BGMB_U3_EA_JESSICA_MENDOZA_PRADO

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Universidad Abierta y a Distancia 
de México 
División de Ciencias de la Salud, 
Biológicas y Ambientales 
Ingeniería en Biotecnología 
 
 
Genética Molecular Bacteriana 
 
 
Unidad 3 
Evidencia de aprendizaje 
 
Jessica Verónica Mendoza Prado 
ES202104539 
 Grupo BI-BGMB-2301-B2-002 
 
18 de junio de 2023 
 
 
Primera secuencia 
Secuencia introducida en BLAST 
 
ATGGGGGGTTCTCATCATCATCATCATCATGTGTTCCAGCGCGTCTGGGCGCTGACCGCCGCCTTGATGCTCATG
CTGAGCCTCGGCGCCACCAGCTCCCACGCCGCTCAAAACCCCCACGAGCGCGGCCCGGATCCCTCCAACTCCT
ACATCGAGCAAGCGCGCGGAAGTTACTCCGTCTCCCAGCGTTCCATCAGCCGACTCGGGTCGGACGGGTTCCG
TGACGGGACCATGTACTACCCGACCAGCACGGCCGACGGCCGGTTCGGCGTGGTGGCGATCTCGCCGGGCTAC
ACGGCCAGCGAGTCCACCATCGCGTGGCTCGGTCCCCGCCTGGCGTCCTTCGGGTTCGTCGTGGTGACCATCA
ACACCGACTCCCGCTACGACCAGCCCCGCCAGCGGGCGACGCAGCTGCACGCCGCGCTGGACCACGCCATCG
GCGACTCGGTCGTCGGGCCCCGGATCGACACTTCGCGTCAGGCCGTCATGGGCCACTCCATGGGCGGTGGTG
GTGCCCTCCAGGCCGCGGAGGAGCGCGACGAGATCCGGGCGGCGGTCCCGCTCACCCCCTGGAACCTCAAGA
AGGGCTGGTCGGGTGTGGACGCGGCGACCCTGGTCATCGGCGCCGAGAACGACGCCATCGCCCCGGTGCGGT
CCCACTCGATCCCGTTCTACGAGTCGCTGACCAACGCGGAGCGCCGCGCCTACCTCGAACTGCGTCGCGAGGG
CCACTTCGCGCCCAACTCCAGCAACACGCTGATCGCCAAGTACAGCGTCTCCTGGCTCAAGCGGTACGTGGACA
ACGACCTGCGCTACGACCAGTTCATCGACCGGGCCCCCGCACCGGCATCACTACGGGCGTCTCGGACTACCGG
CTCGGCTGA 
Visualización de la secuencia en SnapGene 
 
Tag de replicación 
El tag identificado este caso fue el 6x His tag, una etiqueta de purificación que es muy utilizada 
dada su amplia distribución, pequeño tamaño y alta eficiencia en la purificación. Se introducen 
en la secuencia seis residuos de histidina consecutivos, la cual tiene una alta afinidad por los 
iones de níquel y cobalto positivos, permitiendo que la proteína sea purificada al unirse a la fase 
fija de la cromatografía que incluye resinas de níquel y cobalto. 
Actúa permitiendo la unión selectiva de la proteína a la resina, destacando de las que no contiene 
el residuo que no se quedan ancladas y son eliminadas. Pueden utilizarse soluciones con 
imidazol para romper la unión entre la resina y el tag. 
Proteína codificada 
La alfa/beta hidrolasa de Streptomyces (producida por diversas bacterias del género) es una 
enzima perteneciente a la clase de enzimas alfa/beta hidrolasas. Estas enzimas son conocidas 
por su capacidad para hidrolizar una amplia variedad de sustratos, como ésteres, amidas, 
triglicéridos y otros compuestos orgánicos. Tienen una estructura plegada en forma de barril beta 
rodeada por hélices alfa, lo que les confiere una estructura característica. Esta estructura les 
permite interactuar y catalizar la hidrólisis de diferentes compuestos orgánicos. Están 
involucradas en una amplia gama de funciones 
biológicas, incluyendo la degradación de 
sustancias orgánicas en el suelo, la biosíntesis 
y degradación de lípidos y la modificación de 
metabolitos secundarios. Además, algunas 
también pueden tener aplicaciones industriales, 
como en la producción de biocombustibles o en 
la síntesis de compuestos químicos de interés. 
Kit para utilizar 
El HisPur™ Ni-NTA Purification Kit se puede utilizar para la purificación de proteínas fusionadas 
con la etiqueta 6x His. El kit utiliza resina de níquel nitrilotriacético (Ni-NTA), que tiene una alta 
afinidad por la secuencia de histidinas (His) repetida seis veces en la proteína de interés. 
Funcionamiento 
1. Preparación de la muestra: La muestra que contiene la proteína fusionada con la etiqueta 6x 
His se prepara y se lisía adecuadamente para liberar la proteína de interés. 
2. Equilibrado de la columna: La columna de afinidad se equilibra con un tampón de equilibrado 
suministrado en el kit. Esto asegura que la resina de Ni-NTA esté lista para la unión de la proteína 
6x His fusionada. 
3. Carga de la muestra: La muestra preparada se carga en la columna y se incuba para permitir 
que la proteína fusionada con la etiqueta 6x His se una específicamente a la resina de Ni-NTA. 
Durante esta etapa, la proteína 6x His fusionada se separa de otras proteínas y contaminantes 
presentes en la muestra. 
4. Lavado de la columna: Después de la carga de la muestra, se realiza un lavado con un tampón 
de lavado suministrado en el kit para eliminar las impurezas y proteínas no específicas que 
puedan haberse unido a la resina. 
5. Elución de la proteína: La proteína fusionada con la etiqueta 6x His se eluye de la resina 
utilizando un tampón de elución suministrado en el kit. Este tampón contiene una concentración 
más alta de imidazol, que compite con la unión de la proteína a la resina de Ni-NTA, permitiendo 
que la proteína se libere en una forma purificada. 
Segunda secuencia 
Secuencia introducida en BLAST 
 
 
ATGTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTAAGGGCCTTGTGCAACCCACTCGACTTCTTTTGGAATATCTTGAAGA
AAAATATGAAGAGCATTTGTATGAGCGCGATGAAGGTGATAAATGGCGAAACAAAAAGTTTGAATTGGGTTTGGAG
TTTCCCAATCTTCCTTATTATATTGATGGTGATGTTAAATTAACACAGTCTATGGCCATCATACGTTATATAGCTGACA
AGCACAACATGTTGGGTGGTTGTCCAAAAGAGCGTGCAGAGATTTCAATGCTTGAAGGAGCGGTTTTGGATATTA
GATACGGTGTTTCGAGAATTGCATATAGTAAAGACTTTGAAACTCTCAAAGTTGATTTTCTTAGCAAGCTACCTGAA
ATGCTGAAAATGTTCGAAGATCGTTTATGTCATAAAACATATTTAAATGGTGATCATGTAACCCATCCTGACTTCATG
TTGTATGACGCTCTTGATGTTGTTTTATACATGGACCCAATGTGCCTGGATGCGTTCCCAAAATTAGTTTGTTTTAAA
AAACGTATTGAAGCTATCCCACAAATTGATAAGTACTTGAAATCCAGCAAGTATATAGCATGGCCTTTGCAGGGCTG
GCAAGCCACGTTTGGTGGTGGCGACCATCCTCCAAAAGTGTTCCAGCGCGTCTGGGCGCTGACCGCCGCCTTG
ATGCTCATGCTGAGCCTCGGCGCCACCAGCTCCCACGCCGCTCAAAACCCCCACGAGCGCGGCCCGGATCCCT
CCAACTCCTACATCGAGCAAGCGCGCGGAAGTTACTCCGTCTCCCAGCGTTCCATCAGCCGACTCGGGTCGGAC
GGGTTCCGTGACGGGACCATGTACTACCCGACCAGCACGGCCGACGGCCGGTTCGGCGTGGTGGCGATCTCG
CCGGGCTACACGGCCAGCGAGTCCACCATCGCGTGGCTCGGTCCCCGCCTGGCGTCCTTCGGGTTCGTCGTG
GTGACCATCAACACCGACTCCCGCTACGACCAGCCCCGCCAGCGGGCGACGCAGCTGCACGCCGCGCTGGAC
CACGCCATCGGCGACTTCCAGGCCGCGGAGGAGCGCGACGAGATCCGGGCGGCGGTCCCGCTCACCCCCTGG
AACCTCAAGAAGGGCTGGTCGGGTGTGGACGCGGCGACCCTGGTCATCGGCGCCGAGAACGACGCCATCGCC
CCGGTGCGGTCCCACTCGATCCCGTTCTACGAGTCGCTGACCAACGCGGAGCGCCGCGCCTACCTCGAACTGC
GTCGCGAGGGCCACTTCGCGCCCAACTCCAGCAACACGCTGATCGCCAAGTACAGCGTCTCCTGGCTCAAGCG
GTACGTGGACAACGACCTGCGCTACGACCAGTTCATCGACCCGGGCCCCCGCACCGGCATCACTACGGGCGTC
TCGGACTACCGGCTCGGCTGA 
Visualización de la secuencia en SnapGene 
 
Tag de replicación 
La etiqueta "GST-FLAG" combina dos etiquetas de purificación ampliamente utilizadas en 
biología molecular y bioquímica: GST (glutatión S-transferasa) y FLAG. La GST es una enzima 
que tiene una alta afinidad por el glutatión, lo que permite la purificación de la proteína fusionada 
utilizando resinas de glutatión. Después de la purificación, la proteína puede ser eluída mediante 
el uso de glutatión reducido. Por otro lado, la etiqueta FLAG se refiere a la inserción de la 
secuencia de péptido FLAG (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) en la proteína de interés. Esta 
etiqueta permite la detección de la proteína mediante el uso de anticuerpos anti-FLAG en 
técnicas como Western blotting e inmunofluorescencia. La combinación de ambas etiquetas, 
GST y FLAG, permite la purificación y detección de la proteína de interés. La presencia del tag 
GST permite la purificación mediante cromatografía de afinidad con resinas de glutatión, mientras 
que el tag FLAG permite la detección con anticuerpos específicos. Esto facilita el estudio y 
análisis de la proteína en diferentes experimentos y aplicaciones. 
Proteína codificada 
El antígeno SJ26 TPI es un antígeno utilizado en la determinación de subgrupos sanguíneos. El 
término "SJ26" es el nombre dado a uno de los antígenos del sistema 
de antígenos de grupo sanguíneo SJ. Este sistema de antígenos es 
parte del sistema de grupos sanguíneos Duffy y está relacionado con 
la presencia o ausencia del antígeno Duffy en los glóbulos rojos. Está 
asociado con la enzima triosa fosfato isomerasa (TPI, por sus siglas 
en inglés). La TPI es una enzima implicada en la vía glucolítica y 
cataliza la interconversión de dihidroxiacetona fosfato y 
gliceraldehído-3-fosfato. El antígeno SJ26 TPI se utiliza en pruebas 
de tipificación sanguínea para determinarla presencia o ausencia del 
antígeno Duffy y su asociación con la enzima TPI. 
Kit para utilizar 
El Pierce® GST Spin Purification Kit sería el kit correcto para utilizar, funciona para complejos que 
contengan la proteína GST y otra fusionada, inmoviliza el glutatión a través de su sulfhidrilo central en el 
gel de agarosa crosslink. El kit utiliza columnas de afinidad con resina de glutatión, que tiene una 
alta afinidad por la etiqueta GST. La proteína fusionada con la etiqueta GST-FLAG puede unirse 
específicamente a la resina de glutatión a través de la interacción entre la etiqueta GST y la 
resina. 
Funcionamiento 
1. Preparación de la muestra: La muestra que contiene la proteína fusionada con la etiqueta GST 
se prepara y se lisaría adecuadamente para liberar la proteína de interés. 
2. Equilibrado de la columna: La columna de afinidad se equilibra con un tampón de equilibrado 
suministrado en el kit. Esto asegura que la resina de glutatión esté lista para la unión de la 
proteína GST fusionada. 
3. Carga de la muestra: La muestra preparada se carga en la columna y se incuba para permitir 
que la proteína fusionada con la etiqueta GST se una específicamente a la resina de glutatión. 
Durante esta etapa, la proteína GST fusionada se separa de otras proteínas y contaminantes 
presentes en la muestra. 
4. Lavado de la columna: Después de la carga de la muestra, se realiza un lavado con un tampón 
de lavado suministrado en el kit para eliminar las impurezas y proteínas no específicas que 
puedan haberse unido a la resina. 
5. Elución de la proteína: La proteína fusionada con la etiqueta GST se eluye de la resina 
utilizando un tampón de elución suministrado en el kit. Este tampón contiene una concentración 
más alta de glutatión, lo que interrumpe la interacción entre la proteína GST fusionada y la resina 
de glutatión, permitiendo que la proteína se libere en una forma purificada. 
Tercera secuencia 
Secuencia introducida en BLAST 
ATGGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGGTGTTCC
AGCGCGTCTGGGCGCTGACCGCCGCCTTGATGCTCATGCTGAGCCTCGGCGCCACCAGCTCCCACGCCGCTCA
AAACCCCCACGAGCGCGGCCCGGATCCCTCCAACTCCTACATCGAGCAAGCGCGCGGAAGTTACTCCGTCTCC
CAGCGTTCCATCAGCCGACTCGGGTCGGACGGGTTCCGTGACGGGACCATGTACTACCCGACCAGCACGGCCG
ACGGCCGGTTCGGCGTGGTGGCGATCTCGCCGGGCTACACGGCCAGCGAGTCCACCATCGCGTGGCTCGGTC
CCCGCCTGGCGTCCTTCGGGTTCGTCGTGGTGACCATCAACACCGACTCCCGCTACGACCAGCCCCGCCAGCG
GGCGACGCAGCTGCACGCCGCGCTGGACCACGCCATCGGCGACTCGGTCGTCGGGCCCCGGATCGACACTTC
GCGTCAGGCCGTCATGGGCCACTCCATGGGCGGTGGTGGTGCCCTCCAGGCCGCGGAGGAGCGCGACGAGAT
CCGGGCGGCGGTCCCGCTCACCCCCTGGAACCTCAAGAAGGGCTGGTCGGGTGTGGACGCGGCGACCCTGGT
CATCGGCGCCGAGAACGACGCCATCGCCCCGGTGCGGTCCCACTCGATCCCGTTCTACGAGTCGCTGACCAAC
GCGGAGCGCCGCGCCTACCTCGAACTGCGTCGCGAGGGCCACTTCGCGCCCAACTCCAGCAACACGCTGATC
GCCAAGTACAGCGTCTCCTGGCTCAAGCGGTACGTGGACAACGACCTGCGCTACGACCAGTTCATCGACCCGG
GCCCCCGCACCGGCATCACTACGGGCGTCTCGGACTACCGGCTCGGCTGA 
Visualización de la secuencia en SnapGene 
 
Tag de replicación 
La etiqueta 3x flag consiste en la inserción de una secuencia repetida de tres unidades del 
péptido FLAG (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) en la proteína de interés. El péptido FLAG es 
reconocido por un anticuerpo comercialmente disponible llamado anti-FLAG, que permite la 
purificación de la proteína fusionada a través de la inmunoprecipitación. La proteína fusionada 
con el 3x FLAG se une específicamente al anticuerpo anti-FLAG y se puede aislar mediante 
métodos de inmunoprecipitación, como el uso de resinas con proteína A/G o columnas de 
afinidad. Después de la purificación, la proteína puede ser eluída de manera específica utilizando 
un péptido FLAG soluble que compite con la unión del anticuerpo anti-FLAG. El 3x FLAG es una 
etiqueta versátil y ampliamente utilizada debido a su alta especificidad y eficiencia en la 
purificación de proteínas. Además, la presencia del tag FLAG generalmente tiene un impacto 
mínimo en la estructura y función de la proteína de interés, lo que lo hace adecuado para una 
variedad de aplicaciones experimentales. 
Kit para utilizar 
En este caso eligiria el Pierce™ Anti-DYKDDDDK Magnetic Agarose que se puede utilizar para 
la detección y purificación de proteínas fusionadas con la etiqueta 3x FLAG. La etiqueta 3x FLAG 
consiste en la repetición de la secuencia de péptido FLAG (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) 
tres veces. 
El anticuerpo utilizado en el sistema, el Anti-DYKDDDDK, se une específicamente a la secuencia 
de péptido FLAG, independientemente de la cantidad de repeticiones, Por lo que el kit es 
adecuado para la purificación. 
Funcionamiento 
El kit incluye los siguientes componentes: 
 
1. Resina de agarosa magnética con anticuerpo Anti-DYKDDDDK: La resina contiene 
partículas magnéticas recubiertas con el anticuerpo Anti-DYKDDDDK. Este anticuerpo se 
une específicamente a la secuencia de péptido FLAG en la proteína de interés. 
2. Buffer de lavado: Un buffer especialmente formulado para lavar la resina y eliminar 
cualquier contaminante no específico. 
3. Elución: Un buffer o solución que permite la liberación de la proteína de interés de la 
resina una vez que ha sido capturada. 
 
El procedimiento para utilizar el kit es el siguiente: 
 
1. Preparación de la muestra: La muestra que contiene la proteína fusionada con la etiqueta 3x 
FLAG se prepara y se lisaría adecuadamente para liberar la proteína de interés. 
2. Incubación con la resina: La muestra se incuba con la resina de agarosa magnética prelavada 
y se mezcla suavemente para permitir la unión específica de la proteína fusionada con la etiqueta 
DYKDDDDK al anticuerpo Anti-DYKDDDDK en la resina. 
3. Lavado de la resina: Después de la incubación, la resina se lava varias veces con el buffer de 
lavado para eliminar proteínas no específicas y otros contaminantes. 
4. Elución de la proteína: La proteína de interés se eluye de la resina utilizando un buffer de 
elución adecuado que interrumpe la interacción entre la proteína y el anticuerpo, liberándola en 
una forma purificada. 
Referencias 
Borrelli, M. (2015) Recombinant lipases and phospholipases and their use as biocatalysts for 
industrial aplications. International journal of molecular sciences. 16 (6) 
Li LZ, Shi YE, Jiagn K. [Construction of multivalent DNA vaccine against Schistosoma japonicum]. 
Zhongguo Ji Sheng Chong Xue Yu Ji Sheng Chong Bing Za Zhi. 2001;19(4):205-8. Chinese. 
PMID: 12571966. 
NIH (2023) BLAST. NIH Recuperado de https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 
Kimple, M. (2013) Overview of Affinity tags for protein purification. Current Protocol Protein 
Science. 73, 9 
ThermoFisher (2023) 6x His Tag Antibodies. Recuperado de 
https://www.thermofisher.com/antibody/primary/target/6x%20his%20tag 
https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi