BGMB_U2_A2_JESSICA_MENDOZA_PRADO

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Universidad Abierta y a Distancia 
de México 
División de Ciencias de la Salud, 
Biológicas y Ambientales 
Ingeniería en Biotecnología 
 
 
Genética Molecular Bacteriana 
 
 
Unidad 2 
Actividad 2 
Selección de BGM 
 
Jessica Verónica Mendoza Prado 
ES202104539 
 Grupo BI-BGMB-2301-B2-002 
 
7 de mayo de 2023 
 
Firefly luciferase reporter vector pGL4Zc 
Secuencia de hebra superior introducida en BLAST 
atggaagatgccaaaaacattaagaagggcccagcgccattctacccactcgaagacgggaccgccggcgagcagctgcacaa
agccatgaagcgctacgccctggtgcccggcaccatcgcctttaccgacgcacatatcgaggtggacattacctacgccgagtacttc
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ccgtgtaa 
 
 
 
Fundamento 
La técnica de ensayo de luciferasa es una técnica de análisis 
cuantitativo que se vale de las propiedades bioluminiscentes presentes 
de forma natural en la naturaleza, como medio de adaptación con 
propósitos desde la reproducción, camuflaje, alimentación e incluso 
defensa. Se encuentra en organismos como luciérnagas (cuya 
luciferasa fue la primera en ser utilizada y sigue siendo una de las 
populares), pulpos, calamares, plancton y plantas. 
La luciferasa es una enzima encargada de realizar la descarboxilación 
oxidativa del sustrato en presencia de oxigeno con efecto de liberación 
Ilustración 2 Vector del reportero, vista en SnapGene 
Ilustración 1 Búsqueda de la secuencia en BLAST de NCBI 
Ilustración 3 Mecanismo de 
producción de bioluminiscencia 
de un fotón. En el caso de la luciérnaga, el efecto es dado por la descarboxilación de la D-
luciferina como sustrato acompañado de ATP y O2, donde actúa la enzima con Mg2+ como 
cofactor, resultando en oxiluciferina y el destello de luz. 
Su importancia en los laboratorios se debe a que nos habla 
indirectamente de la expresión que cierto gen de interés 
presentaría por acción del promotor, siendo este el responsable 
de la poca o mucha expresión de la enzima. El promotor de 
interés es colocado rio arriba del gen de la luciferasa, siendo 
que a mayor actividad del promotor mayor es la unión de los 
factores de transcripción, mayor es la transcripción y tras la 
traducción mayor es el efecto de la enzima. El arreglo del 
promotor y la luciferasa es colocado dentro de alguna célula a 
través de transfección, transformación o inyección, tras un 
tiempo de incubación se lisa la célula y se añaden los cofactores 
necesarios para la actividad enzimática y finalmente la señal es 
captada por un iluminómetro que interpreta los resultados. 
 
Reporteros Pgl4 
Los genes reporteros pgl4 son una familia de genes de la luciferasa rediseñados sintéticamente 
en el gen luc2, cambiando los codones por los más usados en las células mamíferas y 
removiendo la mayoría de las secuencias consenso de unión de factores de transcripción 
además de la reducción de módulos de promotor. Esto ha permitido un aumento en la 
transcripción y precisión de la luciferasa. El vector pertenece a la compañía Promega y su costo 
aproximado es de $757.58 dólares. 
Ventajas del uso de los vectores Pgl4: 
• Expresión aumentada del gen reportero dada la 
optimización para la expresión de genes sintéticos 
en mamíferos. 
• Riesgo disminuido de artefactos al remover 
elementos de ADN crípticos y sitios de unión de 
transcripción. 
 
 
 
 
Segundo ejercicio 
Secuencia de hebra introducida en BLAST 
atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttca
gcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgcc
Ilustración 5 Mapa general de vector de pGL4, 
se indica el sitio donde debe ser colocado el 
promotor de interés en rojo. 
Ilustración 4 Resultados e interpretación 
del ensayo 
ctggcccaccctcgtgaccaccttcggctacggcctgcagtgcttcgcccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaag
tccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagt
tcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctgg
agtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccaca
acatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgaca
accactacctgagctaccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgcc
gccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaag 
 
 
Ilustración 6Ilustración 6 Secuencia de vector en SnapGene 
 
Ilustración 7Resultados de búsqueda en BLAST 
 
Fundamento 
Existe una variedad de proteinas geneticas fluorescentes que han sido desarrolladas en los 
ultimos años que se caracterizan por la emision de espectros fluorescentes de colores variados 
que van desde el azul hasta el amarillo, usadas como moleculas reporteras in vivo en 
investigacion molecular. Algunas se han originado de la 
medusa Aequotra victoria y otras de la anemona 
Discosoma striata así como corales de arrecife de la clase 
Anthozoa. 
Las proteinas de color amarillo se encuentran entre los 
reporteros más populares. Su ancho de onda de emision va 
de los 525 a 555 nanometros. 
Yellow fluorescent protein 
La proteina YFP (yellow fluorescent protein) es una proteina 
generada de forma artificiacl con origen en la GFP ( green 
fluorescent protein) encontrada originalmente en la medusa 
Aequotra victoria. La YFP, a diferencia de su proteina madre, es sensible al ácido y se apaga 
exclusivamente con iones de cloro, siendo estas las caracteristicas que han llevado a la 
busqueda de mutantes que mejoren su estabilidad. 
Usos y aplicaciones 
Ilustración 8Diversos cromóforos bajo el 
microscopio 
• Marcador de localización subcelular: La YFP se fusiona a proteínas de interés y se utiliza 
para rastrear su localización dentro de las células. Esto permite a los investigadores visualizar 
y estudiar la distribución espacial de las proteínas y comprender mejor sus funciones en 
diversos procesos biológicos. 
 
• Marcador de expresión génica: La YFP se utiliza como un marcador de expresión génica en 
experimentos de biología molecular. Los científicos pueden fusionar la YFP al promotor de 
un gen de interés y así monitorear visualmente la actividad del promotor y la expresión del 
gen. 
• Estudios de interacción de proteínas: La YFP se utiliza en la técnica conocida como "FRET" 
(Transferencia de Energía de Resonancia de Fluorescencia) para estudiar las interacciones 
entre proteínas. En este enfoque, se fusiona la YFP a una proteína y se le une otra proteína 
que está etiquetada con una proteína donante de energía de resonancia de fluorescencia 
(por ejemplo,la Cyan Fluorescent Protein - CFP). Cuando las dos proteínas interactúan, se 
produce una transferencia de energía y se observa una señal de fluorescencia específica. 
• Bioimagen: La YFP se utiliza ampliamente en técnicas de bioimagen, como la microscopía 
de fluorescencia y la microscopía confocal, para visualizar estructuras celulares y procesos 
biológicos en tiempo real. Su emisión de luz amarilla permite una fácil distinción de otras 
proteínas fluorescentes y ayuda a la observación y análisis de eventos celulares. 
Funcionamiento 
1. Estructura de la 
proteína: La YFP es una 
proteína formada por una 
secuencia de 
aminoácidos específica 
que se pliega en una 
estructura tridimensional. 
Esta estructura incluye 
una cadena polipeptídica 
y un cromóforo, que es la 
parte de la proteína 
responsable de la fluorescencia. 
2. Excitación: La YFP absorbe la luz en el rango del espectro azul-verde, principalmente a una 
longitud de onda de alrededor de 514 nanómetros. Cuando la YFP es expuesta a la luz en esta 
longitud de onda, los fotones son capturados por el cromóforo de la proteína. 
3. Cromóforo y resonancia: El cromóforo de la YFP se compone de un triplete de residuos de 
aminoácidos (serina, tirosina y glicina) en un arreglo específico. La estructura de estos 
aminoácidos permite que el cromóforo interactúe con los fotones absorbidos de manera eficiente. 
A través de un proceso conocido como resonancia, los electrones del cromóforo se excitan a 
estados de energía superiores. 
4. Relajación y emisión de luz: Después de la excitación, los electrones del cromóforo de la YFP 
vuelven a su estado de energía fundamental. Durante este proceso de relajación, la energía 
Ilustración 9 Sitio de clonación de YFP, ubicado en el extremo 3´de la cadena, con presencia 
de múltiples enzimas de restricción 
absorbida se libera en forma de luz visible. En el caso de la YFP, la luz emitida tiene una longitud 
de onda de aproximadamente 527 nanómetros, lo que corresponde a un color amarillo-verde. 
5. Detección y visualización: Los fotones emitidos por la YFP pueden ser detectados y 
visualizados utilizando técnicas de bioimagen. Esto se logra utilizando microscopios de 
fluorescencia, que son capaces de excitar la YFP con luz azul-verde y captar la luz amarilla-verde 
emitida por la proteína. Estos sistemas de detección registran la intensidad de la señal de 
fluorescencia, lo que permite visualizar y analizar la distribución y la localización de la proteína 
en estudio. 
Referencias 
 
 
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