INFORME BACTERIOLOGIA II, GUIA 2 UWU

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INFORME GUÍA # 2 
 IDENTIFICACIÓN DE ENTERBACTERIAS EN EDA 
 
 
PRESENTADO POR: 
BLEYDIS JOHNS PACHECO 
ANDREA CAROLINA MÁRMOL HERNÁNDEZ 
PEDRO JULIO MORALES FASETTE 
 
 
DOCENTE: 
MARÍA CAMILA VELAZCO PAREJA 
 
 
 
 
 
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA 
FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD 
PROGRAMA DE BACTERIOLOGÍA 
MONTERÍA- CÓRDOBA 
2021-II 
 
 
 
INTRODUCCIÓN 
En el siguiente informe se hablará de la familia de las enterobacterias, 
específicamente de las especies que están relacionadas a las EDA (enfermedades diarreicas 
agudas) las cuales provocan procesos infecciosos en el tracto gastrointestinal. 
Las especies de la familia Enterobacteriaceae son bacilos gramnegativos aerobios o 
anaerobios facultativos que se encuentran comúnmente en las muestras clínicas. La mayoría 
de los miembros de esta familia son bastaoncillos rectos, la mayoría de ellos móviles, 
aunque algunas cepas no lo son (Shigella y Klebsiella) y variantes inmóviles de especies 
móviles. Las especies móviles poseen flagelos peritricos, que los diferencian de otras 
familias. Todos fermentan la glucosa, es característica de algunos géneros la ausencia de 
gas en la fermentación de los hidratos de carbono. Por lo general, los nitratos son reducidos 
a nitritos. No se produce la reacción de la indofenol-oxidasa, ni la licuefacción del alginato. 
Esta familia está compuesta por un grupo diverso de microorganismo con diferente 
estructura antigénica y propiedades bioquímicas. Se han establecido principalmente sobre 
la base de las características bioquímicas. 
Por otra parte, hay que tener en cuentan las características de cada uno de estos 
microrganismos y como es el comportamiento de cada uno de ellos, para así poder 
clasificarlos y posteriormente identificarlos, dado que cada uno reacciona de manera 
distinta, es por eso que se utilizan las pruebas bioquímicas y los distintos medios de 
cultivos. También hay que tener presente la población que se ve afectada, los cuales están 
más propensos adquirir esta clase EDA, ya sea por el entorno en donde viven o por técnicas 
de higiene. 
 
OBJETIVOS 
• Identificar las distintas características de las Enterobacterias 
• Conocer los fundamentos de las pruebas bioquímicas 
• Diferenciar las técnicas de siembra para cada uno de estos microorganismos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
MATERIALES 
• Marcador permanente delgado. 
• Cinta de enmascarar. 
• Laminas cubre objetos. 
• Laminas porta objetos. 
• Encendedor. 
• Agar no selectivo (Agar sangre) 
• Agar selectivo ( XLD, SS, MacConkey, Bismuto-sulfito, EMB, Hecktoen) 
• Caldo selenite o tetrationato. 
• Tirillas de oxidasa. 
• Colorantes para Gram. 
• Palillos. 
• Papel Kraft. 
• Microscopio. 
• Cepas Bacterianas (Salmonella, E.coli, Shigella) sembradas en agar nutritivo y BHI. 
• Asas bacteriológicas. 
• Aceite de inmersión. 
• Reactivos: Kovacs, rojo de metilo, alfa naftol al 5% y KOH al 40%. 
• Descartadores. 
 
 
 
 
METODOLOGÍA 
Al recibir la muestra en el laboratorio se observarán detenidamente sus 
características, tales como el olor, color, consistencia, o la presencia de mucosidades, 
sangre, o restos de alimentos sin digerir. Estos detalles pueden orientar algo el diagnóstico; 
así, por ejemplo, unas heces líquidas con grumos en forma de agua de arroz, harán pensar 
en el cólera, o la sangre y mucosidades indicarán una sintomatología inflamatoria del 
intestino, que puede ser debida a una disentería. Hay autores que completan esta 
apreciación microscópica, mezclando en un porta una pequeña porción de heces con una 
gota de azul de metileno, tapándolo con un cubre y observando la preparación con objetivo 
de inmersión, intentando descubrir leucocitos. Su presencia denotará que hay inflamación 
en el intestino, la cual suele estar producida por agentes infecciosos invasores como 
Salmonella, Shigella o E. coli enteroinvasivo; en cambio, ante un proceso gastroenterítico, 
con heces exentas de glóbulos blancos, se sospecha una etiología virásica, o una bacteriana 
capaz de producir toxina, como Vibrio cholerae, Staphylococcus aureus, Clostridium 
perfringens, Clostridium botulinum o E. coli enterotóxico. 
1. Siembra directa por agotamiento quemando asa en agar sangre y XLD: 
incubar a 37°C por 24 a 48 horas en aerobiosis, seguir con el paso 5 (ver figura 1). 
2. Pre- enriquecimiento selectivo: 
a) Tomar un gramo de heces, preferiblemente la parte de la muestra diarreica con 
sangre y moco. 
b) Agregar la muestra en un tubo con caldo Selenite. 
c) Incubar de 6 a 12 horas a 37°C en atmósfera de aerobiosis. 
3. Siembra de subcultivos: Sembrar en las cajas de agar entérico previamente 
marcadas con las indicaciones del docente a partir del caldo de pre-enriquecimiento. En 
cada caja se siembra por agotamiento quemando asa. 
4. Incubación: Incubar las cajas a 37°C de 24 a 48 horas en atmósfera de 
aerobiosis. 
5. Pruebas de identificación: 
➢ Observación de las colonias aisladas: observar las colonias, buscando en este 
caso primero las colonias no fermentadoras que tienen prioridad sobre las fermentadoras, 
ya que la mayoría de los gérmenes fermentadores pertenecen al microbiota normal del 
intestino. 
➢ Gram de las colonias: las colonias sospechosas se les realiza un Gram (Gram 
del Cultivo). 
➢ Prueba de oxidasa: realizar a las colonias sospechosas. 
➢ Pruebas bioquímicas: realizar a las colonias sospechosas las respectivas 
pruebas bioquímicas. 
➢ Interpretación de los resultados: efectuar la respectiva lectura de las pruebas 
bioquímicas para establecer cuál es el género y la especie de la enterobacteria aislada. 
 
 
 
 
 
 
ANALISIS 
Lo primero se que hizo al ingresar al laboratorio su hacer el previo lavado de manos 
y después a la colocación de los elementos de protección personal, cada estudiante se ubicó 
en su sitio manteniendo la debida distante y preparando su sitio de trabajo, luego se 
comenzó con la socialización de la guía haciendo mención de los aspectos más importantes 
de cada uno de los microorganismos a estudiar. Posteriormente si se hubiera recibido la 
muestra se hubiera procedido a observar sus características como su consistencia, la 
presencia de sangre o de mucosidades, los restos de alimentos sin digerir y hacer su debido 
pre enriquecimiento en caldo selenite o tetrationato, dejando incubar por 6- 8 horas a 37 
grados en atmósfera de aerobiosis y dichas muestras hubieran dicho cultivadas en los 
distintos agares, dejando incubar por 24 horas, lo que ya habían hecho las docentes. 
Se procedió hacer la prueba de oxidasa de las colonias sospechosas en donde con un 
palillo de madera se recogieron las colonias que tenían morfologías similares, la muestra se 
puso en contacto con la tira o disco impregnado esperando ver un resultado a los 10 
segundos de un color como morado, este cambio de color se debe al reactivo de Kovacs 
que es incoloro pero al ponerlo en contacto con la enzima citocromoC oxidasa cambia a un 
color morado debido a que el tetrametil-p-fenilendiamina es una amina aromática y la 
oxidación de esta produce quinolonas de color morado-azulado, es cual no se obtuvo , por 
lo que dio un resultado negativo de esta prueba, cabe resaltar que esta prueba no se hace 
con asas bacteriológica, ya que la mayoría de estas contienen hierro y este es capaz de 
oxidar el reactivo dando nos falsos positivos. 
Luego se hizo un gram de las mismas colonias sospechosas, se procedió haciendo el 
frotis en el portaobjetos, se dejó secar la muestra a temperatura ambiente y después se fijó 
la muestra pasando esta por la mechero una a tres veces, después se procedió con la 
coloración iniciando con el cristal violeta dejándolo actuar por un minuto, luego se enjuagó 
con agua destilada y se agregó el lugol dejando actuar un minuto, se volvió a enjuagar y se 
le agrego alcohol acetona dejándolo actuar por 30 segundos, luegose enjuago y por último 
se le agrego safranina durante un minuto y se enjuago; Luego se dejó secar a temperatura 
ambiente, posteriormente se observó al microscopio en el objetivo de 100x con aceite de 
inmersión, observando bacilos gram negativos. 
Se procedió hacer una siembra por agotamiento con asa redonda la cual es para 
obtener colonias aisladas, primero se esterilizo el asa esperando unos segundos hasta que 
esta enfrié, de no ser así se puede matar al microorganismo, se tomó la muestra del caldo 
pre-enriquecido y se hizo una pequeña siembra, se volvió a esterilizar el asa y se giró el 
agar volviendo hacer otra siembra, luego que volvió hacer lo mismo y por último se volvió 
a esterilizar y girando el medio se hizo una pequeña estría. Todo está siembra se hizo con la 
única muestra que se tomó del caldo con el fin de lograr colonias aisladas. Después se 
rotulo el agar con nombre, fecha y hora la cual es muy importante para saber por cuando 
tiempo se va a incubar, es importante que al momento de incubar las cajas deben estar hacia 
abajo. 
Luego de incubar se hicieron las pruebas bioquímicas de las colonias sospechosas, 
se hizo la prueba de TSI en la cual hubo punción de medio y posterior una estría en el bisel. 
Posterior mente se realizó la prueba del citrato en la cual se inoculo el agar de superficie 
inclinada con una sola estría en la superficie , seguido de la prueba en el medio sin la cual 
se realizó inoculando una colonia pura de nuestra siembra a través de un asa en punta 
entrando de manera recta (evitando el pulso de maraquero ) y saliendo por el mismo lugar , 
con el fin de observar si el microorganismo sospechoso era móvil , tenía producción de 
H2S ,luego se procedió a observar la demostración de la prueba del índol añadiendo a un 
caldo ya inoculado con el microorganismo 5 gotas del reactivo de kovac, vale la p na 
resaltar que en la prueba de LIA se realizaron interpretaciones guiadas por nuestra 
docente en la cual si estaba amarillo (A) es ácido y había fermentación de azúcar , Rojo 
(k) era alcalino no había fermentación de azúcar , Negro presencia de H2S y se observaron 
algunas pruebas con burbujas las cuales indicaban que si había una producción de gas . 
 
Los resultados en estas pruebas dependiendo del microorganismo sospechoso fueron los 
siguientes 
 
Pruebas bioquímicas 
Micro
rganismo 
S
IM 
U
rea 
C
itrato 
T
SI 
M
R 
V
P 
LIA 
E.coli M
óvil 
I
ndol + 
H
2S - 
N
egativa 
N
egativo 
A
/A 
H
2S – 
G
as + 
+ - K/K 
Des
carboxila 
Salmo
nella 
M
óvil 
I
ndol – 
H
2S + 
- + K
/A 
G
as + 
H
2S + 
+ - K/K 
Des
carboxila 
Shigel
la 
I
nmóvil 
- - K
/A 
G
as – 
+ - K/A 
Fer
menta 
I
ndol –
H2S - 
H
2S - 
 
CONCLUSIÓN 
Los medios de cultivo se caracterizan por ser selectivos y es por esa razón que se 
utilizan las pruebas bioquímicas, ya que nos permiten la identificación de los 
microorganismos que se quieran estudiar , también nos permiten conocer como es su 
metabolismo y estos es gracias a las características que se observan en los distintos medios , 
ya que estos utilizan un variedad de indicadores que permite su posterior identificación, 
también se puede observar su metabolismo mediante lq producción de gas. Ahora bien está 
práctica fue fundamental para conocer cuáles de los microorganismo eran fermentadoras o 
no, debido a estos factores se puede hacer un diagnóstico presuntivo. Ese fue el objetivo 
principal de la practica, ya que por medio de el cambio de color se pudo identificar cuáles 
eran fermentadoras y posteriormente con ello sospechar de algún microorganismo y 
confirmar dicha sospecha por medio de las pruebas bioquímicas. 
 
 
 
 
 
 
PRE- LABORATORIO 
1. Investigue acerca el fundamento del caldo Selenite, Tetrationato, Rappaport 
y caldo para Gramnegativos. 
Selenito Cistina Caldo: En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes 
necesarios para el desarrollo bacteriano. La lactosa es el hidrato de carbono fermentable, el 
selenito de sodio inhibe flora Gram positiva y la mayoría de la flora entérica excepto 
Salmonella spp. Durante las primeras 8-12 horas de incubación. La L-cistina es el agente 
reductor y la FDA propuso que se agregue a la formulación del Selenito Caldo porque 
reduce la toxicidad del selenito de sodio llevando así a una mayor recuperación de especies 
de Salmonella. 
Tetrationato caldo base: El medio de cultivo contiene peptona que provee los 
nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, y carbonato de calcio que neutraliza y 
adsorbe metabolitos tóxicos. La selectividad está dada por la presencia de sales biliares y 
tetrationato (compuesto generado en el medio de cultivo al reaccionar el tiosulfato de sodio 
con la solución iodo-iodurada) que inhiben el desarrollo de microorganismos Gram 
positivos y algunas enterobacterias. Salmonella spp. Contiene la enzima tetrationato 
reductasa y puede crecer satisfactoriamente en el medio de cultivo debido a que no la afecta 
la toxicidad del tetrationato. Para evitar la proliferación de especies de Proteus spp., se 
recomienda agregar 40 mg/l de Novobiocina previo al agregado de la solución iodo 
iodurada. 
Rappaport Vassiliadis Caldo: Medio de cultivo desarrollado originalmente por 
Rappaport et al (1956) y luego modificado por Vassiliadis et al (1976-1983) en el cual se 
disminuyó la concentración de verde de malaquita. Es un medio de cultivo nutritivo que 
contiene un sistema buffer de fosfatos, alta concentración de sales de magnesio y sodio y la 
presencia del colorante verde de malaquita (oxalato). 
El enriquecimiento selectivo de especies de Salmonella se debe a la capacidad de 
estos microorganismos de sobrevivir y multiplicarse a presiones osmóticas relativamente 
altas (debido a la elevada concentración de cloruro de magnesio en el medio), a pH 
relativamente bajos, y porque se suprime el efecto tóxico del verde de malaquita hacia las 
salmonellas debido a la presencia de cloruro de magnesio. La incubación a 41-42 ºC 
favorece la selectividad hacia las salmonellas. 
 
Caldo para Gramnegativos: Se emplea como caldo selectivo para el cultivo de 
Salmonella y Shigella a partir de muestras de heces e hisopos rectales. Contiene citrato de 
sodio y desoxicolato sódico (una sal biliar) que destruyen los microorganismos Gram 
positivos e inhiben la multiplicación temprana de los coliformes. La adición de mayor 
cantidad de manitol que de glucosa estimula el crecimiento de los patógenos fermentadores 
de manitol y no es favorable para Proteus. El medio se tampona para mantener el pH neutro 
aún después de la producción de metabolitos bacterianos ácidos. Para obtener el máximo 
beneficio de sus propiedades selectivas, el caldo GN debe ser subcultivado después de 6-8 
horas tras la inoculación e incubación iniciales, ya que después de este período los 
coliformes sobrepasan a los patógenos. 
2. ¿Por qué se debe realizar un pre- enriquecimiento selectivo a las muestras de 
heces? 
La utilización de un medio liquido de enriquecimiento es fundamental cuando se 
trata de estudiar portadores asintomáticos, ya que estos en algunos casos suelen eliminarse 
solo en una baja concentración como es el caso de Salmonella en heces, debido a esto se 
utilizan estos medios para la preservación de esta especie y con el objetivo de inhibir la 
flora fecal competitiva, por lo que también es importante utilizar estos medios en cuadros 
con gastroenteritis agudas aunque el elevado numero de salmonellas presentes en las heces 
en estos casos no los haga indispensable. 
3. ¿Cuáles son los microorganismos de importancia clínica productores de 
gastroenteritis de tipo infeccioso? 
La formación de diarrea acuosa es la producida por bacterias secretoras de 
enterotoxinas, como por ejemplo Vidrio choleare, E. coli enterotoxigénica, Salmonella 
entérica y Campylobacter jejuni.Rotavirus es la forma infectante por virus. 
4. ¿Qué medios de transporte son utilizados para las muestras de materia 
fecal? 
• Medio de transporte Cary-blair, el cual es utilizado para el transporte de muestra de 
materia fecal o de aislamiento de microorganismos gran negativos entéricos, es 
medio es adecuado, debido a que sus escasos nutrientes y el pH de 8,4 mantienen al 
microorganismo viable y evita su replicación. 
• Bote estéril de boca ancha, con cucharilla y tapa rosca. Alternativamente se puede 
emplear un hisopo con medio de transporte Cary-Blair. 
• Muestras tomadas con hisopo: sin medio de transporte, envío inmediato; con medio 
de transporte (Cary-Blair) enviar antes de 24 h a temperatura ambiente. Estudio 
bacteriológico y citológico de Clostridium difficile: enviar lo antes posible o 
refrigerar a 2-8 ºC (hasta 48 h). Sospecha de Shigella spp.: mantener a temperatura 
ambiente sin refrigerar. Estudio de parásitos: enviar una muestra de heces en un 
medio fijado (acetato sódico/ácido acético/formalina) y conservarla a temperatura 
ambiente (muestras no líquidas 
POST-LABORATORIO 
1. Investigue la colección y conservación adecuada para muestras de heces en el 
laboratorio de microbiología. 
2. ¿Para qué se utiliza el Agar MacConkey con sorbitol? investigue su 
fundamento 
• El agar MacConkey con sorbitol es una modificación de la fórmula 
proporcionada por Rappaport y Henig para aislar los serotipos 011 y 055 de 
Escherichia coli enteropatógena8. Se ha descrito la utilidad de este medio 
para detectar E. coli O157:H7, un patógeno humano asociado con la colitis 
hemorrágica. 
• Escherichia coli O157 H7 es el agente causal del sindrome urémico 
hemolítico. Fermenta la lactosa como todas las cepas de Escherichia coli 
pero a diferencia de éstas, no fermenta el sorbitol. Los medios de cultivo que 
contienen lactosa no permiten diferenciar entre estas cepas de Escherichia 
coli, por eso se ha desarrollado el Mac Conkey con Sorbitol Agar, el cual es 
un medio de cultivo es similar en su formulación al Agar Mac Conkey 
excepto en que se ha reemplazado la cantidad de lactosa por igual cantidad 
de sorbitol, lográndose así un medio nutritivo, selectivo y diferencial en base 
a la fermentación del sorbitol. Los microorganismos fermentadores de 
sorbitol crecen observándose como colonias rosadas-rojizas ya que por 
fermentación del sorbitol disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto 
produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorción en 
las colonias, y la precipitación de las sales biliares. Los microorganismos no 
fermentadores de sorbitol desarrollan y se observan como colonias incoloras. 
Escherichia coli O157 H7 no fermenta el sorbitol dando colonias 
transparentes mientras que la mayoría de las cepas de E. coli fermenta el 
sorbitol, observándose como colonias rosadas-rojizas. 
3. En caso de que el médico ordene un antibiograma ¿Qué antibióticos 
utilizaría? 
Se realizaría el antibiograma, pero hay que tener en cuenta algunos factores y estos 
hacerlos saber al medico; Los antibióticos no deben usarse de forma rutinaria para la 
gastroenteritis por Salmonella, ya que promueven la aparición de un estado de portador 
asintomático, aumentan las reacciones adversas y prolongan el tiempo de detección de 
Salmonella en las heces. 
Se pueden utilizar antibióticos para Shiguella spp como azitromicina, una 
cefalosporina de 3ª generación tipo cefixime. En caso del Campylobacter spp como la 
eritromicina y la claritromicina. En E.coli las cefalosporinas de 3ª generación 
4. ¿Cuáles son los microorganismos que desplazan completamente la microbiota 
gastrointestinal; como observaría los Gram directos de cada uno de ellos? 
Shigella, Sakmonella, Yersinia: se observan como bacilos gran negativos, con 
respuesta polimorfo nuclear (RPN) 
Vibrio cholerae : bacilo gran negativo, con respuesta polimorfo nuclear. 
Campylobacter jejuni: bacilo gran negativo, pequeño, curvo y con respuesta 
polimorfo nuclear. 
5. Elabore un caso clínico donde esté implicado el germen objeto de estudio. 
Paciente masculino de 25 años del municipio de Lorica ingresa al área de urgencias del 
Hospital San Jerónimo de Montería, presentando dolor abdominal, fiebre y 
deposiciones diarreicas de 4 días de evolución. En la exploración física todo salió 
dentro de lo normal a excepción de una temperatura de 38.3°C. Se le solicitaron una 
serie de exámenes entre esos un hemograma completo que reporto una de 12g/dL se 
reportan parámetros normales, un coprocultivo donde se encontró salmonella spp y una 
radiografía simple: normal. 
Se trató con ampicilina 500g cada 6 horas durante 7 días con repetición de coprocultivo 
que reporta la recuperación completa del paciente. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Bibliografía 
• Blancas, G. P. (2016, 16 marzo). Pruebas bioquímicas tradicionales y de alta 
resolución para identificación manual de enterobacterias. Universidad Autónoma del 
estado de México. http://ri.uaemex.mx/handle/20.500.11799/39337?show=full 
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• Gil, M. (2019, 14 febrero). Caldo Urea: fundamento, preparación y usos. Lifeder. 
https://www.lifeder.com/caldo-urea/ 
• Patrick R. Murray, PhD., Ken S. Rosenthal, PhD., George S. Kobayashi, PhD., 
Michael A. Pfaller, MD. 2017. "MICROBIOLOGÍA MÉDICA"., 8va Edición., Ed. 
Mosby. 
• T Stuart Walter. Mac Graw Hill. México, 2000. Editores S.A Microbiología 
• El laboratorio en el diagnóstico clínico. Jhon Bernard Henry. Editorial Marban. 20° 
edición 2005. 
• Rappaport Vassiliadis Caldo 
https://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_60707dddb4f87.pdf 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
https://www.lifeder.com/caldo-urea/
https://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_60707dddb4f87.pdf
	Bibliografía