Preparación de medios de cultivo (tipos de medios de cultivo, tipos de esterilización, asepsia) y Mini-preparación de plásmidos (pGlo)

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Preparación de medios de cultivo (tipos de medios de
cultivo, tipos de esterilización, asepsia) y Mini-preparación
de plásmidos (pGlo)
El cultivo es el proceso de proliferación de microorganismos al proporcionarles un entorno
apropiado. Los microorganismos en proliferación producen réplicas de sí mismos y necesitan
los elementos presentes en su composición química. Los nutrientes deben proporcionar estos
elementos en una forma que sea accesible desde el punto de vista metabólico. Además, los
microorganismos requieren energía metabólica para sintetizar macromoléculas y mantener
gradientes químicos esenciales a través de sus membranas. Los factores que deben
controlarse durante la proliferación incluyen nutrientes, pH, temperatura, aireación,
concentración de sales y fuerza iónica del medio.
Tipos de medios
➔ Cultivos axênicos o puros
➔ Medios de crecimiento bacteriano
➔ Aislamiento y cultivo de microorganismos
Tipos de esterilización
➔ Radiación. +uv, infrarrojo, ionizante
➔ Calor húmedo/seco
➔ Químico
Medios de cultivo y nutrientes. Utilizamos el medio LB (Luria-Bertrani), el medio debe
contener nutrientes para el crecimiento bacteriano y expresión génica.
➔ Carbohidratos
➔ Aminoácidos
➔ Nucleótidos
➔ Sales
➔ Vitaminas
Aplicaciones e historia
Mini-preparación de plásmidos (pGlo)
Plásmidos Son moléculas de DNA de doble cadena, de tamaño pequeño y generalmente de
forma circular, que se encuentran presentes de manera libre en el citosol de muchas bacterias
(de 1 a 3,000 plásmidos x célula) y de algunos eucariontes unicelulares.
Son fáciles de purificar a partir de cultivos bacterianos y permiten la incorporación de
insertos de DNA de un tamaño máximo de ~10 Kb.
Los plásmidos naturales contienen pocos genes propios, ninguno esencial para la viabilidad
de la célula, por lo que pueden ser modificados sin afectarla.
Para su replicación autónoma , se requiere una secuencia de origen de replicación. En cada
división celular, el cromosoma da lugar a una sola copia por célula hija, mientras que el
plásmido puede sufrir múltiples replicaciones, originando varias copias por célula (de 20-50).
El control del número de copias del plásmido se encuentra en una región del DNA que
incluye el origen de replicación.
Generalmente un plásmido contiene solamente un origen de replicación y asociados a éste se
encuentran los elementos de control llamados replicón. En algunas ocasiones, los plásmidos
que han sido generados por fusión pueden contener más de un replicón y, en muchos casos,
solamente uno es activo. Los plásmidos son así replicones que se transmiten y mantienen de
manera estable como círculos extracromosómicos.
Bajo condiciones naturales, muchos plásmidos son transmitidos al nuevo anfitrión por un
proceso conocido como conjugación bacteriana. Sin embargo, los plásmidos que son
utilizados como vectores, carecen del gen mob, el cual es requerido para la movilización, por
lo que son incapaces de transferirse de una bacteria a otra.
En el laboratorio, los plásmidos de DNA pueden ser introducidos dentro de una bacteria por
un proceso de transformación artificial. Para esto, la bacteria es tratada con una mezcla de
cationes divalentes que provocan una permeabilidad temporal a pequeñas moléculas de DNA.
Aún bajo las mejores condiciones, los plásmidos se establecen solamente en una pequeña
población de bacterias. Para identificar a estas transformantes, se usan marcadores de
selección codificados por los plásmidos.
Los marcadores de selección más usados son los genes que confieren resistencia a un
antibiótico como la ampicilina, tetraciclina, cloranfenicol y kanamicina.
• Tetraciclina. Es un compuesto que se une a una proteína de la subunidad 30S del ribosoma
e inhibe la translocación ribosómica. La expresión constitutiva del gen de resistencia se
encuentra en el plásmido pBR322, que codifica para una proteína asociada a la membrana de
399 aminoácidos, que evita que el antibiótico entre a la célula. • Ampicilina. Es un
compuesto que se une e inhibe a varias enzimas en la pared bacteriana, que están
involucradas en la síntesis de la pared celular. El gen de resistencia ampr que lleva el
plásmido, codifica para una enzima que es secretada dentro del espacio periplásmico de la
bacteria, donde ésta cataliza la hidrólisis del anillo β-lactámico, con una desintoxicación
concomitante de la droga.
• Cloranfenicol. Se une a la subunidad ribosómica 50S e inhibe la síntesis de proteínas. El
plásmido lleva al gen Cmr o cat lo que le confiere la resistencia.
El gen cat codifica para una proteína citosólica tetramérica, que en presencia de la enzima
acetil coenzima A, cataliza la formación de derivados acetoxi del cloranfenicol que son
incapaces de unirse al ribosoma.
• Kanamicina es un aminoglucósido que se une a componentes ribosómicos e inhiben la
síntesis de proteínas. El plásmido pKAN expresa una fosfotransferasa que se une a los grupos
fosfatos de la molécula de kanamicina, bloqueando su capacidad de unión al ribosoma. Así,
los plásmidos pueden ser usados como herramientas para propagar grandes cantidades de
DNA de una secuencia dada o para obtener un medio de expresión de un gen en una célula
anfitriona.