ha de ser reconocida como una molécula extraña, ajena al individuo. Tenemos pues, que un primer rasgo condicionador de la inmunogenicidad es el grado de falta de parecido entre el antígeno con respecto a moléculas propias. En general, moléculas que han divergido ampliamente en los distintos linajes evolutivos actúan como buenos inmunógenos en especies heterólogas. En cambio, moléculas evolutivamente conservadas como el colágeno (Una proteína de las más abundante en el cuerpo humano -25% de la proteína corporal total- abundando en tejidos conectivos fuertes y resistentes) o el citocromo c (transportador electrónico mitocondrial entre los complejos respiratorios III y IV) no son buenas inmunógenas. Por otro lado, ciertas moléculas propias pueden actuar como autoantígenos, debido a que proceden de órganos inmunológicamente privilegiados (secuestrados respecto del sistema inmune) en las fases tempranas del desarrollo (p. ej., del esperma, tejido de la córnea). El segundo aspecto que las hace inmunogénicas es el tamaño molecular En general, se puede decir que, a mayor tamaño, mayor inmunogenicidad. Sustancias de unos 100.000 dalton (Da) suelen ser buenos inmunógenos, mientras que las de menos de 5.00010.000 Da son malos inmunógenos. Le podría seguir en importancia, la heterogeneidad en la composición química Universidad de Buenos Aires - Facultad de Medicina INMUNOHEMATOLOGIA Prof. Lic. Marcelo Pedro Russo A mayor heterogeneidad de composición química, mejor inmunogenicidad. Las macromoléculas compuestas por dos o más monómeros o unidades repetitivas distintas, que se pueden unir de diferentes formas por medio de enlaces químicos como los copolímeros sintéticos repetitivos de un solo aminoácido (ej: plástico acrilonitrilo-butadieno-estireno), o los polisacáridos a base de un solo azúcar son malos inmunógenos (ej: Homopolisacáridos unidos por enlace como el tenemos el almidón y el glucógeno). La complejidad química se expresa también en si forma parte de una estructura secundaria, terciaria y cuaternaria de las proteínas. Y finalmente el cuarto factor es su degradabilidad Sólo las moléculas degradables por el hospedador son buenas inmunógenas. La inmunidad humoral y celular, dependen de la activación de los linfocitos TH, que a su vez depende de que éste reconozca antígeno degradado, procesado y presentado por moléculas MHC-II de las células presentadoras de antígeno (APC). Las moléculas no degradables no son buenas inmunógenas. Por ejemplo, polisacárido de Pneumococcus ficol, los polímeros de D-aminoácidos, polivinilpirrolidona, no pueden ser degradados por los macrófagos (éstos no tienen enzimas hidrolíticas adecuadas), por lo que no pueden ser procesados y presentados a los linfocitos TH. En general el mecanismo de reconocimiento es tipo independiente tipo 2 dando origen a respuestas IgM de baja afinidad, algo de IgG y nada de memoria. En general, las moléculas grandes e insolubles son mejores inmunógenos, ya que son mejor fagocitadas y procesadas. ¿Cuáles son las variables que determinan la inmunogenecidad desde la perspectiva del huésped? El primero a mencionar es el genotipo del receptor La influencia del genotipo del hospedador se puede comprobar en experimentos usando razas puras de animales de laboratorio. Supongamos que disponemos de una raza pura A que induce altos niveles de anticuerpos en respuesta a un determinado antígeno, y otra raza B que produce bajos niveles de anticuerpo ante ese mismo antígeno. Los individuos de la familia 1 procedentes del cruce de A x B exhiben niveles intermedios de anticuerpos al ser enfrentados con el citado antígeno. Por análisis de retrocruzamiento se comprueba que los genes que controlan la mayor o menor respuesta se cartografiabanen una zona concreta de un cromosoma, dentro del llamado complejo principal de histocompatibilidad (MHC). Las proteínas sintetizadas por dicho complejo MHC funcionan para presentar el antígenos procesado a las células T, y juegan un papel esencial en determinar el grado de respuesta a cada antígeno. Universidad de Buenos Aires - Facultad de Medicina INMUNOHEMATOLOGIA Prof. Lic. Marcelo Pedro Russo Aparte de la dotación de alelos del complejo MHC que cada individuo posee, existen otros genes que también influyen en el grado de respuesta inmune, como los que codifican el BCR, el TCR y los de las citoquinas. Será de importancia la dosis y ruta de administración del antígeno Para cada inmunógeno experimental existe un protocolo de administración más adecuado, que supone usar una determinada ruta y cierta dosis, lo que condiciona una respuesta inmune óptima. Determinar estos parámetros reviste un especial interés a la hora de la administración de las vacunas o transfundir en pequeños pulsos Dosis: 1. dosis muy bajas de Ag pueden no estimular a los linfocitos (falta de respuesta); 2. dosis demasiado altas pueden provocar un estado activo de tolerancia inmunológica, por el que los linfocitos entran en una situación de no respuesta. 3. dosis adecuadas son capaces de estimulación. 4. Un protocolo de dosis repetidas espaciadas a lo largo de varias semanas es mejor que una dosis única, porque provoca una mayor proliferación clonal de linfocitos t y B específicos. Si es lo que queremos hacer, si queremos eludir la respuesta, transfusión a paciente aloinmunizado, es bueno la primera idea. Rutas de administración: determinan a qué órgano linfoide irá a parar el antígeno. 1. Por vía oral se estimula sobre todo el MALT (tejido linfoide asociado a las mucosas ) del tracto digestivo (pero al mismo tiempo se puede inducir tolerancia sistémica) 2. Por vía parenteral A. intravenosa: el antígeno podrá quedar retenido en el bazo (transfusiones) B. intradérmica C. subcutánea: el antígeno terminará en algún ganglio regional D. intramuscular E. intraperitoneal El tercer aspecto son los adyuvantes (coadyuvantes) Los adyuvantes son sustancias o preparados químicos que, incorporados al antígeno o inyectados simultáneamente con él, hacen más efectiva la respuesta inmune. Con su empleo se logra una economía de antígeno y de tiempo, así como un mayor nivel de anticuerpos específicos. El mecanismo de acción de estas sustancias se puede explicar de la siguiente manera, el antígeno libre normalmente difunde con mucha rapidez desde los tejidos locales que rodean el sitio de inoculación, y una de sus funciones importantes es crear un reservorio o depósito del antígeno de larga vida. Las investigaciones realizadas han demostrado que virtualmente todos los adyuvantes activan o estimulan los macrófagos; éstos cuando son activados, estimulan la respuesta inmune por un incremento de la cantidad de antígeno expresado en la membrana celular y de la eficiencia de su presentación a los linfocitos. Universidad de Buenos Aires - Facultad de Medicina INMUNOHEMATOLOGIA Prof. Lic. Marcelo Pedro Russo Por otro lado, algunos adyuvantes poseen la capacidad de actuar específicamente sobre los linfocitos; pero, en general, éstas funcionan mejor si facilitan la liberación simultánea del antígeno y de sustancias inmunomoduladoras al tejido linfoide. En el nivel internacional, la lista de productos naturales y derivados de la síntesis química, con propiedades adyuvantes/inmunopotenciadoras, es cada vez mayor; Se pueden reconocer diferentes categorías de adyuvantes Ejercitación Piense y debata con un compañero la siguiente proposición: ¡Es re-fácil hacer una reacción de rechazo de moléculas extrañas! Piense en términos de: ¿Cuáles son las variables que determinan la inmunogenecidad de un antígeno y cuáles el potencial de respuesta inmune del huésped? SEGUNDO MOMENTO Reacciones antígeno anticuerpo, condiciones “in Vitro” Si caemos de polizontes en cualquier mesa de trabajo de cualquier laboratorio de inmunohematología veremos sin sorpresa ciertos instrumentos/elementos básicos: centrífuga, pipeta, baño térmico húmedo, reloj-timer, termómetro, tubos de ensayo, platinas o portaobjetos y alguna heladera con reactivos; ¡entonces, listo! estoy en un laboratorio de inmunohematología. Universidad de Buenos Aires - Facultad de Medicina INMUNOHEMATOLOGIA Prof. Lic. Marcelo Pedro Russo No veremos siempre un microscopio, placas de cultivo, incubadoras - esterilizador, mecheros, probetas, esto es porque en inmunohematología casi toda la práctica de rutina emplea sólo una forma de visualización de la interacción antígeno-anticuerpo en vidrio o plásticos y es la “aglutinación”. Esta reacción que ocurre sin consecuencias más que el agrupamiento de células u ocurre previamente a la hemólisis (pérdida de hemoglobina), se emplea para el agrupamiento de los antígenos de grupos sanguíneos, para conocer el estado de la compatibilidad entre donador-receptor, para conocer si un paciente está inmunizado a algún antígeno eritrocitario o plaquetario, para conocer si una gestante se ha inmunizado, para saber si los hematíes son portadores de una anticuerpo autólogo anclado en la membrana, es decir que, conociendo cual es el fundamento de la pruebas de aglutinación/hemólisis podrán manejar casi todas las técnicas de uso habitual en el laboratorio, sea cual fuere el soporte de revelado de la reacción: por señalar algunos: portaobjetos, geles, perlas, matrices de fijación y microplacas. Fuerzas de unión entre el antígeno y el anticuerpo Son básicamente y en principio interacciones desde el punto de vista inmune inespecíficas, entre las que encontramos cuatro esenciales de índole físico-químicas, Las primeras, fuerzas electrostáticas, estas se deben a la atracción entre grupos iónicos de cargas opuestas en las dos cadenas laterales proteicas que van a tomar contacto. Se establecen entre iones de igual o distinta carga: Los iones con cargas de signo opuesto se atraen y los iones con cargas del mismo signo se repelen. La magnitud de la fuerza electrostática viene definida por la ley de Coulomb La fuerza es inversamente proporcional al cuadrado de la distancia entre las dos cargas, existiendo una constante dieléctrica del medio conocida puede calcularse. A medida que el antígeno y anticuerpo se acercan aumenta la fuerza de atracción. También se expulsan moléculas de agua que aumentan la fuerza resultante. Con frecuencia, este tipo de interacción recibe el nombre de puente salino. Son frecuentes entre una enzima y su sustrato, entre los aminoácidos de una proteína o entre los ácidos nucleicos y las proteínas. Otra parte importante de la fuerza de unión son las uniones puentes de hidrógeno. La formación de puentes reversibles entre grupos hidrófilos, estos enlaces son débiles, pero alcanzan para contribuir a reducir la constante dieléctrica favoreciendo la interacción antígeno-anticuerpo. En el enlace por puente de hidrógeno, la atracción existe entre un átomo de hidrógeno (carga positiva) con un átomo pequeño muy electronegativo, como flúor(F), oxígeno (O) o nitrógeno (N) (F-H, O-H, N-H), que posee un par de electrones libres (carga negativa), de ahí el nombre de "enlace de hidrógeno", que no debe confundirse con un enlace covalente a átomos de hidrógeno. Un puente de hidrógeno es en realidad una atracción dipolo-dipolo entre moléculas que contienen esos tres tipos de uniones polares. Este tipo de atracción tiene solamente una tercera parte de la fuerza de los enlaces covalentes La tercera que mencionaremos son las fuerzas hidrófobas, del mismo modo que dos gotas de aceite en agua se congregan para formar una másgrande, en este caso Universidad de Buenos Aires - Facultad de Medicina INMUNOHEMATOLOGIA Prof. Lic. Marcelo Pedro Russo anticuerpo y antígeno (componentes proteicos) son propulsados por el agua, lo que aumenta sus chances de formar puentes de hidrógeno. En un medio acuoso, las moléculas hidrofóbicas tienden a asociarse por el simple hecho de que evitan interaccionar con el agua. Lo hace por razones termodinámicas: las moléculas hidrofóbicas se asocian para minimizar el número de moléculas de agua que puedan estar en contacto con ellas. Por último, nombramos a las fuerzas de Van der Waals, estas incluyen 1) Fuerzas dipolo permanente-dipolo permanente (fuerzas de Keesom), 2) Fuerzas dipolo permanente-dipolo inducido (fuerzas de Debye), 3) Fuerzas dipolo inducido instantáneo-dipolo inducido (fuerzas de dispersión de London). Estas fuerzas dependen de la nube de electrones externas, la fuerza de atracción es inversamente proporcional a la séptima potencia de la distancia. Las formas complementarias de la nube de electrones en el sitio de combinación del anticuerpo con el determinante antigénico dependen del área de contacto. Dipolo – Dipolo Estas fuerzas, que se producen entre moléculas que contienen átomos electronegativos, hacen que las moléculas se vayan orientando a sí mismas, de tal forma que el extremo positivo de una molécula se dirija hacia el extremo negativo de otra En el caso de los enlaces de hidrogeno, son un tipo especialmente fuerte en interacción dipolo-dipolo particularmente fuerte. Para detallar más a fondo, una molécula es un dipolo cuando en esta existe una distribución asimétrica de los respectivos electrones debido a que la molécula está formada por distintos átomos de distinta electronegatividad , por lo tanto, como consecuencia de ello, los electrones se encuentran de manera preferible en las cercanías del átomo más electronegativo, de esta manera se crean así dos regiones o polos en la molécula, donde en esta tendrá una carga parcial negativa y en la otra con carga parcial positiva. Interacciones dipolo-dipolo inducido En esta fuerza, un dipolo permanente induce un dipolo transitorio en una molécula cercana al distorsionar su distribución electrónica. Por ejemplo, una molécula que tiene un carboxilo es atraída débilmente hacia un hidrocarburo, esto quiere decir, que las interacciones dipolo-dipolo inducido son más débiles que las interacciones dipolo- dipolo. De manera más específica se describe, cuando esta tiene un lugar entre una molécula polar y una molécula apolar, ya que, en este caso, la carga de una molécula polar provoca una distorsión en la nube electrónica de la molécula apolar y la convierte, de modo transitorio, ósea en un dipolo. Es aquí donde en este se establece una fuerza de atracción entre las moléculas. Interacciones dipolo inducido-dipolo inducido. En este tercer tipo de fuerza de Van der Waals, los movimientos de los electrones en las moléculas apolares cercanas dan lugar a un desequilibrio de carga transitorio en las moléculas adyacentes. Por lo tanto, esta interacción atractiva que se denomina fuerza de dispersión de London, es extremadamente débil. Un ejemplo de este tipo de interacción seria el apilamiento de los anillos de las bases en una molécula de DNA. Aunque individualmente débiles, estas interacciones que se extienden por toda la longitud de la molécula de DNA proporcionando una estabilidad significativa. Universidad de Buenos Aires - Facultad de Medicina INMUNOHEMATOLOGIA Prof. Lic. Marcelo Pedro Russo Estas fuerzas son consideradas fuerzas atractivas débiles, que a su vez establecen fundamentalmente entre sustancias no polares, aunque también están presentes en las sustancias polares. Estas atracciones se deben a las irregularidades que se producen en la nube electrónica de los átomos de las moléculas por efecto de la proximidad mutua. Por lo tanto, la formación de un dipolo instantáneo en una molécula origina la formación de un polo inducido en una molécula vecina de tal manera se origina una débil fuerza de atracción entre las dos. De todas las fuerzas que desempeñan un papel a nivel molecular, las fuerzas de van der Waals, son, sin duda las más débiles, pero probablemente las más universales. Ya que su acción solo resulta importante para explicar interacciones entre moléculas y átomos con orbitales saturados, donde no es probable la unión covalente adicional. Pruebas de aglutinación La aglutinación resulta de la fijación de anticuerpos a los antígenos de membranas (eritrocitarias, leucocitos, plaquetas o polímeros sintéticos), formando una red que mantiene unidas en forma más o menos estable a las células portadoras de los antígenos, en mayor o menor grado de agrupamiento. Para su estudio, el proceso lo podemos dividir en dos momentos (no lo digo en términos de tiempo, sino para explicar el proceso), sobre todo si los anticuerpos son formas IgG. En un primer momento de sensibilización los anticuerpos se unen a los antígenos en forma específica por especificidad y afinidad a nivel molecular, esta estructura quizá produzca la aglutinación si se trata de formas isotipos IgM y dependiendo del número de anticuerpos, pero pueden ser formas isotipo IgG o solo quedar recubiertos parcialmente los sitios antigénicos ofertados y requerir entonces de otra fase y contribuciones de ciertas variables como tiempo, temperatura, pH, etc., para la formación real red de “aglutinación” con diferentes grados de reactividad. Para que la reacción de aglutinación pueda darse de forma correcta es preciso que la concentración de aglutinógeno no sea excesiva con respecto a la de aglutinina y viceversa. En caso contrario se verificará el fenómeno de zona y se obtendrán resultados falsamente negativos. En el fenómeno de zona se dan tres zonas que son las siguientes: Zona 1 → esta es la zona de la reacción de aglutinación que se conoce con el nombre de prozona, en donde se produce un exceso de anticuerpos y por lo tanto la reacción de aglutinación obtenida no es del todo correcta. •Zona 2 →esta es la zona de la reacción de aglutinación conocida como zona de equilibrio, hay la misma cantidad de aglutinógeno que de aglutinina, es decir la misma cantidad de antígenos que de anticuerpos y por lo tanto es donde se lleva a cabo la reacción de aglutinación con mayor satisfacción y resultado. Esto es lo que debe de ocurrir para que se lleve a cabo una correcta reacción de aglutinación. •Zona 3 → esta es la zona de la reacción de aglutinación conocida con el nombre de postzona, en la cual lo que ocurre es que se produce un exceso de antígenos y por lo tanto la reacción de aglutinación obtenida no es del todo correcta. Universidad de Buenos Aires - Facultad de Medicina INMUNOHEMATOLOGIA Prof. Lic. Marcelo Pedro Russo Esta actividad se dará entorno a una ecuación balanceada, de oferta y demanda entre la cantidad de sitios libres de antígeno y la cantidad de anticuerpos, su tamaño, afinidad, recursos del medio iónico, etc. Esta aglutinación puede visualizarse en forma macroscópica directa, según la fuerza y estreches del vínculo entre células adyacentes se formarán muchos conglomerados de células que parecen unidas entre sí de forma física o deberá observarse mediante la participación de un puente físico-químico como la antiinmunoglobulina humana, otro anticuerpo (suero de coombs) o suero antiglobulínico SAG, luego de una serie de procesos que garanticen la validez del ensayo. Según los anticuerpos estén dirigidos contra antígenos en eritrocitos, plaquetas, leucocitos, clasificaremos las aglutinaciones en: 1) Directa o activa 2) Indirecta o pasiva 3) Inversao reversa 1) La aglutinación directa o activa es aquella reacción en donde la aglutinina (anticuerpo especifico de un antígeno presente en la suspensión de la agrupación de partículas) reacciona con un aglutinógeno (antígeno presente en la agrupación de la suspensión de partículas). Puede ocurrir en este tipo de aglutinación, que la aglutinina sea un anticuerpo incompleto (IgG) en estos casos lo que se hace es facilitar la aglutinación de la siguiente forma: •Forma 1 de facilitar la aglutinación → esta forma consiste en aumentar la viscosidad del medio en el que se encuentran las células. Esto se consigue añadiéndole a este medio sustancias tales como, la seroálbumina bovina al 30%, el dextrano o la ficina. •Forma 2 de facilitar la aglutinación → esta forma consiste en la eliminación de los residuos negativos de ácido siálico de la membrana celular. Esto se alcanza exponiendo las células a la acción de enzimas tales como la tripsina, la papaína, la bromelina o la ficina. •Forma 3 de facilitar la aglutinación → esta forma consiste en la disminución de la fuerza iónica del medio en donde circundan los hematíes, haciendo que este contenga alguna sustancia cuya solución sea de baja fuerza iónica, tal como el glicinato sódico en solución salina llamado liss. 2) La aglutinación indirecta o pasiva es aquella reacción en la que la aglutinina reacciona con un aglutinógeno que se ha transferido pasivamente a la superficie de una partícula vital o inerte, en esto el antígeno (aglutinógeno) no ha reaccionado directamente con el anticuerpo especifico (aglutinina) para dicho antígeno, sino que se ha unido previamente a una partícula provocando con ello una partícula sensibilizada aglutinina para formar el complejo antígeno (en este caso unido a una partícula sensibilizada) –anticuerpo. Universidad de Buenos Aires - Facultad de Medicina INMUNOHEMATOLOGIA Prof. Lic. Marcelo Pedro Russo En base a ello podemos decir que se denomina sensibilización al proceso mediante el cual una partícula es recubierta con antígenos conocidos como aglutinógenos, no propios de dicha partícula. Si el antígeno conocido como aglutinógeno en estas reacciones se transfiere a una superficie de una partícula vital, no inerte, es decir células, estas pueden ser fijadas mediante sustancias tales como la formalina, para su almacenamiento durante largo período de tiempo. Además, existen varios sistemas que facilitan la sensibilización de las células tales como: • Forma 1 de facilitar la sensibilización para provocar aglutinación (en partículas vitales) →en este caso lo que haremos es exponer las células a la acción de algunas sustancias, tales como ácido tánico, para facilitar la absorción del antígeno aglutinógeno cuál sea a la superficie celular • Forma 2 de facilitar la sensibilización para provocar aglutinación (en partículas vitales) →en este caso lo que haremos será emplear moléculas bifuncionales (que realizan dos funciones), tales como la bencidina binitrogenada, que primeramente se fija a la superficie celular y seguidamente fija el antígeno aglutinógeno mediante una unión covalente. 3) La aglutinación inversa o reversa es aquella reacción en donde se produce aglutinación inversa a las partículas vitales (células) o inertes (tales como las partículas de látex) por lo que no se les adhieren antígenos aglutinogenos sino anticuerpos quedando en este caso una partícula inerte tal como la partícula de látex recubierta por anticuerpos como en el caso de la hepatitis B o el agrupamiento parcial del sistema antigénico 001 (ABO) desde el suero o plasma. Ejercitación 1- Si un quejoso le dice a Ud.: ¿Cuál será el sentido de aprender sobre las fuerzas interactuantes en la formación del complejo [antígeno-anticuerpo]? Ud. ¿cómo le explicaría la utilidad de este conocimiento? 2- Haga un esquema a mano alzada indicando la diferencia entre las pruebas de aglutinación directa, indirecta y la inversa; teniendo en cuenta la situación del antígeno y del anticuerpo. Transposición del tema Esta unión [antígeno-anticuerpo] no es una condición habitual de las células rojas en la circulación, pues allí por el contrario deben permanecer aisladas unas de otras para cumplir con su propósito, sabemos que, al recubrirse el eritrocito con anticuerpos, complemento, o ambos, puede favorecerse una interacción célula-célula por reducción del potencial zeta (que normalmente causa la repulsión adecuada entre células). Cuando las células que se han aproximado en exceso son separadas por el trauma circulatorio (principalmente en el de la microcirculación); esto justifica la carga neta Universidad de Buenos Aires - Facultad de Medicina INMUNOHEMATOLOGIA Prof. Lic. Marcelo Pedro Russo negativa de la membrana eritrocitaria que exhibe gracias a residuos de ácido siálico, en cuyos sitios anclan también antígenos de grupos sanguíneos del sistema 002 (MNS). Las IgM decíamos son los grandes monstruos que exhiben 10 puntos de combinación antigénica y pueden producir, en condiciones controladas, la aglutinación de eritrocitos en forma directa; para producir en el mismo tiempo, una reacción de aglutinación con formas isotipicas IgG se requiere de la ayuda del SAG (suero antiglobulina), también de temperatura o si lo queremos antes, debemos reducir ya la fuerza iónica que generalmente envuelve a los hematíes en una suspensión de pH fisiológico. La hemólisis es también consecuencia de la fijación de anticuerpos, pero su visualización es a través de visualizar la liberación de la hemoglobina al medio que suspende los hematíes (sobrenadante), es decir el complemento activado ha lisado los hematíes. Esto puede ser en para operadores no avezados confundido con pruebas negativas, de allí la importancia de controles negativos en las pruebas de aglutinación. La reactividad = aglutinación, pero la hemolisis también es = a reactividad. Seis variables en las pruebas de aglutinación Para resumirlo en pocas palabras, el éxito de la interacción in vitro (reacción de aglutinación) antígeno-anticuerpo, dependerá de al menos de seis variables, que ajustadas en la proporción correcta, resultaran en pruebas estándares, con confiabilidad dentro de los valores predictivos positivos y negativos que se asumen entre los límites de la precisión e incertidumbre prescrita de las pruebas de aglutinación. Las variables son La temperatura, incluso verán que a cada sistema antígeno-anticuerpo tiene una temperatura óptima, las IgM reaccionan mejor a 4ºC y las IgG a 37ºC. Aunque esta sea una propiedad que ajustamos para las pruebas, lo de anticuerpos calientes y fríos es una consideración metafórica útil para las comunicaciones profesionales. La afinidad entre antígeno y anticuerpo es condición inherente a la estructura propia de la síntesis biológica de ambos componentes. Entonces, ¿se puede modificar?: NO, pero podemos proveer mejores condiciones o inhibir la exposición para interpretar los resultados como prueba inversa; de qué manera?: destruyendo o deprimiendo la expresión normal del antígeno (por ejemplo, con enzimas proteolíticas) o reduciendo la actividad del anticuerpo (por ejemplo con reactivos tiol) Una tercera variable: el pH entre 6.5 y 7.6, en este rango encontramos los mejores resultados pero por ejemplo para anticuerpos anti-Kell el pH ácido mejorará la asociación al antígeno blanco, para anticuerpos anti-D no es necesario inferior a 7.4, esto es observado en la variación de afinidad de los anticuerpos que divide las citopenias aloinmunes fetoneonatales en la enfermedad hemolítica fetoneonatal, de la típica eritroblastósis fetal, producida por los anti-K1, puesto que estas células, inmaduras, son aún más azurófilas.Universidad de Buenos Aires - Facultad de Medicina INMUNOHEMATOLOGIA Prof. Lic. Marcelo Pedro Russo Y un cuarto factor la concentración relativa del antígeno y del anticuerpo, no siempre más es mejor, en las pruebas de aglutinación puede ocurrir ausencia o disminución de aglutinación con grandes cantidades de antígeno o anticuerpo; situación denominada “fenómeno de zona” respectivamente y que puede llevar falsos negativos o reacciones débiles. Vale la aclaración, que hay que asirse a las recomendaciones del fabricante de los reactivos, pues está es la base confiable para obtener resultados precisos. Pero habrá ocasiones en que validaremos pruebas in house y deberemos ajustar el equilibrio del ensayo. Dos variables más ajustables son: la fuerza iónica del medio, al disminuir la fuerza iónica del medio, disminuye la nube de iones que recubre a los hematíes favoreciendo la unión antígeno-anticuerpo, la distancia que separa los hematíes obedece a una diferencia de potencial eléctrico entre la carga negativa de la membrana del glóbulo rojo y el medio con iones de sodio y cloruro, se llama “Potencial Zeta”(Pollak) la diferencia del potencial zeta, es una función que varía directamente con la electronegatividad de la membrana eritrocitaria(γ) e inversamente con la constante dieléctrica del medio de suspensión (D) y con la raíz cuadrada de su fuerza iónica (μ). Para ilustrarlo en unidades de medida les diré que la distancia en una IgG 14 nm promedio, el potencial Z es de 25, mientras que en una IgM es de 35 nm, y recordemos que el Glóbulo Rojo mide 7,2 um es decir 7200 nm. La ecuación para el cálculo del potencial Z = f [γ, 1/D, 1/√μ]. Hay formas decíamos de acortar esta distancia, el tratamiento de los glóbulos rojos por enzimas proteolíticas, la adición de substancias macromoleculares, el cambio de la fuerza iónica del medio, el uso de la prueba de la antiglobulina humana o prueba de Coombs, el uso de Albúmina, Dextran, Ficol, PEG y otras (macromoléculas hidrosolubles), que al poseer un extremo positivo (amínico) y otro negativo (carboxílico), cuando son añadidas al medio de suspensión de los glóbulos rojos se polarizan en el campo eléctrico (aumenta su constante dieléctrica D) y son atraídas cerca de los glóbulos neutralizando sus cargas negativas y promoviendo la dispersión de iones positivos (Na+) cerca de ellos. La disminución de este escudo de cargas positivas, baja el valor de la diferencia de potencial y disminuye la fuerza de repulsión interglobular. Las soluciones de albúmina bovina ejercen un efecto potenciador gracias a que aumentan la constante dieléctrica del medio en el que se hallan los hematíes y los anticuerpos; esto tiene como resultado la disminución del potencial Z y en consecuencia disminuye también la repulsión electrostática existente entre los hematíes cuando se hallan en suspensión en un medio salino; las concentraciones más empleadas: 30%, 22%, 6%, 3% (más usada en microplaca). El medio LISS (Low Ionic Strength Saline) es una solución de 0.2 % ClNa con glucosa al 7%, aquí la carga de iones positivos y negativos que poseen es inferior a la que contiene la solución salina fisiológica normal, por ello, la interacción de los iones del medio dificulta menos las uniones antígeno/anticuerpo (sensibilización de los hematíes) permitiendo tiempos de incubación más cortos. Las pruebas en LISS aumentan la cinética de la reacción antígeno-anticuerpo con lo que se reduce el periodo de incubación, incrementa la captación de anticuerpos por los antígenos, incrementa la velocidad de asociación antígeno-anticuerpo; disminuye el tiempo de incubación y posibilita detectar anticuerpos débiles que no pueden Universidad de Buenos Aires - Facultad de Medicina INMUNOHEMATOLOGIA Prof. Lic. Marcelo Pedro Russo detectarse por otros medios, también se logran en algunos casos la formación de aglutinados más fuertes que los producidos con otras técnicas, pero puede potenciar la detección de anticuerpos fríos de baja importancia clínica. El Polybrene es un policatión (polímero positivamente cargado), de amonio cuaternario (bromuro de exadimetrina) en cuya presencia, en baja fuerza iónica y a pH bajo, los hematíes normales agregan espontáneamente, la cual puede ser disgregada mediante citrato de sodio, si los hematíes están sensibilizados esta aglutinación persiste. Esto puede deberse a la neutralización de la carga negativa aportada por los residuos de ácido siálico que ya mencionaramos, se fundamentó en la observación que el Polybrene no afecta a las células que les falta el ácido siálico (por causas genéticas o por tratamiento con Enzimas). También se describe que las macromoléculas con moléculas cargadas en la membrana celular expulsan a las moléculas de agua que forman la capa de hidratación. Aquí el cuidado es con los problemas en la detección de ejemplares idiotipo Anti-K1. El PEG es un Polímero lineal utilizado en pruebas Inmunohematológicas, que desplaza al diluyente, por lo que aumenta la concentración de Anticuerpo. Especialmente en un medio de baja fuerza iónica, agrega los hematíes y aumenta la sensibilidad de las técnicas de detección de anticuerpos, consiguiendo la disminución del tiempo de incubación. Tiene una sensibilidad y especificidad superior a la Albúmina. La lectura solo se realiza en fase de Antiglobulina, no se debe efectuar lectura después de la incubación a 37ºC fase de sensibilización. Se pueden obtener reacciones inespecíficas con suero antiglobulina humana poliespecífica Generalmente aumenta la sensibilidad de la prueba para la detección de anticuerpos clínicamente significativos mediante la prueba antiglobulina indirecta. Empleada como aditivo, mejora la sensibilidad de las pruebas de detección de anticuerpos. La mayoría de los anticuerpos IgG se pueden detectar a niveles de potencia más bajos que por métodos convencionales. Puede requerir mayor número de lavados antes de añadir la antiglobluina. El tratamiento por enzimas proteolíticas tiene vigencia desde 1946 (Pickles), como antes hemos dicho, son capaces de retirar de la superficie del hematíe fragmentos polipeptídicos de las glicoproteínas de membrana, tales como el ácido siálico (disminuyen “γ”) y por consiguiente disminuyendo el Potencial Zeta, permitirán un mayor acercamiento de los hematíes facilitando su aglutinación por los anticuerpos de tipo IgG. De esa manera los hematíes pueden ser aglutinados por anticuerpos de clase IgG (no aglutinantes), como IgG anti-D, en medio salino. Las enzimas más utilizadas con este propósito son la bromelina, papaína y ficina. Aumentan la sensibilidad de detección de algunos antígenos (Rh, Kidd). Pero destruyen antígenos de la membrana eritrocitaria (M, N, S, Fy) aunque esto sea beneficioso para pruebas de interpretación inversa; incrementan la detección de anticuerpos fríos (de poco significado clínico). Las pruebas para la investigación de anticuerpos mediante enzimas proteolíticas son muy sensibles para determinados anticuerpos, pero tienden a dar resultados falsos positivos, por ello los anticuerpos reactivos “solo con enzimas” no suelen tener significación clínica. Universidad de Buenos Aires - Facultad de Medicina INMUNOHEMATOLOGIA Prof. Lic. Marcelo Pedro Russo Y finalmente el tiempo de incubación, es el tiempo promedio necesario para alcanzar el equilibrio de reacción entre antígeno y anticuerpo, es muy importante que la unión de las partes ocurra partiendo con los componentes a la temperatura adecuada, si la pruebas se corren a 37°C durante media hora, no podemos colocar los insumos que están a 4°-10°C y programar 30 minutos, debemos lograr que los reactivos primero alcancen la temperatura de la prueba 30-37°C y a partir de allí contamos eltiempo. Ocurre igual en ensayos de incubación a temperaturas de 4°C por 10 minutos. Revelado de la prueba de aglutinación Las pruebas pueden ser reveladas por centrifugación, en este caso la fuerza centrífuga relativa de los componentes mezclados es crucial en la lectura de la prueba, siendo variables físicas modificables en el instrumento (centrífuga) con las variables velocidad (vueltas por minuto), radio del cabezal (cm). En pruebas realizadas en tubo de vidrio o plástico, un exceso de centrifugación dará como resultado falso positivos, en el caso de técnicas en Gel (Sephadex o pruebas con partículas de sílice) ocurrirá exactamente lo contrario. Es importante contar con controles negativos y positivos respectivamente para evitar que resultados falsos pasen inadvertidos. Afinidad y avidez no son lo mismo Volviendo a la afinidad es la fuerza combinada de las interacciones no covalentes (los enlaces no covalentes son dependientes de la inversa de la distancia entre los grupos químicos implicados) y ya hablamos de fuerzas tales como puentes de hidrógeno, fuerzas electrostáticas (enlaces iónicos), fuerzas de van der Waals y enlaces hidrófobos entre un sitio de unión de antígeno y el anticuerpo (Ac) por ese epitopo. La afinidad de un anticuerpo concreto (p. ej., cuando usamos un anticuerpo monoclonal) por un epitopo (H) es la suma de todas las fuerzas atractivas y repulsivas entre un sitio de unión de ese anticuerpo y el correspondiente epitopo. Ello se puede definir a través de la correspondiente constante de equilibrio (K), según la ley de acción de masas: K= [Ac-H] / [Ac]. [H], siendo [Ac] la concentración de sitios libres de Ac y [Ac-H] la concentración de sitios ocupados del Ac. Mientras que la avidez, se denomina a la fuerza de unión entre un antígeno multivalente y un anticuerpo polivalente. Aunque depende de las afinidades individuales de cada uno de los determinantes individuales de ese antígeno, su valor es mucho mayor que la suma de afinidades. Pero, por otro lado, hay que considerar que los antígenos naturales suelen tener más de un tipo de determinante antigénico. Cuando un antígeno de este tipo entra en un individuo, éste produce un antisuero, que presenta varios tipos de anticuerpos, cada uno de ellos dirigidos a un tipo diferente de determinante antigénico del antígeno original. En este caso se habla de avidez del antisuero, que es la fuerza conjunta de los distintos anticuerpos de ese antisuero que reconocen al antígeno multivalente complejo: n Ac + mAg {Acn Agm} donde n representa la heterogeneidad del anticuerpo, y m los distintos tipos de epitopos del antígeno (Ag). Los factores que contribuyen a la avidez del antisuero son complejos, pero uno muy interesante es el derivado de la multivalencia del antígeno. Universidad de Buenos Aires - Facultad de Medicina INMUNOHEMATOLOGIA Prof. Lic. Marcelo Pedro Russo La fuerza de unión de un antígeno complejo multivalente a varios tipos de Ac es mucho mayor que la suma aritmética de las fuerzas de unión de cada anticuerpo. La avidez refleja mejor la situación fisiológica, pero la afinidad nos caracteriza lo que ocurre con cada tipo de anticuerpo concreto en su interacción con el epitopo. Durante la maduración de la respuesta humoral de producción de anticuerpos se produce no sólo una selección de anticuerpos con mayor afinidad (selección termodinámica), sino con mayor rapidez (selección cinética). Implicamos el concepto de autoinmunidad-agregación Si bien me estaré adelantando a conceptos que verán más adelante, quiero dejarle la inquietud a propósito de las pruebas de aglutinación en el contexto de autoinmunidad, pueden los primeros rasgos serológicos de autoinmunidad verse implicados en las pruebas de tipificación ABO, también en pruebas de tipificación D u otros antígenos, y entonces el primer escalón será observar el resultados de los controles autólogos y controles negativos que siempre debemos dispones para el ensayo de agrupamiento. En ocasiones se suele confundir ambas pruebas e interpretaciones, pero son bien distintas, las pruebas de autocontrol ponen en contacto: hematíes del propio paciente con su propio suero/plasma, mientras que las pruebas llamadas “control negativo (CN)” emplea los hematíes suspendidos del paciente/donante en el componente neutro del reactivo tipificador, un reactivo inerte que consiste en una solución conteniendo el mismo medio que contiene el reactivo tipificador excepto los anticuerpos. De este modo las variables de aglutinación quedarán validadas sólo cuando las pruebas de control negativo den negativas, si los respectivos controles fueran positivos se tendrán que practicar pruebas adicionales que enmarquen su etiología. No siempre el control negativo y el autocontrol ofertarán el mismo resultado ¿Por qué? Simplemente porque no tienen el mismo propósito, en el primer caso (CN) intentamos determinar si existe en el “reactivo de prueba” o en “los intervinientes del ensayo” soluciones de lavado, medios de suspensión, portaobjetos, microplacas, tarjetas, puntas de pipeta, algún determinante que favorezca la autoaglutinación y que a expensas de los anticuerpos logren este efecto sobre los hematíes; mientras que, en el segundo caso, pensamos en la participación de inmunoglobulinas presentes en plasma/suero del paciente que pudieran interferir - de algún modo- respecto de la acción esperada por los sueros hemotipificadores dando pruebas negativo o positivo falsas. En ambos, se puede compartir la experiencia de vislumbrar un rasgo de autoinmunidad, puesto que los hematíes frente al “suero neutro” podrían verse aglutinados por una IgM (autoanticuerpo), al igual que en el caso del autocontrol podríamos tener hematíes sensibilizados previamente o lograr cierta efectividad tras los minutos de incubación en las pruebas de tipificación. Los hematíes deberán ser tratados (lavados) a fin de evitar su aglutinación espontánea. El caso del autocontrol positivo servirá de guía para una posterior interpretación. Pero diferenciar la autoaglutinación de las células rojas a causa de anticuerpos y el llamado efecto o fenómeno de Rouleaux es encontrar una punta sencilla del ovillo, esta formación de pilas de monedas se observa fuertemente en las hiperproteinemias Universidad de Buenos Aires - Facultad de Medicina INMUNOHEMATOLOGIA Prof. Lic. Marcelo Pedro Russo (mieloma múltiple) y macroglobulinemias, también aparece en enfermedades infamatorias crónicas, pero no debe ser confundido con la autoaglutinación (que es provocada por autoanticuerpos). La agregación eritrocitaria, es el factor celular más importante en la determinación de la viscosidad sanguínea a bajas velocidades de flujo, refleja un delicado balance entre las fuerzas de adhesión celular (debidas a la adsorción de macromoléculas y a la creación de puentes entre los eritrocitos) y el efecto de las fuerzas de desagregación (como las fuerzas de cizallamiento mecánico, la repulsión electrostática entre las células, entre otros). Cuando la velocidad de deslizamiento de los eritrocitos disminuye, éstos se agregan formando "pilas de moneda" o "rouleaux". Tal fenómeno se observa en los territorios donde la circulación sanguínea es lenta y puede revertirse con el cambio de las condiciones circulatorias; esto es, con el aumento de la velocidad del flujo sanguíneo. El ácido siálico (AS) que ya les mencioné, forma parte de oligosacáridos unidos a proteínas de membranas celulares eritrocitarias. Aproximadamente el 80% del ácido siálico en suero humano es N-acetil neuramínico (Neu5Ac; NANA). Algunas de las funciones atribuidas al ácido siálico son: ser constituyente mayoritario de la carga electronegativa de la superficie celular eritrocitaria(CAE), (la carga negativa contribuye a la repulsión celular, como dijimos, por efecto antiagregante, participando en la estabilización de glicoproteínas en circulación e impidiendo las interacciones célula-célula); además protege del ataque proteolítico por sialización de glicoproteínas; participa en el reconocimiento e interacción de mensajeros químicos en tejidos y fluidos biológicos; y son componente de receptores de la superficie celular. El dato técnico concreto que recogeremos de las pruebas directas de aglutinación con autocontroles y/o CN positivos -de ser posible- debería ser comunicado a quienes empleen métodos automáticos sobre las pruebas hematológicas como mediciones de VCM (volumen corpuscular medio) o Hematocrito (Hto) u hemoglobina (Hb), pues el acúmulo de células aglutinadas en ocasiones pasan como una sola célula a través del sistema trayendo consigo dos consecuencias, la primera es que disminuye el número total de glóbulos rojos y como consecuencia el hematocrito por este método estará falsamente reducido; y la segunda es que estos acúmulos aparecerán como células con un volumen corpuscular medio muy elevado (CVM), semejando a una anemia macrocitica. En estos pacientes se pierde la relación hematocrito-hemoglobina dado por el CHCM (coeficiente de hemoglobina corpuscular media), ya que la hemoglobina no se disminuye del mismo modo, así mismo la HCM (hemoglobina corpuscular media) está aumentada. Por otro lado, si los campos aglutinados son muy grandes (mayor a 360 fl.) quedarán fuera del histograma y del recuento, produciendo una falsa disminución de células sin afectar el VCM. Para investigar la formación de Rouleaux (FR) emplearemos pocos elementos: una centrífuga calibrada, un microscopio, algunos tubos, pipeta y solución salina al 0.9%; mezclaremos 1 gota de los hematíes que sospechamos FR/suero sobre un portaobjeto, observaremos al microscopio las características de agregación (apilamiento); luego calentaremos la solución salina a 37°C y añadimos 1 gota de salina caliente, observando al microscopio si la aglutinación se dispersa. Universidad de Buenos Aires - Facultad de Medicina INMUNOHEMATOLOGIA Prof. Lic. Marcelo Pedro Russo Estaremos listos entonces para controlar este fenómeno espontáneo lavando las células del control negativo y del autocontrol con solución a 37 °C y eliminando por completo el sobrenadante de plasma. Este dato que les doy, es de exclusiva aplicación práctica del concepto, y como les decía antes, es importante compartirlo más durante la cursada y observarlo a propósito de casos clínicos. A la luz del concepto básico de adsorción-elución La interacción antígeno-anticuerpo es reversible in vitro, esta reversibilidad nos resulta útil para para concentrar la actividad de los anticuerpos de una determinada especificidad y restar la actividad de otro idiotipo o isotipo (componente heterófilo) en el suero/plasma o para poder tipificar/explorar hematíes que están recubiertos in vivo de inmunoglobulinas. La elución, consiste en utilizar métodos físicos o químicos para deshacer la unión antígeno-anticuerpo (anticuerpos previamente adsorbidos) y recuperar el anticuerpo, concentrada así la cantidad de anticuerpos en menor volumen del eluido. El eluido es el sobrenadante de la reacción de elución y contiene el anticuerpo, si ha sido escindido en el proceso, es decir si previamente estaba fijado al antígeno blanco (adsorción: alogénica u autóloga). Con el estudio del eluido se puede conocer la naturaleza de las Inmunoglobulinas fijadas a los hematíes del paciente y excluir mezclas de anticuerpos. Algunos métodos de elución preservan la estructura del hematíe otros la destruyen. ¿Para que querría preservar la estructura de la membrana del hematíe?: si después de efectuada la elución la prueba directa de antiglobulina es negativa, los hematíes todavía se pueden utilizar para efectuar la tipificación de antígenos que requieran fase antiglobulínica y/o también en caso de disponer de suficiente cantidad de ellos, se pueden utilizar para realizar nuevas auto-adsorciones y eluciones y obtener mayor número de anticuerpos. Se han descrito varios métodos de elución, que no desarrollaré aquí por la economía, nivel, profundidad y orientación de este encuento, pero nombrarlos no les vendrá nada mal: Calentamiento a 56ºC – Éter – Difosfato de Cloroquina –Cloroformo Tricloroetileno – Glicina-Percoll – ZZAP – Ácido Cítrico (elución ácida), todos estos serán de elección, según aquellos que preserven mejor el medio que deseamos estudiar, si tenemos como propósito mantener la integridad de los hematíes o como dijimos, si necesitamos concentrar la actividad del anticuerpo en el eluido. Hay muchas otras pruebas que emplean los principios de la aglutinación, como por ejemplo cuando deseamos ponderar la importancia clínica de un anticuerpo y empleamos: pruebas funcionales de eritrofagocitosis y pruebas de titulación (semicuantifiación relativa a la especificidad de un anticuerpo) o pruebas de inhibición. Universidad de Buenos Aires - Facultad de Medicina INMUNOHEMATOLOGIA Prof. Lic. Marcelo Pedro Russo Ejercitación 1- ¿Porque pensamos que el pH, la temperatura, la cantidad de antígeno, el tiempo, la fuerza de centrifugado y el isotipo molecular, entre otras variables, tienen un impacto en la magnitud de la aglutinación? 2- Parece importante lavar los hematíes en las pruebas de aglutinación directa, ¿para qué? 3- ¿Cómo explica el fenómeno de Rouleaux? 4- ¿Qué es el fenómeno de zona? 5- ¿Por qué decimos que, afinidad y avidez no son lo mismo? Ejercicio práctico Prueba de aglutinación directa de eritrocitos por anticuerpos ABO en “técnica directa en portaobjetos” 1- Complete la lista y describa los reactivos necesarios empleados en la prueba • Sueros anti-A, anti-B, Anti-AB • Tampón salino 2- Describa la técnica que empleará para la extracción del ejemplar (digito punción) • Colóquese los elementos de protección personal • Seleccione el dedo donde realizará la punción y aplique una técnica de asepsia (Primero con alcohol etílico 70% o iodo, luego con algodón seco) • Quite el protector a la lanceta o aguja, realice la punción (recomendado: sobre el pulpejo lateral del extremo distal de dedo izquierdo) 3- Describa la técnica de aglutinación • Con cada espátula (tres) recoja parte de la gota de sangre extraída y en forma de círculos concéntricos, mezcle cada una con el reactivo correspondiente (anti-A, Anti-B, Anti-AB, Control Negativo y Auto control). • Inmediatamente y al cabo de 10-60 segundos observe la aglutinación (positivo) y la no aglutinación (negativo) 4- Construya una planilla con los resultados 5- Interprete los resultados de la aglutinación 6- Responda Anticuerpos Anti – A Anti - B Anti - AB Controladores Control negativo autólogo Control negativo de la prueba Universidad de Buenos Aires - Facultad de Medicina INMUNOHEMATOLOGIA Prof. Lic. Marcelo Pedro Russo a. ¿Qué sucede si empleo una sola espátula para todas las pruebas? b. ¿Qué sucede si no empleo guantes? c. ¿Cómo debo descartar el elemento de punción? d. ¿Por qué empleo una torunda seca y otra en alcohol? e. ¿Qué dedo seleccionaría de ser posible y por qué? f. ¿Qué representa una prueba positiva desde el punto de vista de la aglutinación? g. ¿Qué representa una prueba negativa desde el punto de vista de la aglutinación? h. ¿Por qué emplearía controladores? i. ¿Por qué cree que no ha podido completar las pruebas para conocer el grupo sanguíneo ABO del sujeto al que le ha realizado la prueba? En resumen, se han explicado lasfuerzas que interviene en la formación del complejo antígeno-anticuerpo, su importancia e implicancia en el campo de la inmunohematología. TERCER MOMENTO Particularidades de los antígenos Plaquetarios Nos han guiado clases precedentes para pensar ¿qué es un antígeno?, ¿cómo es químicamente un antígeno de grupo sanguíneo?, ¿qué funciones biológicas tienen los que se encuentran en los eritrocitos? y ¿cómo se clasifican internacionalmente? Ahora vamos a revisar los mismos aspectos, pero sobre la expresión de los antígenos en las membranas de las Plaquetas. Los antígenos plaquetarios al igual que en los eritrocitos son el resultado de polimorfismos genéticos de genes que contienen los códigos de los aminoácidos de las glicoproteínas de la membrana plaquetaria, residen en ella, antígenos a los que llamamos plaquetarios específicos o Plaquetarios Humanos (HPA), pero también hay un conjunto de antígenos que pertenecen al sistema mayor de histocompatibilidad o también llamado (HLA) por Antígenos Leucocitarios Humanos y otro grupo de antígenos a los que llamamos no específicos de la plaqueta (APNE) Los principales orgánulos de la plaqueta son la membrana plasmática, el citoesqueleto, el sistema canalicular abierto, el sistema tubular denso y los gránulos. Sin embargo, están presentes otros, incluyendo mitocondrias y gránulos de glucógeno. Nosotros nos enfocaremos en la membrana. Membrana plaquetaria La importante participación de las plaquetas en el proceso de formación del trombo arterial que permite frenar los sangrados, determina el interés que despierta generalmente el conocimiento Universidad de Buenos Aires - Facultad de Medicina INMUNOHEMATOLOGIA Prof. Lic. Marcelo Pedro Russo de sus características estructurales y funcionales, todo esto lo sabemos por el gran Giulio Bizzozero (1882). Aunque él le reconoció méritos precedentes a Max Schultze (1865). Notai. Pero dentro de nuestro universo, lo que resulta bajo la lupa, es su estructura para el anclaje de los antígenos que serán blanco de anticuerpos y traerán problemas en procesos transfusionales, en presencia de fenómenos de autoinmunidad y plaquetopenias aloinmunes neonatales. Las plaquetas son derivados de la ruptura de células producto de la megacariocitopoyésis de la médula ósea, resultan entonces en pequeñas células anucleadas que, en condiciones fisiológicas normales, tienen la forma de disco biconvexo, con un diámetro aproximado de 3 µm. De la masa plaquetaria total, cerca de 2/3 circulan en la sangre, encontrándose las restantes retenidas en el bazo. En ambientes fisiológicos normales, no se adhieren a la superficie endotelial, ni entre ellas, debido al equilibrio existente entre los mecanismos pro- y anti-trombóticos. Pero cuando se produce una injuria, se adhieren a las estructuras subendoteliales expuestas, son activadas y se agregan unas a otras, constituyendo, así, una parte esencial del tampón hemostático primario. No sólo el endotelio roto, expuesto, las activa, diversas sustancias pueden hacerlo, cuando hablamos de activación nos referimos a ciertas variables como la adhesión, el cambio de forma, la agregación, la secreción de sustancias pro-coagulantes como activar la producción de protrombina y el factor X e inhibidores de la fibrinólisis para que la malla permanezca estable. La membrana plasmática, como ocurre con las células rojas, de las que hablamos inmediatamente antes y en otras células, es la interface donde se dan interacciones con el medio externo, ocupando, por eso, un papel central en su fisiología. En este caso no deja de ser típica, es decir contiene determinados fosfolípidos, glicolípidos y glicoproteínas. Los fosfolípidos son particularmente ricos en ácido araquidónico, el ácido graso precursor de la síntesis de eicosanoides, sustancias implicadas en la transmisión de las señales recibidas en la membrana. Se distribuyen asimétricamente en la bicapa y los que poseen carga negativa, tales como el fosfatidilinositol, fosfatidilserina y fosfatidiletanolamina se localizan preferentemente en la capa interna. Esta distribución tiene, también, un significado funcional, ya que sirven como sustratos para enzimas intracelulares (fosfolipasas) durante la activación plaquetaria. Algunos fosfolípidos y sus derivados tienen propiedades agregantes, sobre todo el factor activador de plaquetas (PAF), o actividad procoagulante, como es el caso del factor plaquetario 3 (PF3), y se tornan accesibles cuando la plaqueta es activada, debido a una reorganización de los componentes de la membrana. Decíamos que también la membrana plaquetaria contiene un gran número de glicoproteínas con una o más cadenas ramificadas de polisacáridos, que forman una cubierta exterior o "glicocálix", que confiere una carga negativa a la superficie de la plaqueta. Durante el proceso de secreción, se produce la fusión de las membranas de los gránulos intraplaquetarios con la membrana plasmática a través del sistema canalicular abierto, lo que permite la exposición de antígenos internos en la superficie de la plaqueta. Glicoproteínas como la GMP140, que existe sólo en las membranas de los gránulos α, y la GP53 de la membrana de Universidad de Buenos Aires - Facultad de Medicina INMUNOHEMATOLOGIA Prof. Lic. Marcelo Pedro Russo los lisosomas de las plaquetas en reposo, pasan a expresarse en la superficie después de la activación y secreción de las plaquetas. Así, la composición de la membrana plasmática depende del estado de activación de la plaqueta. Las glicoproteínas clásicas han sido subclasificadas en distintas familias: integrinas, glicoproteínas ricas en leucina y selectinas. Las glicoproteínas de la membrana plaquetaria actúan como receptores, mediando, entre otras, en tres importantes funciones: en la adhesión de las plaquetas a componentes de la matriz extracelular de la pared vascular, en la agregación plaquetaria y en la interacción de las plaquetas con otras células y son las que tendrán interés para nosotros pues poseen los antígenos plaquetarios humanos anclados en ellas. • Receptores de la familia de las integrinas Las integrinas son una familia de glicoproteínas de la membrana implicadas en interacciones célula-matriz o célula-célula. Son heterodímeros constituidos por dos subunidades, α y ß, y para la mayoría de estos receptores el lugar de reconocimiento en el ligando es el tripéptido Arg-Gly-Asp (RGD). Este grupo incluye cinco receptores de la membrana plaquetaria: GPIIb/IIIa, GPIa/IIa, GPIc/IIa, GPIc'/IIa y el receptor de la vitronectina. El complejo GPIIb/IIIa es la integrina más abundante y se encuentra en forma de heterodímeros αIIßb3, dependientes de calcio. Su función principal es la de receptor para el fibrinógeno, mediando la agregación plaquetaria. Las plaquetas normales contienen alrededor de 50.000 complejos GPII/IIIa en la membrana plasmática; no obstante, otros de estos complejos están presentes en las membranas del sistema canalicular abierto y de los gránulos a, y pueden expresarse en la superficie, después de la activación de las plaquetas. Actúa como receptor para otras proteínas adhesivas, además del fibrinógeno, tales como la fibronectina, el factor de von Willebrand (vWF) y la vitronectina. A través de uniones con estas proteínas adhesivas, interviene en el proceso de adhesión al subendotelio. Estos complejos solamente adquieren capacidad para interactuar con las proteínas adhesivas, después de la activación de la plaqueta. Tras la activación hay un incremento del número de complejos expuestos en la superficie, así como un incremento de su actividad resultante de alteraciones conformacionales que conducen a la exposición de los lugares de unión. El reconocimiento de los ligandos por el heterodímeroimplica la secuencia RGD y requiere Ca2+ y Mg2+. La unión al fibrinógeno induce otras alteraciones conformacionales en el complejo, las cuales son responsables de la transmisión de señales al interior de la plaqueta. La participación del complejo en la transducción de la señal después de la activación celular, incluye la regulación de la fosforilación de tirosinas, intercambio de Na+/H+, aglomeración de proteínas del citoesqueleto y entrada de calcio a través de la membrana. Por otra parte, el complejo GPIIb/IIIa Universidad de Buenos Aires - Facultad de Medicina INMUNOHEMATOLOGIA Prof. Lic. Marcelo Pedro Russo interviene en la retracción del coágulo, uniendo la red de fibrina extracelular al aparato contráctil intracelular. Por todo lo expuesto, podemos concluir que la presencia de GPII/IIIa es imprescindible para que haya agregación plaquetaria y hemostasia normal. Este hecho se evidencia en la enfermedad hemorrágica congénita designada por trombastenia de Glanzmann determinada por la falta de este complejo funcional. Desde el punto de vista inmunohematológico el complejo GPIIIa será el sitio de residencia de la mayoría de los antígenos HPA, como veremos inmediatamente. El complejo GPIa/IIa es el receptor para el colágeno, corresponde al heterodímero α2ß1 y está presente en la plaqueta en un número aproximado de 2.000 moléculas por célula. Este receptor funciona en el proceso de adhesión a la matriz extracelular, y también está implicado en la agregación de las plaquetas inducida por el colágeno. La unión al colágeno depende de Mg2+ y Mn2+, también será portador de antígenos HPA. El GPIc/IIa, GP Ic'/IIa y el receptor de la vitronectina, corresponden a las integrinas minoritarias de la membrana plaquetaria α5ß1, α6ß y αVß, y son, respectivamente, los receptores para la fibronectina, laminina y vitronectina, no veremos antígenos HPA allí. • Glicoproteínas ricas en leucina (LRG) A la familia de las glicoproteínas ricas en leucina pertenecen proteínas con funciones muy diversas, que tienen en común la presencia de un número variado de copias de un segmento, con una secuencia de 24 residuos de aminoácidos rica en leucina (LRG). En este grupo está incluido el complejo GPIb/IX/V de la membrana plaquetaria, donde sí residirán antígenos HPA. El complejo glicoproteico GPIb/IX/V es un receptor específico implicado en la adhesión y agregación plaquetaria. Es el principal responsable de la adhesión de las plaquetas al subendotelio en zonas vasculares donde prevalecen condiciones de flujo caracterizadas por una elevada tensión de cizallamiento. Éste complejo interactúa con las estructuras subendoteliales, principalmente con el colágeno, a través de un ligando adhesivo, el factor de von Willebrand (vWF). El vWF es una proteína multimérica constituyente de la matriz subendotelial, que está presente en los gránulos a de la plaqueta, desde donde es secretado durante la activación, y circula en la sangre formando un complejo con el factor VIII de la coagulación (FVIII:c). El receptor GPIb/IX/V también funciona como lugar de unión de alta afinidad para la trombina, participando en la propagación de la respuesta a este importante agonista en la activación y agregación plaquetaria. Se estima que el número de moléculas de este complejo se aproxima a 25.000 / plaqueta, siendo la segunda glicoproteína más abundante de la membrana citoplasmática. La GPIb es la principal sialoglicoproteína de la membrana de las plaquetas y, como tal, es responsable en gran medida de la carga negativa de las plaquetas y de su comportamiento electroforético. Aproximadamente el 70% de la GPIb total de la membrana está asociada a la actina y esta asociación al citoesqueleto puede estar relacionada, tanto con el mantenimiento de la forma de la plaqueta, como con la función de unión del vWF. En las plaquetas en reposo, el complejo está Universidad de Buenos Aires - Facultad de Medicina INMUNOHEMATOLOGIA Prof. Lic. Marcelo Pedro Russo unido al citoesqueleto a través de la proteína ligadora de actina (ABP) y su exposición en la superficie disminuye después de la activación. La fosforilación de receptores de la membrana puede constituir un importante mecanismo de transducción de la señal después de la unión del respectivo ligando. Sin embargo, la fosforilación de esta proteína no parece estar implicada en la transmisión de la señal ni en la activación plaquetaria. Al contrario, existen evidencias de que la fosforilación de la serina 166 en el dominio citoplasmático de la GP Ibb puede ser, en parte, responsable del mantenimiento de la plaqueta en estado de reposo. El complejo GPIb/IX/V es esencial para la normal adhesión y activación plaquetaria, lo que se evidencia en los pacientes deficientes en este complejo. Tales alteraciones resultan de anomalías congénitas, conocidas como síndrome de Bernard-Soulier, y conducen a una tendencia hemorrágica, la cual puede ser extremamente severa. • Otros receptores La GPIV es una glicoproteína mayoritaria de la membrana plaquetaria y funciona como receptor para la trombospondina, y para las fibrillas de colágeno del tipo I. Existen alrededor de 23.000 moléculas de GP IV por plaqueta, encontrándose la mayor parte de éstas en la membrana citoplasmática de la plaqueta en reposo. Recientemente se demostró la presencia de esta glicoproteína en la membrana de los gránulos a, y el aumento de su expresión en la superficie después de la estimulación de las plaquetas con trombina, no la veremos implicada en el anclaje de antígenos HPA. Antígenos plaquetarios Los antígenos representados en las plaquetas, se pueden clasificar como específicos, llamados antígenos plaquetarios humanos (acrónimo HPA), los antígenos propios del sistema mayor de histocompatibilidad (acrónimo HLA) y los antígenos no específicos de la plaqueta como los que residen al mismo tiempo en eritrocitos de seis Sistemas de Antígenos diferentes. Antígenos HLA en plaquetas La función principal de estas estructuras es la regulación de la respuesta inmune mediante una unión al receptor de células T durante la presentación de antígenos, o el reconocimiento de lo propio en el cuerpo, o a receptores inhibidores en las células NK. La región que nos interesa por su expresión en las plaquetas son las pertenecientes a la zona del HLA-I que comprende los genes del HLA-A, -B, y - C, cuyos productos, cadenas, son expresados en la amplia mayoría de las células nucleadas y plaquetas. Los antígenos HLA- A y HLA-B en las plaquetas están diez veces más representados que los antígenos HLA-C. El significado clínico transfusional que le otorgamos es la condición de refractariedad plaquetaria, las reacciones Universidad de Buenos Aires - Facultad de Medicina INMUNOHEMATOLOGIA Prof. Lic. Marcelo Pedro Russo febriles postransfusionales, la patogenia de la lesión pulmonar aguda TRALI y la enfermedad del injerto contra huésped pos transfusional. Serán abordadas más adelante. La molécula del Clase I es un heterodímero de 44 KDa y KDa. Está prácticamente en todas las células presenta LT CD8+. Une péptidos de 8 a 10 residuos, heredado por acción de genes en la región telomérica del cromosoma 6 (6p21). Al describir la estructura de las moléculas MHC-I encontramos una cadena que posee una cola citoplásmica (carboxi-terminal), de unos 30 aminoácidos, un segmento transmembranal hidrófobo, de unos 40 aminoácidos, y tres dominios extracelulares, cada uno de unos 90 aminoácidos: uno proximal ( 3), que es de tipo Ig, dotado de su puente disulfuro característico, y dos distales ( 2, 1), dotado el a 2 de un puente disulfuro. La cadena 2-microglobulina posee un solo dominio globular de tipo inmunoglobulina, y se asocia no covalentemente con eldominio a 3 de la cadena larga. La cristalización y consiguiente análisis por difracción de rayos X del complejo soluble (es decir, la porción extracelular, escindida por papaína) demuestra los siguientes detalles estructurales: Los cuatro dominios (tres de la cadena y el único de la 2-m) interactúan dos a dos: Interacción 1- 2: Los dos dominios más externos ( 1 y 2), que son polimórficos, interactúan para generar una notable estructura tridimensional: una plataforma plana formada por 8 cadenas antiparalelas, de la que sobresalen, abarcándolas, dos largas hélices a ligeramente arqueadas (pensemos alguna imagen: Una pizza, con dos palmitos parados verticalmente) Dicha estructura deja un surco profundo entre las dos hélices , que tiene unas dimensiones de 25x10x11C. Este surco o hendidura es el sitio destinado a albergar el péptido procesado: tiene una capacidad para péptidos entre 8 y 20 aminoácidos. Interacción 3 - 2-m: Estos dos dominios sólo interaccionan mediante enlaces nocovalentes, siendo ambos típicos dominios globulares de tipo Ig, estabilizado cada uno por en característico enlace disulfuro intracatenario. El dominio 3 está bastante conservado entre las moléculas MHC-I, y contiene una secuencia que será reconocida por la molécula CD8 de la membrana de los linfocitos T CD8+. La 2-microglobulina interacciona ampliamente con el dominio a 3, y con algunos aminoácidos de a 1 y a 2. Todas estas interacciones son necesarias para que la MHC-I adquiera su configuración cuaternaria adecuada para cumplir su misión. Aparte de estas interacciones, es importante aludir al hecho de que cuando el péptido procesado se une a la hendidura de los dominios a 1+ 2 esto favorece a su vez que el dominio 3 interaccione correctamente con la 2 microglobulina. La nomenclatura de los antígenos del Sistema de Mayor de Histocompatibilidad tiene su regla, así lo ejemplifico en un caso de un antígeno HLA-A Universidad de Buenos Aires - Facultad de Medicina INMUNOHEMATOLOGIA Prof. Lic. Marcelo Pedro Russo Las especificidades antigénicas producto HLA-A está en 28, con una cantidad superior a los 767 alelos, los HLA-B son 62 especificidades con más de 1178 alelos, los HLA-C de 10 especificidades antigénicas tiene 618 alelos. Volveremos sobre este tema al desarrollar el eje de inmunidad refractaria a la transfusión de plaquetas. Antígenos no plaquetarios específicos (APNE) Se encuentran formando parte de la porción glucídica de las glicoproteínas plaquetarias (GP) intrínsecas (Ib, IIa, IIb, IV, V, moléculas de adhesión endotelial PECAM-1 y CD109). Son adsorbidos pasivamente de la fracción glicolípidica del plasma. Los cubriremos en esta clase por su importancia en eventos inmunes de origen transfusional, episodios febriles y bajos incrementos plaquetarios postransfusionales (hasta en un 20% con plaquetas ABH incompatibles). Los antígenos representados son los del Sistema ABO (001), los del sistema de antígenos Lewis (007), el antígeno I del sistema (027) y de la Colección 207 el i (207002), los del Sistema P1Pk (003) y antígenos Cromer (021). Los antígenos están residiendo en cuatro estructuras formadas por las glicoproteínas: GPIIb, GPIIIa, GPIb y GPIa y en la estructura CD109. Universidad de Buenos Aires - Facultad de Medicina INMUNOHEMATOLOGIA Prof. Lic. Marcelo Pedro Russo Antígenos plaquetarios Humanos (HPA) Representación gráfica antígenos plaquetarios humanos (HPA) Para tomar la nomenclatura, les diré que el Platelet Nomencalture Committee (PNC) se crea en convenios colaborativos, para trabajar sobre plataformas comunes con la International Society of Blood Transfusion (ISBT) y generar diferentes working party junto a un subcomité de inmunología plaquetaria en la International Society on Thrombosis and Haemostasis (ISTH). El sistema de nomenclatura HPA particularmente se adoptó en 1990 (AEG von dem Borne y F Decary, como decíamos lo realizo un grupo de trabajo combinado de la ICSH / ISBT sobre serología plaquetaria y fue publicado por Vox Sanguinis (1990), 58: 176. Esto logró superar los problemas con la nomenclatura anterior. Desde entonces, se han descrito más antígenos y se han resuelto las bases moleculares de muchos. Como resultado, la nomenclatura se revisó en 2003 publicado por P Metcalfe, NA Watkins, WH Ouwehand, C Kaplan, P Newman, R Kekomaki, M de Haas, R Aster, Y Shibata, J Smith, V Kiefel, S Santoso, también en Vox Sanguinis (2003) 85: 240-245. En la actualidad, se han definido serológicamente más de una veintena de antígenos plaquetarios. Un único polimorfismo de nucleótido (SNP), caracterizado por la sustitución de un aminoácido, está presente en la mayoría de ellos, con excepciones, como las del HPA14bw. Dieciocho antígenos (18) HPA se agrupan en nueve sistemas bi-alélicos (HPA-1 a HPA-5 y HPA-9 a HPA-10 y HPA-15), donde la presencia de anticuerpos alélicos ocurre no solo para el alelo (a: común) sino para el alelo (b: menos común). Para los otros antígenos, solo se detectaron anticuerpos para el alelo b y se coloca la nomenclatura w. Universidad de Buenos Aires - Facultad de Medicina INMUNOHEMATOLOGIA Prof. Lic. Marcelo Pedro Russo Antígenos HPA, frecuencia, alelos. Sin estudios de frecuencia, pero con casos clínicos reportados, encontramos una serie más de antígenos plaquetarios específicos. Otros antígenos HPA reportados Antígeno Publicación HPA-18w Bertrand et al, Transfusion 49: 2076-83 (2009) HPA-19w Peterson et al, Transfusion (2009) HPA-20w Peterson et al, Transfusion (2009) HPA-21w Peterson et al, Transfusion (2009) HPA-22bw Peterson et al, Transfusion (2012) HPA-23bw Peterson et al, Transfusion (2012) HPA-24bw Jallu et al, Transfusion (2011) HPA-25bw Kroll et al, Transfusion (2011) HPA-26bw Sachs et al, Thromb Haemost (2012) HPA-27bw Jallu et al, Transfusion (2013) HPA-28bw Poles et al, publicado en línea (2013) HPA-29bw Sullivan et al, Transfusion (2015) Los HPA están localizados en receptores en la membrana plaquetaria, anclados en proteínas plaquetarias específicas, como abran notado en el esquema gráfico. Los cromosomas que Universidad de Buenos Aires - Facultad de Medicina INMUNOHEMATOLOGIA Prof. Lic. Marcelo Pedro Russo participan no son muchos, en la siguiente tabla les comunico el gen responsable del cambio de nucleótido que da lugar a la herencia de un antígeno sobre la proteína de anclaje. Genes, Cromosomas, Nucleótidos y Proteínas responsables de la expresión HPA Los vistos hasta aquí son aspectos teóricos significativos puesto que serán de utilidad en adelante en el análisis de casos de: TOMBOCITOPENIA ALOINMUNE FETAL-NEONATAL, TROMBOCITOPENIA AUTOINMUNE, TROMBOCITOPENIA FÁRMACO INDUCIDA, PURPURA TROMBOCITOPÉNICA, REFRACTARIEDAD A LA TRANSFUSIÓN DE PLAQUETAS, TECNICAS PARA LA FENOTIPIFICACIÓN Y COMPATIBILIDAD PLAQUETARIA Ejercitación: Responda: 1- ¿Cuántas categorías de antígenos expresan las plaquetas? 2- ¿Dónde están dispuestos esos antígenos? 3- ¿A qué llamamos situación bialélica? Dé ejemplos para HPA. 4- ¿Qué antígenos eritrocitarios se expresan también en las plaquetas? 5- Describa la nomenclatura, la GP de anclaje, el gen responsable y el cromosoma para 2 sistemas HPA. Recomendación: realice la ejercitación adjunta en intertexto, podrá ser requerida por la cátedra.
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