Diversidad y Ecología Microbiana Unidad 9 Herramientas de Identificación Bacteriana

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Diversidad y Ecología Microbiana
Unidad 9.
Métodos de Identificación 
Bacteriana
Métodos de Identificación Bacteriana
• Métodos fenotípicos manuales y automatizados 
(tradicionales) 
• Métodos Moleculares (rápidos)
• Métodos basados en proteómica (muy rápidos)
Métodos de Identificación Bacteriana
Convencionales Comerciales
• Pruebas Bioquímicas 
Manuales. Tablas y 
Diagramas de flujo
• Pruebas serológicas
Manuales Automatizados
API Vitek
Rapi ID Phoenix 
Microscan
Agar Mac Conkey, selectivo y diferencial. Se 
le utiliza para diferencial Salmonella y 
Escherichia coli . El ingrediente selectivo es 
el cristal violeta que inhibe los gram
positivos. El ingrediente diferencial es la 
lactosa para distinguir su utilización
Identificación de Acinetobacter
Identificación de Chryseobacterium
Técnicas serológicas: Utilización de las reacciones 
antígeno-anticuerpo para la identificación de un 
microorganismo (virus, bacterias, hongos). 
Anticuerpos fluorescentes
Métodos Moleculares
Análisis que pueden detectar específicamente el
microorganismo de interés en base a la composición de
sus ácidos nucleicos.
Son métodos rápidos y sensibles para la detección,
identificación y cuantificación de microorganismos. De
gran utilidad en el estudio de Comunidades
Microbianas
Primeros métodos moleculares
Hibridación del ADN
Primeros métodos moleculares: Ribotipado
• El Ribotipado se basa en los polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción 
(RFLP) de secuencias genómicas codificantes de ARN ribosomales (ARNr 16S y 23S 
principalmente).
Herramientas moleculares para el estudio de 
Comunidades Microbianas
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
• Se basa en el principio de
complementariedad de bases del
ADN y en la participación de la
enzima polimerasa que permite
la extensión del fragmento a
amplificar, agregando
nucleótidos en secuencia
complementaria al ADN molde
por medio de un proceso cíclico.
• Comprende tres pasos:
1) Desnaturalización
2) Hibridación
3) Extensión
• Técnica mas utilizada debido a su
protocolo rápido y fácil uso
• Son necesarias de 2-3 h
Para establecer la identificación de los microorganismos se 
aplica un programa de similitud genética entre las 
secuencias de los nucleótidos analizados y los de las otras 
especies conocidas. En la actualidad, esta información se 
encuentra disponible en la WEB
RAPD (Random
Amplified Polymorphic
DNA)
Huellas genéticas
Biblioteca de Clones
Ejemplos de Aplicaciones de PCR
1) Fue posible identificar una única célula de C. jejuni en muestras de leche y agua 
por PCR junto con técnica de separación inmunomagnética (IMS). La PCR fue dirigida 
a los genes genes flaA, CadF, ceuE y cdt y la región 16S del ARNr. El tiempo de ensayo 
fue de 8 horas, sin enriquecimiento de la muestra. Los autores concluyeron que la PCR 
eliminó falsos positivos que se observaron por los métodos de cultivo. Food Control
Volume 24, Issues 1–2, March–April 2012, Pages 23-28.
2) Un estudio realizado por Gouws y Lidedemann ( 2005) Food Technol. 
Biotechnol. 43:201–205, utilizó PCR específico para el gen hly de Listeria 
monocytogenes, y los métodos de cultivo convencionales para analizar 27 productos
de leche. En los resultados , 74% fueron positivos en agar Oxford, 37% fueron
positivos con PCR.
PCR Múltiple
• Desarrollada para la detección de dos o mas 
microorganismos presentes en una muestra.
- Un solo protocolo de amplificación de PCR para todos los 
patógenos aplicables
- Análisis simultáneo - Resultados en menos de 24 horas (11-21 
horas) 
- Ejm.Para Listeria sp., Listeria monocytogenes, Salmonella, E. 
coli O157, E. coli O157:H7, Campylobacter y Staphylococcus
aureus
Poca manipulación: el termociclador controla la extracción de
ADN y la amplificación PCR y el análisis de los resultados
Enriquecimiento: 18 horas. Extracción: <30 minutos. Detección:
2 horas .
PCR en tiempo Real o PCR cuantitativo (qPCR)
• Los productos son detectados por fluorescencia 
durante una reacción PCR y son cuantificados
Variados Kits PCR para la detección de patógenos 
Asociando Identidad con Función 
Stable Isotope Probing (SIP)
Stable –Isotope Probing (SIP)
• Se realiza una centrifugación en gradiente de densidad 
(CsCl) con el DNA aislado de microorganismos de 
muestras de suelo o cultivos enriquecidos, crecidos 
sobre sustratos marcados, de manera que las moléculas 
marcadas con C son más densas y migran más que las 
enriquecidas en C.
• La fracción de DNA C contiene los genomas de la 
población microbiana que ha sido capaz de usar el 
sustrato marcado e incorporar el átomo pesado a su 
DNA. Utilizando cebadores para regiones conservadas 
del RNAr 16S, se puede amplificar ese gen para 
identificar los microorganismos implicados en el proceso 
de interés. Además, es posible usar cebadores para 
genes que codifican enzimas clave conocidas de las vías 
metabólicas de utilización de ese sustrato.
• Necesita altas concentraciones de sustrato
• Largos tiempos de incubación
Requiere enriquecimiento de poblaciones minoritarias
Las condiciones ex-situ no reflejan necesariamente los ambientes in situ
Manefield et al., 2002, Appl. Environ. Microbiol. 68: 
5367-5373
Limitaciones de SIP
FISH: Fluorescence in situ Hybridization
Fluorescence in situ Hybridization: FISH
• Es una técnica citogenética de marcaje 
de cromosomas mediante la cual estos son 
hibridados con sondas que emiten fluorescencia y 
permiten la visualización, distinción y estudio de los 
cromosomas así como de las anomalías que 
puedan presentar. 
• Esta técnica permite la rápida determinación 
de aneuploidías, microdeleciones, duplicaciones, 
inversiones, así como la presencia de un marcador 
genético en un cromosoma.
Fluorescence in situ Hybridization: FISH
• Se basa en exponer los cromosomas a una pequeña 
secuencia de ADN (sonda) que tiene una molécula 
fluorescente pegada a ella.
• Requiere la desnaturalización del DNA para separar 
la doble hélice. A esta muestra se le añade la sonda 
de interés. Las sondas hibridan a las regiones 
específicas para las que han sido diseñadas, 
después, se tiñen las células con un colorante de 
contraste y se observa, en un microscopio de 
fluorescencia. 
FISH revela alta diversidad en barros activados
Amann et al., 1996 In Situ Visualization of High Genetic Diversity 
in a Natural Microbial Community J. Bacteriol. 178: 3496–3500
Diversidad bacteriana en reactores 
nitrificantes usando FISH
Microarreglos
• Consisten en un gran número de sondas (ADN 
complementario) inmovilizadas sobre una 
superficie sólida.
• Tras el paso de hibridación con el ADN marcado 
con fluorescencia y el posterior lavado, el ácido 
nucleico enlazado a las sondas genera un patrón 
de fluorescencia que es registrado y analizado 
utilizando un escáner.
• Pueden identificar un amplio rango de bacterias 
patógenas y ayudar a la caracterización de la 
resistencia antimicrobiana y los genes de 
virulencia presentes, logrando gran sensibilidad y 
especificidad.
Metodología básica de un Microrreglo de ADN
Aplicación de microarreglos en la
reducción y reoxidación de uranio asociada a 
poblaciones metalo -reductoras
Brodie et al., 2006 Application of a High-Density Oligonucleotide Microarray 
Approach To Study Bacterial Population Dynamics during Uranium
Reduction and Reoxidation Appl Environ Microbiol 72: 6288-6298
Pirosecuenciación 454
• Es una herramienta de Segunda Generación basada en la 
pirosecuenciación pero la realiza de forma masiva usando 
perlas de agarosa
• Permite determinar una secuencia de ADN a gran escala, 
aplicable a genomas completos, mediante luminiscencia. 
Los genomas pueden ser completamente secuenciados en 
semanas (incluso horas), en lugar de años, debido a que 
esta metodología no requiere bibliotecas de ADN, ni 
clones, solo el ácido nucleico aislado.
• Ha ampliado el repertoriode los genomas bacterianos 
secuenciados y ha ayudado a identificar los agentes 
potenciales, bacterianos, protozoarios o virales, asociados 
con enfermedades de etiología desconocida
• Un ADN de cadena sencilla que actúa como molde 
• Un cebador para iniciar la síntesis de ADN 
• Tres desoxirribonucleótidos trifosfato (dGTP, dCTP y dTTP) más 
desoxiadenosina alfa-tiotrifosfato (dATP•S, un derivado del dATP que 
puede ser utilizado normalmente por la ADN-polimerasa pero que no es 
reconocido por la luciferasa). 
• Cuatro enzimas: ADN polimerasa (que cada vez que añade un nuevo 
desoxirribonucleótido trifosfato a la cadena naciente genera una molécula 
de PPi), ATP sulfurilasa (que convierte el PPi en ATP en presencia de APS), 
luciferasa (que, en presencia de ATP, convierte la luciferina en oxiluciferina
y genera un fotón de luz visible) y apirasa (que degrada los nucleótidos 
que no se han incorporado a la cadena naciente y el ATP generado por la 
sulfurilasa). 
• Adenosina 5'-fosfosulfato (APS) 
• Luciferina
Componentes de la Pirosecuenciación
NASBA (Nucleic Acid Sequence Based 
Amplification)
• Está basada en una reacción continua de 
amplificación de ARN en condiciones isotérmicas. A 
diferencia de la RT-PCR, esta reacción puede 
amplificar ARN de una manera específica, aún 
existiendo también ADN en la muestra. 
• Esta característica le confiere la posibilidad de 
detectar, de una forma inequívoca y sencilla, 
microorganismos viables ya que la presencia de 
ARNm puede ser utilizada como indicador de la 
viabilidad celular.
Bioluminiscencia
Lisis del cultivo- Extracción de ADN- Producción de ATP +Luciferasa
Detección de Bioluminiscencia 
Bioluminiscencia para detección de patógenos
Métodos Basados en Proteómica
• La proteómica estudia y caracteriza el conjunto de 
proteínas expresadas por un determinado genoma. 
Los métodos basados en proteómica más usados 
utilizan la electroforesis y la espectrometría de 
masas. 
MALDI-TOF: Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization
Time of Flight (Vaporización/ionización por láser asistida por 
matriz a través detección de masas acorde al tiempo de 
vuelo.
• Es un método que determina un patrón de proteínas 
de un organismo desconocido y compara este patrón 
con una librería para finalmente presentar un score de 
esa comparación.
• Puede trabajar 96 muestras por hora y otorgar 
resultados de cada una en minutos. 
• La exactitud y rapidez de MALDI-TOF supera a la 
identificación fenotípica y molecular hasta ahora 
conocidas 
MALDI-TOF
Limitaciones en la detección de microorganismos por MALDI-TOF
Factores de elección de una técnica
• Precisión necesaria
• Nivel de Resolución
• Facilidad de Uso
• Tiempo de obtención de resultados
• Aceptabilidad/Validación
• Coste Analítico
• Soporte y mantenimiento técnico
• Versatilidad
Ventajas y desventajas de las técnicas moleculares 
utilizadas en la detección de microorganismos