1 SC Flores

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SC 1.1. LA MADURACIÓN EPIDIDIMARIA. BASES MOLECULARES Y CONSECUENCIAS. V. Flores
Los espermatozoides recién espermiados en los túbulos seminíferos, aun cuando están diferenciados desde el punto de vista ultraestructural, no poseen movilidad ni capacidad fecundante. Los espermatozoides extraídos de las vías espermáticas, luego de su paso por el epidídimo, sí poseen capacidad móvil y fecundante en tanto interactúen con moléculas del líquido tubárico. Estudios histoquímicos e inmunoquímicos muestran que en el epidídimo se modifica la organización química de superficie de los espermatozoides debido a que se le incorporan varias proteínas con diversas funciones. Por un lado le confieren capacidad de interactuar con moléculas del entorno del ovocito II, de sus cubiertas (corona radiata [radiante] y membrana pelúcida) y de la propia membrana plasmática del ovocito II. La posibilidad de realizar con éxito esta sucesión de interacciones confiere a los espermatozoides capacidad fecundante. Por ello, los cambios sufridos en el epidídimo se denominan genéricamente maduración epididimaria. Por otro lado, varias de las proteínas que se incorporan en el epidídimo mantienen a los espermatozoides estabilizados y en latencia. Estas proteínas son clásicamente denominadas factores descapacitantes, debido a que mantienen a los espermatozoides en un estado no apto para la fecundación o “descapacitado”. Dado que, en general se trata de proteínas con capacidad antigénica, también suelen ser designados genéricamente, desde otra perspectiva, como antígenos seminales.
El cuadro SC 1-1-1 incluye algunos de los cambios que clásicamente se consideran involucrados en la maduración epididimaria.
Los factores descapacitantes del líquido seminal son removidos de la superficie de los espermatozoides, en el tracto genital femenino, debido a interacciones con componentes de éste. Los espermatozoides entonces se capacitan y adquieren máxima capacidad fecundante (SC 1-4 La capacitación del espermatozoide y la reacción acrosómica). Dado que la maduración epididimaria posibilita la capacitación espermática, a la que siguen la reacción acrosómica y la hiperactivación de los espermatozoides, ha sido descrita como la adquisición de una batería de proteínas de superficie que programan al espermatozoide para las futuras interacciones con elementos del tracto genital femenino. Estas moléculas, a continuación, son estabilizadas por factores descapacitantes (Fig. SC 1-1-1). Una vez en la ampolla (sitio de encuentro de las gametas), en estado periovulatorio, los espermatozoides pierden sus factores descapacitantes e inician las interacciones que concluyen con la fecundación. El tracto genital femenino, especialmente el istmo tubárico, también contribuye a mantener a los espermatozoides descapacitados hasta el momento de la ovulación (SC 1-2 El istmo de la trompa como reservorio de espermatozoides “descapacitados”. La prevención o el retardo de la capacitación). La capacidad fecundante adquirida con la capacitación, sin embargo, es transitoria y se pierde en pocas horas. Este fenómeno suele denominarse envejecimiento del espermatozoide.
Fig. SC 1-1-1. Modificaciones de la cubierta superficial del espermatozoide a su paso por el epidídimo. A. Los espermatozoides de la cabeza carecen de las proteínas superficiales que son secretadas por el epidídimo. B. En la cola se agregan moléculas (∙) que a continuación son estabilizadas por factores descapacitantes (∩).
Los cambios sufridos en el epidídimo no sólo involucran la superficie de la cabeza del espermatozoide. También se producen cambios en algunas proteínas del flagelo involucradas en la movilidad espermática, como por ejemplo la proteína motor dineína. Con la maduración epididimaria, algunas proteínas del flagelo contribuyen a estabilizar la estructura de los microtúbulos que servirán a la movilidad espermática. El aporte de energía para la movilidad proviene de las mitocondrias concentradas en la vaina del flagelo. Al parecer, durante la maduración también las mitocondrias también sufren cambios que modifican su capacidad de generar ATP.
SC 1.2. EL ISTMO DE LA TROMPA COMO RESERVORIO DE ESPERMATOZOIDES “DESCAPACITADOS”. LA PREVENCIÓN O EL RETARDO DE LA CAPACITACIÓN. V. Flores
En la especie humana casi todos los embarazos resultan de coitos practicados en un lapso que va desde unos 6 días antes de la ovulación hasta que ésta ocurre. Esto significa que los espermatozoides pueden permanecer en el oviducto durante 6 días sin perder capacidad fecundante, vale decir, sin sufrir la reacción acrosómica, sin hiperactivarse, ni envejecer.
El concepto de “oviducto como reservorio” de espermatozoides no se refiere sólo a que los espermatozoides se hallan contenidos en el oviducto durante su transporte, o que eventualmente pueden detenerse transitoriamente en él. El concepto alude a que el oviducto en período no ovulatorio posee una fisiología tal que, al igual que los conductos deferentes del tracto genital masculino, permite mantener a los espermatozoides en latencia, es decir, en un estado “descapacitado” hasta el momento de la ovulación.
Existen varios hechos, de diversa naturaleza, que están incluidos en el concepto de “oviducto como reservorio” de espermatozoides:
a) En el nivel morfológico, se considera que las características microanatómicas de los pliegues de la mucosa oviductal contribuyen a retener espermatozoides. La mucosa presenta pliegues de trayectos anfractuosos y de diversa jerarquía (los pliegues amplios y profundos se ramifican en pliegues más delgados y, naturalmente, de menor profundidad figura SC 1-2-1 A. Por otro lado los pliegues recorren sólo un cierto trayecto a lo largo de la mucosa y se interrumpen en fondos de saco ciego, como si el surco o cauce de un río se detuviera abruptamente en un extremo cerrado o en un foso. Todas estas anfractuosidades contribuyen a que los espermatozoides que se introducen en ellas queden retenidos transitoriamente.
b) La vasculatura de la mucosa oviductal posee características histológicas similares a la que exhiben los órganos eréctiles. Por ello, se plantea que la ingurgitación de dichas redes vasculares podría generar un estado eréctil de los pliegues de la mucosa, con la consiguiente disminución de la luz y colapso de los espacios interpliegues. Se propone que este hecho puede contribuir a un “atropamiento” e inmovilización de espermatozoides entre pliegues adyacentes ingurgitados.
c, d) Por otro lado, habría conexiones funcionales entre la vasculatura ovárica y la oviductal de modo que señales generadas en el ovario podrían actuar en la mucosa oviductal promoviendo cambios en su patrón de secreciones que convierten los fluidos tubáricos, durante período no ovulatorio, en un medio apropiado para el mantenimiento descapacitado de los espermatozoides. En el nivel celular, el mecanismo circulatorio descrito contribuiría también, en sinergia con los cambios producidos por los niveles hormonales, a modificar las características moleculares del glucocáliz de la membrana apical de las células del epitelio oviductal en período no ovulatorio.
e) En el nivel molecular, los cambios del glucocáliz se refieren específicamente a una modificación en la composición de residuos azúcares de las glucoproteínas y polisacáridos que integran el glucocáliz. La interacción de estos grupos azúcares con proteínas símil-lectinas de la cubierta glucoproteica de la superficie del espermatozoide contribuye a dos hechos: 1)mantener a los espermatozoides en un estado descapacitado (de modo similar a como lo hacen los factores descapacitantes de los fluidos seminales) y 2) mantener a los espermatozoides anclados al epitelio oviductal.
Existen experimentos que indican que el estado “descapacitado” de los espermatozoides, antes de ingresar en la ampolla, es mantenido por interacciones con células del epitelio del istmo al cual los espermatozoides se adhieren (Fig. SC 1-2-1 B y 1-2-2 B). Estos experimentos muestran que la unión de los espermatozoides al epitelio depende de ciertosgrupos azúcares pertenecientes a glucoproteínas de la superficie apical de las células epiteliales.
En cultivos de bloques de mucosa ístmica y ampular del oviducto, de período no ovulatorio o estrogénico, con una suspensión de espermatozoides, se constata que los espermatozoides se unen específicamente a la mucosa. La figura SC 1-2-2 A (izquierda) muestra que, si a dicho medio de cultivo se agregan diferentes azúcares de modo que se unan a la superficie de los espermatozoides, éstos mantienen su capacidad de unión a la mucosa oviductal, salvo cuando se utiliza fucoidan (una mezcla de fucosa y fucosa-sulfato). Este hecho sugiere que la fucosa, integrante normal del glucocáliz, cumple un papel en la función de reservorio. El resultado descrito ocurre tanto en la mucosa del istmo como de la ampolla del oviducto. La figura SC 1-2-2 A (centro) muestra que el efecto descrito es dependiente de la dosis de fucoidan que se utiliza en el ensayo. Finalmente, la figura SC 1-2-2 A (derecha) corrobora el concepto ya que la eliminación de la mucosa del glucocáliz, por medio del tratamiento de la mucosa con fucosidasa (una enzima que elimina mucosa del glucocáliz), reduce significativamente la adhesión de los espermatozoides a la mucosa.
La figura SC 1-2-2 B muestra esquemáticamente la idea de que la función de reservorio está mediada por interacciones entre proteínas símil-lectinas, de la cubierta glucoproteica de la superficie del espermatozoide, y grupos azúcar del glucocáliz de las células epiteliales. El esquema incluye el dato, aportado por la microscopia electrónica de barrido, de que, generalmente, los espermatozoides unidos a la mucosa se hallan “abrazados” por las cilias, como si éstas estuvieran inmóviles y rodeando a los espermatozoides. El esquema propone que tal interacción se pierde durante la capacitación y que el espermatozoide se suelta del epitelio. Ello inicia la etapa final, que conduce a la fecundación o al envejecimiento del espermatozoide.
Fig. SC 1-2-1. A. Corte transversal de la mucosa oviductal; se ilustran los pliegues de diversas jerarquía. B. La figura muestra un espermatozoide detenido en la trompa uterina por medio de interacciones con el epitelio tubárico. Puede observarse que el espermatozoide se halla en buenas condiciones y el acrosoma se encuentra intacto. El esquema incluye el dato, aportado por la microscopia electrónica de barrido, de que, generalmente, los espermatozoides unidos a la mucosa se hallan “abrazados” por las cilias. Como si éstas estuvieran inmóviles y rodeando a los espermatozoides.
Fig. SC 1-2-2. A. Resultados de la interacción de espermatozoides con cultivos de bloques de mucosa oviductal (ístmica y ampular). Izquierda: si al medio se agregan azúcares que se unen a la superficie de los espermatozoides, sólo una mezcla de fucosa y fucosa-sulfato (fucoidan) interfiere con la unión al glucocáliz del epitelio oviductal sugiriendo que la mucosa cumple un papel en la función de reservorio. Centro: muestra que la unión es dependiente de la dosis de fucoidan agregado al medio. Derecha: el tratamiento de la mucosa con fucosidasa (una enzima que elimina fucosa del glucocáliz) reduce la adhesión de los espermatozoides a la mucosa. B. La función de reservorio está mediada por interacciones entre proteínas símil-lectinas,de la cubierta glucoproteica de la superficie del espermatozoide, y grupos azúcar del glucocáliz de las células epiteliales. El esquema propone que tal interacción se pierde durante la capacitación y que el espermatozoide se suelta del epitelio. Ello inicia la etapa final, que conduce a la fecundación o al envejecimiento del espermatozoide.
Se ha planteado que el mantenimiento de los espermatozoides dentro de las trompas cumple una función durante la fecundación:
a) por un lado explicaría la escasa cantidad de espermatozoides que se hallan en el sitio de encuentro pero durante un lapso de tiempo prolongado en las cercanías del ovocito II;
b) este hecho podría contribuir a disminuir la probabilidad de polispermia restringiendo el número de espermatozoides que llegan por unidad de tiempo. Esta hipótesis ha sido validada por medio de experimentos de extirpación quirúrgica del istmo. En varias especies, este procedimiento aumenta la tasa de polispermia.
c) la consecuencia más importante sería aumentar la probabilidad de que, en el momento de la ovulación, existan espermatozoides fecundantes aun cuando el coito haya precedido en días a la fecundación. Probablemente la adhesión al epitelio del istmo tubárico se pierda cuando se produce la ovulación. Todos estos datos indican que la capacidad fecundante o capacitación se adquiere principalmente en la ampolla (sitio de encuentro), en el momento de la ovulación y que tal capacidad es transitoria pues le sigue el envejecimiento.
También existen estudios realizados en seres humanos que indican que el cuello uterino también puede almacenar espermatozoides. Allí los espermatozoides pueden mantenerse descapacitados, durante varios días, en las criptas de las glándulas del cuello uterino y en sucesivas oleadas son llevados hacia el sitio de encuentro.
SC 1.3. EL TRANSPORTE DE LOS ESPERMATOZOIDES. EL PAPEL DE LA MOVILIDAD PROPIA DEL ESPERMATOZOIDE. V. Flores
La movilidad espermática es un dato importante del espermograma. El déficit en la movilidad se asocia a infertilidad. Se suele concluir, en consecuencia, que los espermatozoides ascienden hasta el sitio de encuentro gracias a su movilidad y que el déficit en la movilidad impide o dificulta el ascenso y el encuentro con el ovocito II. Esta conclusión probablemente sea errónea.
El espermatozoide está programado para cumplir en plenitud su capacidad móvil en el momento del encuentro y no durante el ascenso hacia el sitio de encuentro (Fig. SC 1-3-1). Así, la movilidad propia del espermatozoide debe desempeñar un papel menor en el ascenso, en tanto que el tracto genital femenino desempeña un papel principal. Nótese que los espermatozoides empiezan a llegar al sitio de encuentro en sólo unos 30 minutos luego de depositados en la vagina. Mediciones sobre las velocidades máximas que desarrollan los espermatozoides y estimaciones sobre la potencia de la fuerza propulsora del flagelo indican que los espermatozoides no podrían desplazarse a la velocidad que se requiere para recorrer tal distancia en sólo 30 minutos.
Fig. SC 1-3-1. A. Patrón de movilidad del espermatozoide en el eyaculado. B. Cambio en el patrón de movilidad del espermatozoide una vez que éste se encuentra en el sitio de encuentro. Tal cambio, al igual que la reacción acrosómica, es provocado por moléculas que se encuentran en el líquido folicular.
Una vez en el sitio de encuentro, sin embargo, la movilidad propia desempeña un papel crucial pues es estimulada por el líquido folicular que también induce la reacción acrosómica. Los espermatozoides encuentran al ovocito II rodeado por la corona radiante (células foliculares unidas por una alta concentración de ácido hialurónico). El ácido hialurónico es degradado por enzimas acrosómicas, entre ellas la hialuronidasa. La velocidad de toda reacción enzimática depende, entre otros factores, de la energía cinética del medio. La hiperactivación de los espermatozoides contribuye a aumentar la energía cinética del medio, facilitar la degradación del ácido hialurónico, disminuir la cohesión de las células foliculares y a dispersarlas. Estos efectos facilitarían que los espermatozoides puedan atravesar la corona radiante y llegar al ovocito II.La hiperactivación también aumenta la energía cinética del espermatozoide y, en consecuencia, la probabilidad de colisión con la membrana pelúcida.
No existen datos concluyentes sobre la existencia de un mecanismo quimiotáctico que direccione los espermatozoides hacia el ovocito II, aunque algunos resultados experimentales lo sugieren.
Otro “momento” en el que la movilidad propia del espermatozoide es crucial ocurre durante la penetración de la membrana pelúcida. Éste también es un proceso de degradación enzimática (acrosina yneuraminidasa) incrementado por la frecuencia de colisión de la membrana acrosómica interna, que expone la cabeza del espermatozoide, contra sus sustratos de la membrana pelúcida. El aumento de la degradación sumado a la propulsión del flagelo posibilita la penetración de la membrana pelúcida y el contacto con el ovocito II.
Es importante el dato experimental de que los espermatozoides que son incubados con líquidos foliculares de diferentes folículos no se comportan similarmente. Algunos líquidos foliculares son muy eficaces en producir hiperactivación y otros no. Es significativo el hecho de que, en el caso de los líquidos foliculares que estimulan la hiperactivación, la fecundación se produce en un alto porcentaje y que, en el caso contrario, no se produce fecundación.
Todos estos datos sugieren que la movilidad propia del espermatozoide y su déficit asociado a la infertilidad probablemente se deba principalmente al importante papel que la movilidad espermática adquiere en el sitio de encuentro.
SC 1.4. LA CAPACITACIÓN DEL ESPERMATOZOIDE Y LA REACCIÓN ACROSÓMICA. V. Flores
Varios estudios clásicos de fecundación in vitro mostraron que los espermatozoides recién eyaculados incubados con ovocitos II tardan un cierto tiempo en iniciar la fecundación. Los espermatozoides que han estado en contacto con fluidos tubáricos fecundan más rápido (Fig. SC 1-4-1).
Fig. SC 1-4-1. El grafico muestra que los espermatozoides extraídos del oviducto o los que son incubados en fluidos del oviducto fecundan más rápido que los recién eyaculados.
Esta capacidad aumenta en función del tiempo de permanencia en el tracto genital femenino. Los espermatozoides en vías de capacitación, si son devueltos al líquido seminal se “descapacitan”; vale decir, pierden la capacidad adquirida en contacto con los fluidos del tracto genital femenino. Ello se debe a que el líquido seminal posee factores denominados “descapacitantes” que contribuyen a mantener en latencia a los espermatozoides (SC 1-1 La maduración epididimaria. Bases moleculares y consecuencias). La capacitación es el resultado de la pérdida de moléculas estabilizadoras y “descapacitantes” del líquido seminal que se adquirieron durante la maduración epididimaria (Fig. SC 1-4-2). Una vez iniciada la capacitación se inicia el envejecimiento de los espermatozoides y pierden capacidad fecundante en unas 12 horas.
Fig. SC 1-4-2. El esquema ilustra el probable comportamiento de algunas moléculas presentes en la cubierta de superficie del espermatozoide durante la capacitación. A. En los espermatozoides recién eyaculados, la moléculas de la superficie del espermatozoide (∙) que intervienen en la fecundación se hallan enmascaradas por moléculas descapacitantes (∩). Este hecho dificulta la fecundación. B. Después de cierto tiempo en contacto con fluidos tubáricos se desprenden los factores descapacitantes y quedan expuestos los que intervienen en la fecundación. C. Con el tiempo, los espermatozoides también van perdiendo las moléculas (∙) agregadas en la cola del epidídimo. Éstas se pierden desde el extremo del acrosoma hacia el polo opuesto. La letra R seguida de los signos – o + aluden a cómo las reacciones (R) de laboratorio realizadas para detección de moléculas (.) dan resultados negativos (-) o positivos (+) dependiendo del tiempo transcurrido dentro del tracto genital femenino en período ovulatorio (capacitante).
Existen muchas dudas y discordancias en la literatura respecto de numerosos fenómenos moleculares involucrados en la capacitación y, al parecer, existen muchas diferencias dependientes de la especie. La capacitación conduce a la reacción acrosómica y la hiperactivación del espermatozoide, y en general se considera que se debe a la reversión de fenómenos que ocurrieron durante la maduración epididimaria, que los mantienen estabilizados en latencia, y al capacitarse adquieren rápida y sincrónicamente capacidad fecundante.
El cuadro SC 1-4-1 muestra algunos datos clásicos sobre cambios involucrados en la capacitación.
Existen muchos datos, no siempre coherentes, acerca de los fenómenos moleculares involucrados en la producción de la reacción acrosómica. Mencionamos a continuación los más comunes:
a) Algunas proteínas del fluido de la ampolla, entre ellas la albúmina, remueven colesterol de la membrana plasmática; ello aumenta su fluidez y facilita la fusión de membranas necesaria para la reacción acrosómica.
b) Durante la capacitación se produce intercambio de iones con el medio. En algunas especies se eliminan iones K+ y la la membrana plasmática se hiperpolariza. A este fenómeno le sigue la entrada de Ca+2 y bicarbonatos que, por un lado, activa la producción de AMPc y, por otro, facilita la fusión de membranas necesaria para la reacción acrosómica. En algunas especies, la entrada de Ca+2 depende de la unión de polisacáridos del medio, que contienen fucosa, a un receptor del espermatozoide. Esta interacción permite la entrada de Ca+2. En mamíferos, la unión de estos receptores a sus ligandos produciría una despolarización de la membrana con la apertura de canales de Ca+2 dependientes de voltaje. La entrada de Ca+2 facilita la fusión de las membranas acrosómica externa y plasmática, la formación de poros y la consiguiente exocitosis del contenido.
c) También es sabido que existen procesos de fosforilación de proteínas de la membrana que contribuyen a estos cambios.
d) Otro hecho conocido es la eliminación de glucoproteínas “descapacitantes” de la superficie del espermatozoide, que enmascaran sitios de reconocimiento para la membrana pelúcida, Así, la capacitación también aumenta la probabilidad del primer contacto-reconocimiento entre el espermatozoide y la membrana pelúcida.
Algunos de estos fenómenos son coherentes con el hecho de que la incubación de espermatozoides en medios de cultivo que contienen albúmina, Ca+2 y bicarbonato estimula la capacitación. El cultivo en presencia de líquido folicular del oviducto también estimula la capacitación.
e) Para el caso de los espermatozoides que contactan con la membrana pelúcida sin haber sufrido la reacción acrosómica, ésta se desencadena por la interacción de la ZP3 de la membrana pelúcida con sus proteínas receptoras de la superficie del espermatozoide. Debido a esta interacción se abren canales de Ca+2. El aumento de este ión en el espermatozoide desencadena rápidamente la fusión entre la membrana plasmática y la membrana acrosómica interna y la producción de la reacción acrosómica.
f) Se sabe en la actualidad que la capacitación y la reacción acrosómica consisten en una respuesta compleja del espermatozoide que implican múltiples modificaciones y que involucran a varias vías de señalización celular.
SC 1.5. EL PAPEL DE LA REDUNDANCIA DE ESPERMATOZOIDES, DE LA REACCIÓN ACROSÓMICA Y DE LA MOVILIDAD ESPERMÁTICA.V. Flores
El gran número de espermatozoides necesarios para la capacidad fecundante (SC 1-5 Utilidad del espermograma) resulta del hecho de que los espermatozoides, con excepción de la etapa de penetración del ovocito II, cumplen sus funciones cooperativamente, como población celular, y no aislada o independientemente. La mayor parte de los espermatozoides cumple sus funciones de modo que unos pocos tienen la posibilidad de penetrar la membrana pelúcida y, un número menor aún, tome contacto con el ovocito II. En consecuencia no desempeñan todos el mismo papel. El ovocito por otro lado se encuentra programado de modo que sólo uno consume la fecundación.
Los espermatozoides constituyen una población heterogénea: no poseen el mismo grado de maduración, de movilidad, de estabilidad. Ni siquiera poseen similar vida media, algunos mueren en el tracto genital femenino mucho antes que otros. Sin embargo, como población, poseen cierto grado de maduración, de capacidad móvil y estabilidad que les permite realizar similares comportamientos, pero con diferente sentido biológico.
En la especie humana, en el volumen eyaculado se hallan unos 300 millones de espermatozoides. Sin embargo, en el sitio de encuentro sólo sehallan, en forma permanente, unos 200 a 400 espermatozoides. Ello se debe a que aquellos que llegan más temprano cumplen sus funciones mientras están “de paso” por el sitio de encuentro. En efecto, los que llegan primero al sitio de encuentro, como consecuencia de a) la alta concentración del líquido folicular, b) se capacitan, c) sufren la reacción acrosómica (liberan enzimas), d) se hiperactivan, aumentan la energía cinética del medio, d) contribuyen a dispersar células de la corona radiante y convertirla en una capa laxa que pueda ser atravesada. Estos espermatozoides no poseen papel fecundante: realizan sus funciones lejos del ovocito II, no se fusionan con él, liberan grandes cantidades de enzimas denudantes (hialuronidasa), pierden capacidad fecundante (envejecen) y son llevados en su viaje ascendente hacia el peritoneo.
Fig. SC 1-5-1. El dibujo muestra el resultado experimental de sumergir el ovocito junto con la corona radiante en una solución con colorante (fondo negro). Nótese que el colorante no penetra entre las células foliculares salvo en la periferia. Ello se debe a la presencia de una densa matriz extracelular entre las células foliculares. Los espermatozoides deben degradar la mayor parte de dicha matriz extracelular y dejar zonas de membrana pelúcida expuestas (denudación) antes de que algún espermatozoide pueda realizar el contacto-reconocimiento con la membrana pelúcida.
Existe una gran diferencia temporal entre los espermatozoides que llegan primero y los que llegan últimos. Los primeros en llegar al sitio de encuentro sufren la reacción acrosómica y se encargan de producir la denudación de la corona radiante y exponer la membrana pelúcida a los espermatozoides que llegan más tarde. Este fenómeno requiere la participación de una gran cantidad de espermatozoides ya que el paso a través de la corona radiante y su desagregación requiere una cantidad abundante de enzimas acrosómicas. La corona radiante, pese a su aspecto histológico de células en apariencia laxamente distribuidas, posee una densa malla de proteínas de matriz extracelular que dificulta el acceso de moléculas del medioambiente a su intersticio (Fig. SC 1-5-1). Los últimos se han mantenido sin realizar la reacción acrosómica: a) llegan “tarde” al sitio de encuentro, b) cuando se hiperactivan aumentan su probabilidad de colisión con la membrana pelúcida, c) no han sufrido la reacción acrosómica, d) poseen la membrana periacrosómica intacta y pueden realizar el primer contacto, mediado por la ZP3, con la membrana, e) sufren la reacción acrosómica provocada por la ZP3 de la membrana pelúcida y en consecuencia f) tienen su dotación enzimática acrosómica intacta. Son éstos los espermatozoides que, desde el punto de vista probabilístico, poseen papel fecundante.
SC 1.6. EL CONTACTO Y RECONOCIMIENTO ENTRE LAS GAMETAS. V. Flores
Pese a que los mamíferos son especies de fecundación interna, todavía conservan fenómenos moleculares adquiridos evolutivamente por ancestros muy lejanos, que garantizan la eficacia de las interacciones entre gametas de la misma especie que conducen a la fecundación. Estos mecanismos específicos de especies son esenciales en los animales de fecundación externa. Los organismos superiores son de fecundación interna y han adoptado muchos mecanismos nuevos, más elaborados y correspondientes a otros niveles de organización del individuo (celulares, histológicos, anatómicos, funcionales y conductuales) que garantizan la especificidad de especie en la fecundación. Éstos fallan sólo cuando se trata de especies muy emparentadas que aún están en proceso de especiación. No basta la colisión entre las gametas para que se produzca la fecundación. Se requieren varios mecanismos específicos de contacto y reconocimiento para el éxito de la fecundación.
a) El primer contacto-reconocimiento se produce entre la membrana periacrosómica del espermatozoide y la membrana pelúcida del ovocito. En consecuencia, requiere que no se haya producido la reacción acrosómica. Este reconocimiento estaría mediado por varias proteínas de la membrana periacrosómica que se unen específicamente a restos glúcidos de la glucoproteína Zp3 de la membrana pelúcida. Esta interacción desencadena la reacción acrosómica y la membrana periacrosómica es eliminada. Diversos experimentos de interacción entre espermatozoides y ovocitos in vitro muestran que, si se incuban los ovocitos con concentraciones crecientes de espermatozoides, el número de espermatozoides unidos a la membrana pelúcida aumenta hasta un cierto punto, luego del cual el número de espermatozoides que se pegan a la membrana ya no aumenta. Cuando esto ocurre, sólo un pequeño porcentaje de la superficie de la membrana pelúcida está ocupada por espermatozoides. Ello indica que los espermatozoides no pueden unirse a toda la superficie expuesta de membrana pelúcida sino sólo a sitios en donde se concentran las moléculas que median el contacto-reconocimiento (Fig. SC 1-6-1).
Fig. SC 1-6-1. Contacto-reconocimiento entre espermatozoides y membrana pelúcida. En el momento en que, en experimentos de unión espermatozoide-membrana pelúcida, la capacidad de la membrana para fijar espermatozoides se ha saturado, vale decir, se hallan todos los sitios potenciales de unión ocupados por espermatozoides, sólo una pequeña parte de la superficie de la membrana pelúcida tiene espermatozoides en contacto.
b) El segundo contacto se produce luego de producida la reacción acrosómica que expone al exterior la membrana acrosómica interna. Ésta posee proteínas que se unen a la membrana pelúcida. Una de ellas es la proteína Ph20 que se une específicamente a la proteína Zp2 de la membrana pelúcida. Dado que ésta es una red de proteínas Zp3 y Zp2 unidas por Zp1 (Fig. SC 1-6-2), el espermatozoide que ha sufrido la reacción acrosómica transfiere fácilmente su contacto inicial mediado por la unión a la Zp3 por el segundo contacto mediado por la unión a la Zp2. Las enzimas acrosina, neuraminidasa y otras del acrosoma permiten la penetración de la membrana pelúcida. Una vez que el espermatozoide la atraviesa, se encuentra con la membrana plasmática del ovocito y se inicia la activación de este último.
Fig. SC 1-6-2. A. Modelo de la red de proteínas que componen la membrana pelúcida. Se trata de una malla de filamentos formados por interacciones entre la ZP3 y la ZP2. La ZP1, que interactúa con ambos tipos de proteínas, une dichos filamentos formando una red tridimensional. La ZP3 y sus grupos azúcares son esenciales para el contacto primario. La ZP2 lo es para el contacto secundario. B. Este resultado experimental muestra que el agregado de Zp3, solubilizada, al medio de fecundación in vitro, inhibe la unión a la membrana pelúcida en forma dependiente de la concentración. La Zp3 sin sus restos glúcidos pierde dicha capacidad. El agregado de las proteínas Zp1 y Zp2 al medio no altera la unión del espermatozoide a la membrana pelúcida. (Modificado de Bleil y Wassarman, 1980, y Wassarman, 2005)
c) El tercer contacto-reconocimiento se produce entre proteínas de superficie del espermatozoide, que operan como ligandos, y proteínas receptor de la membrana plasmática del ovocito. Este proceso involucra varios fenómenos moleculares que inician varios procesos de señalización celular con diferentes consecuencias (SC Recepción y transducción de señales. Vías de señalización intracelular; SC 1-7 La activación del ovocito y la activación del programa de la embriogénesis temprana. El contacto espermatozoide ovocito como señal para el inicio de vías de señalización intracelular). Por un lado se inicia la fusión de las membranas de las gametas y, a continuación, este proceso se inhibe por medio del bloqueo rápido de la polispermia. Si bien el proceso de fusión de membranas es bastante complejo, se sabe que la proteína fusógena fertilina, una de las proteínas de la membrana posacrosómica del espermatozoide, está involucrada en este tercer contacto. La fertilina se une específicamente a proteínas integrinas de la membrana plasmáticadel ovocito y ello contribuye al inicio de la fusión de las membranas de ambas gametas (SC Fusión de membranas y bloqueo rápido de la polispermia).
SC 1.7. LA ACTIVACIÓN DEL OVOCITO Y LA ACTIVACIÓN DEL PROGRAMA DE LA EMBRIOGÉNESIS TEMPRANA. EL CONTACTO ESPERMATOZOIDE OVOCITO COMO SEÑAL PARA EL INICIO DE VÍAS DE SEÑALIZACIÓN INTRACELULAR. V. Flores
El proceso de activación es en general descrito como una “cascada” o sucesión de eventos ordenados temporalmente que se inician en el momento del contacto espermatozoide-ovocito (E-O). Es natural suponer que los eventos del desarrollo embrionario se sucedan ordenadamente. También es natural suponer que, en procesos como la activación, todos los fenómenos se presentan en sucesión ordenada y que cada uno es causa desencadenante del siguiente. Sin embargo, a veces no es así; muchos fenómenos biológicos consistentes en secuencias de eventos son el resultado de procesos que corren en paralelo pero sincronizadamente.
En el caso de la activación del ovocito II, es probable que el contacto-reconocimiento E-O involucre a una o más proteínas receptores de membrana del ovocito II, y que diversas moléculas de la superficie del espermatozoide operen como ligando o señales que inician varias vías de señalización intracelular (SC Recepción y transducción de señales. Vías de señalización intracelular). Éstas conducen a la ejecución de varios procesos con diferentes sentidos biológicos. Por ese motivo, más que una cascada de eventos, muchos fenómenos de la activación, aun cuando se producen en un orden cronológico definido, corresponden a varias cascadas que corren en paralelo y que permiten integrar todos los fenómenos que deben ocurrir desde el contacto E-O hasta la formación de la célula huevo.
Los procesos incluidos, por diversos autores, en la activación del ovocito pueden ser categorizados de la siguiente manera:
1. Fenómenos vinculados al ingreso del núcleo y el centríolo del espermatozoide:
a) Fusión de membranas. Proceso necesario para la fusión de ambas gametas y la formación de la célula huevo. En muchas especies requiere que la membrana del ovocito se encuentre con un potencial de reposo de –90 mV (SC Fusión de membranas y bloqueo rápido de la polispermia).
b) Penetración. La fusión de membranas no garantiza el ingreso del núcleo y del centríolo del espermatozoide. La incorporación de dichos elementos al citoplasma del ovocito depende de la operación de fuerzas similares a las involucradas en la fagocitosis. La generación de estas fuerzas depende del inicio de fenómenos contráctiles que implican una reorganización del citoesqueleto cortical. Ello permite la formación de una abertura lo suficientemente grande, en la corteza del ovocito, para el ingreso del núcleo del espermatozoide y la emisión de seudópodos que rodean al núcleo y lo arrastran al interior.
c) Migración del pronúcleo masculino. En especies con ovocitos voluminosos, el núcleo del espermatozoide recorre un largo trecho dentro del citoplasma del ovocito, hacia la región del polo animal del ovocito donde normalmente se forma el pronúcleo femenino. En este proceso participan el centríolo del espermatozoide y el citoesqueleto del ovocito II. El centríolo opera como centro organizador de microtúbulos y nuclea fascículos de microtúbulos a partir de tubulina almacenada en el citoplasma del ovocito. Estos fascículos de microtúbulos se ensamblan luego con la red de microtúbulos propia del ovocito.
2. Fenómenos vinculados al bloqueo de la polispermia:
Estos fenómenos impiden que el ovocito sea fecundado por más de un espermatozoide.
a) Bloqueo temprano o rápido. Depende de una despolarización transitoria de la membrana del ovocito debido al ingreso de Na+. El contacto con el primer espermatozoide produce la despolarización que lleva el potencial de membrana a unos +20 mV. Ello evita la fusión de membranas con nuevos espermatozoides (SC Fusión de membranas y bloqueo rápido de la polispermia). No se sabe si en la especie humana opera este proceso de bloqueo de la polispermia.
b) Bloqueo tardío o definitivo. Depende de la reacción cortical del ovocito por medio de la cual se exocita el contenido de las vesículas corticales. La reacción cortical posee varios efectos: el más importante es la degradación de las proteínas receptores Zp3 y Zp2 de la membrana pelúcida que reconocen a proteínas del espermatozoide. Luego de ocurrida la reacción cortical queda anulado el reconocimiento E-O. La membrana pelúcida se vuelve irreconocible por nuevos espermatozoides y también se sueltan los espermatozoides que ya se encontraban unidos a la membrana pelúcida o penetrándola.
3. Fenómenos vinculados al inicio del programa de desarrollo de la embriogénesis temprana.
a) Terminación de la meiosis. Se inician procesos que conducen a la finalización de la meiosis II que dependen de la puesta en marcha de fenómenos cíclicos de degradación y síntesis de proteínas de control del ciclo celular o ciclinas. Las ciclinas forman complejos con proteínas enzimáticas denominadas genéricamene cinasas a las que activan. Las cinasas fosforilan una variedad de proteínas involucradas en el control del ciclo celular. De las ciclinas dependen la continuación de la miosis II y también el control temporal o periodicidad de los ciclos proliferativos durante la segmentación. El aumento del Ca+2 intraovocitario, operando como segundo mensajero, inicia la degradación de ciclinas; ello permite la salida del estado de metafase y la finalización de la meiosis II.
b) Sincronización de los pronúcleos. En el momento de la fecundación, los núcleos del espermatozoide y del ovocito II se encuentran en diferente estado. El espermatozoide ha completado la meiosis, su núcleo posee un conjunto haploide [n] de cromosomas simples y el ADN está en un estado de máxima compactación. La compactación se debe a las proteínas básicas protaminas que interactúan, por un lado con el ADN y, por otro, entre sí por medio de numerosos puentes disulfuro formados entre residuos laterales de sus aminoácidos. En este estado, el ADN espermático no puede ser replicado ni transcrito. El ovocito II, por su parte, se encuentra detenido en la metafase de la segunda división meiótica. Mientras el ovocito completa la meiosis, el núcleo del espermatozoide se descondensa. La envoltura nuclear, debido a procesos de fosforilación, se desensambla y el material nuclear entra en contacto con el citoplasma del ovocito. El glutatión citoplasmático reduce los puentes disulfuro de las protaminas, el ADN se descondensa y las protaminas son reemplazadas por las proteínas básicas histonas sintetizadas y almacenadas en el ovocito. La envoltura nuclear se reconstituye rápidamente y se inicia la replicación del ADN espermático. Así se forma el pronúcleo masculino que sigue siendo haploide pero con cromosomas duplicados. Simultáneamente, el núcleo del ovocito, luego de finalizar la meiosis II, replica su ADN formándose el pronúcleo femenino haploide con cromosomas duplicados. Estos procesos ocurren mientras los pronúcleos se desplazan uno hacia el otro debido a fuerzas generadas sobre haces de microtúbulos organizados por el centríolo del espermatozoide pero ensamblados a partir de proteínas tubulinas, MAP, etc. del ovocito. En mamíferos, el proceso de migración de los pronúcleos insume unas 12 horas.
c) Activación del programa de la embriogénesis. El programa de la embriogénesis temprana ya está “impreso” en la organización molecular del citoplasma del ovocito. El gran tamaño de la célula huevo se debe en buena medida al almacenamiento de moléculas informativas que se sintetizan durante la ovogénesis a partir de información genética materna. Debido a ello se considera que la etapa más temprana del desarrollo se encuentra sólo bajo control genético materno (SC 2.4. El concepto control genético materno (CGM) de la embriogénesis temprana). El genoma aportado por el espermatozoide aún no participa. En el citoplasma del ovocito se encuentran almacenados diferentes tipos de moléculas informativas: a) en principioposee una reserva de gran variedad de proteínas y ARN ribosómicos y posee una gran cantidad de ribosomas; b) posee los ARN mensajeros necesarios para sintetizar una gran variedad de proteínas (se estima unos 30 a 50 mil tipos) que participan en el desarrollo temprano; c) posee una reserva de ARN de transferencia necesarios para la síntesis de nuevas proteínas; d) proteínas enzimáticas y proteínas reguladoras de enzimas (ciclinas, quinasas dependientes de ciclinas, enzimas calcio-sensibles, etc.; e) proteínas que integran diferentes vías de señalización intracelular; f) proteínas estructurales que participan de la organización del citoesqueleto, que mantienen la organización interna de todos los elementos del ovocito y que participan del ensamblado y la orientación de los husos mitóticos durante cada división celular.
Todos los elementos moleculares mencionados constituyen un programa de desarrollo que se elabora durante la ovogénesis y que se encuentra bloqueado en el ovocito II. La activación del programa de desarrollo consiste en poner en marcha este sistema de desarrollo que se halla en latencia. Los eventos de la activación del programa de desarrollo son clasificados arbitrariamente como tempranos y tardíos. El proceso se inicia con la activación de receptores como por ejemplo los receptores tirosina-quinasa y/u otros que siguen con la vía de señalización del inositol trifosfato o IP3. Esta vía de señalización ha sido exhaustivamente estudiada en el ovocito fecundado (SC 1-8 La vía de señalización del IP3 en la activación del programa de la embriogénesis temprana).
SC 1.8. LA VÍA DE SEÑALIZACIÓN DEL IP3 EN LA ACTIVACIÓN DEL PROGRAMA DE LA EMBRIOGÉNESIS TEMPRANA. V. Flores
Existen varios modelos sobre el modo como se activa esta vía de señalización en el inicio de la activación (Fig. SC 1-8-1).
Un modelo propone que la vía se inicia por medio de la activación del receptor del tipo tirosina-quinasa de la membrana del ovocito II que reconoce moléculas del espermatozoide. Los receptores clásicos de este tipo tienen un dominio extracelular que posee el sitio de alta afinidad para la molécula señal, un dominio transmembrana y un dominio intracelular. Cuando el receptor interactúa con la molécula señal, el receptor se dimeriza y los dominios intracelulares se fosforilan recíprocamente en residuos laterales del aminoácido tirosina. La fosforilación genera sitios de alta afinidad para una variedad de moléculas adaptadoras a partir de las cuales se pueden generar una variedad de interacciones moleculares que inician varias vías intracelulares de señalización. Una de las proteínas que se activan por interacción con dominios intracelulares activados de los receptores de tirosina-quinasa es la fosfolipasa C tipo γ.
Otro modelo propone que el receptor para espermatozoides de la membrana del ovocito está asociado a una enzima tirosina-quinasa. Esta enzima, que se activaría luego de la interacción receptor-ligando, activa a la fosfolipasa C del ovotico.También se ha propuesto que el receptor para espermatozoide estaría asociado a una proteína G que podría activar a una fosfolipasa C tipo β del ovocito. Finalmente, existen datos que indican que el espermatozoide posee un pool propio de laenzima fosfolipasa C tipo ζ que serían aportados al ovocito durante la fusión E-O, y que esta enzima tendría, principalmente, a su cargo la continuación de la vía de señalización.
No está descartado que todos estos procesos puedan estar incluidos, y actúen sinérgicamente, en la activación de la vía del IP3 en el inicio de la activación del ovocito.
Fig. SC 1-8-1. Se ilustran dos modelos por medio de los cuales se podría iniciar la vía de señalización del IP3. En ambos casos se activa una fosfolipasa C que genera IP3 y DAG que inician cascadas de reacciones que cumplen funciones complementarias. El IP3, hidrosoluble, difunde en citosol y conduce a la liberación de Ca+2. El DAG, liposoluble, difunde en la membrana. Ambos promueven la activación de la proteína-quinasa C y a través de ella la activación de un antitransportador Na+-H+.
En general hay acuerdo en que el siguiente paso está mediado por una o más de las fosfolipasas C mencionadas. Ésta genera los segundos mensajeros inositol trifosfato o IP3 y diacilglicerol o Dag a partir del fosfolípido fosfatidil inositol de la membrana plasmática del ovocito (SC Fosfolípidos. Fosfolipasas C. El fosfatidil inositol (PI) como fuente de moléculas señal: el inositol trifosfato (IP3) y el diacilglicerol (DAG)). El IP3 se une a canales de Ca+2 ‒que poseen un receptor para IP3‒ de las membranas del retículo endoplasmático liso. La apertura de estos canales produce liberación de Ca+2 al citosol.
Todos estos fenómenos se inician en el sitio de contacto con el espermatozoide y desde allí se propagan hasta el polo opuesto. La liberación de Ca+2 se propaga como una onda a través de la corteza del ovocito gracias a que el retículo endoplasmático liso de la corteza posee canales sensibles al Ca+2. El aumento de Ca+2 produce varios efectos:
a) desencadena la reacción cortical, 
b) forma complejos con proteínas sensibles al Ca+2 y estos complejos producen activaciones de diversas enzimas citoplasmáticas, 
c) contribuye a activar a la proteína-quinasa C que activa a un antitransportador de Na+ y protones (H+); el ingreso de Na+ se acompaña del egreso de H+ y debido a ello disminuye el pH citoplasmático; d) el DAG, por su parte, tam
bién activa a la proteína-quinasa C por lo cual ambos IP3 y DAG conducen al mismo efecto,
e) el Ca+2 también activa a una quinasa que fosforila NAD+ generando NADP+ que actúa como coenzima en la síntesis de lípidos; éstos son importantes en el proceso de biogénesis de membranas que ocurre cuando se inicia la proliferación de la célula huevo.
Es común clasificar los eventos de la activación del ovocito II en tempranos y tardíos (SC 1-7 La activación del ovocito y la activación del programa de la embriogénesis temprana. El contacto espermatozoide ovocito como señal para el inicio de vías de señalización intracelular). En general se denominan tempranos aquellos descritos hasta el momento en que se produce el aumento del pH de ovocito II. Todos los eventos descritos hasta ese momento son cambios iónicos y no involucran fenómenos biosintéticos. Luego del aumento en la concentración de Ca+2 y del pH citoplasmático se inician fenómenos tardíos de la activación. Éstos corresponden a fenómenos biosintéticos e involucran la activación de macromoléculas que se encuentran almacenadas en el ovocito tales como enzimas, ARNm, transportadores de membrana, etc.; también se inicia la activación de ribosomas. Todos estos fenómenos llevan al inicio de los fenómenos de síntesis de proteínas y de ADN y se pone en marcha el programa de la embriogénesis temprana. En muchas especies durante esta etapa no es necesaria la expresión de los genes de la célula huevo. Vale decir, la síntesis de proteínas es independiente de la síntesis de ARNm. Esto es así debido a que las moléculas informativas que se utilizan fueron almacenadas durante la ovogénesis. Por ello este fenómeno se denomina activación. El ovocito ya está programado para el inicio del desarrollo pero se encuentra bloqueado. El espermatozoide opera como señal que desbloquea el programa. Aunque no se sabe con precisión qué moléculas del espermatozoide son las que inician estos fenómenos, existen indicios de que ciertas proteínas perinucleares del espermatozoide están involucradas en la activación del ovocito aunque su papel exacto es por el momento desconocido.
SC 1.9 EL BLOQUEO DEFINITIVO DE LA POLISPERMIA. LA REACCIÓN CORTICAL. V. Flores
Se denomina reacción cortical a un conjunto de procesos que ocurren en la corteza del ovocito II que impiden el ingreso de espermatozoides supernumerarios luego de que un primer espermatozoide realizó el contacto espermatozoide-ovocito (E-O)(Fig. SC 1-9-1). Dado que el bloqueo temprano es transitorio, la reacción cortical posee como función evitar:
a) que los espermatozoides libres realicen el contactoprimario con la membrana pelúcida, 
b) eliminar aquellos que ya lo hicieron y se encuentran unidos a la ZP3, 
c) impedir que los que se encuentran atravesando la membrana pelúcida, unidos a la ZP2, puedan llegar hasta la membrana del ovocito II.
La reacción cortical está incluida entre los fenómenos tempranos de la activación del ovocito (SC 1-7 La activación del ovocito y la activación del programa de la embriogénesis temprana. El contacto espermatozoide-ovocito como señal para el inicio de vías de señalización intracelular) y es una de las respuestas desencadenadas por las vías de señalización que se inician con el contacto E-O. Consiste, básicamente, en la exocitosis de las vesículas corticales; se inicia en el sitio de contacto E-O y se propaga hasta el polo opuesto. Depende de la fusión Ca+2-dependiente entre la membrana de las vesículas corticales y la membrana plasmática. Se inicia debido al incremento en la concentración intraovocitaria de Ca+2, unos 10-20 segundos luego del contacto E-O. Las proteínas Snares como la sinaptobrevina, sintaxina, sinaptotagmina y otras, que están involucradas en diversos procesos de exocitosis (liberación de hormonas o de neurotransmisores), direccionan y fijan las vesículas corticales a la membrana plasmática del ovocito y a continuación producen la exocitosis (SC Comportamientos moleculares involucrados en la exocitosis de las vesículas corticales).
La reacción cortical, debido a la variedad de sustancias exocitadas, tiene varias consecuencias que derivan en un eficaz bloqueo definitivo de la polispermia:
a) Se liberan proteasas que degradan los puentes o complejos formados entre proteínas de la membrana pelúcida y glicoproteínas de la membrana del ovocito. Estos complejos tienen la función de mantener unidas ambas membranas antes de la reacción cortical. b) Se liberan mucopolisacáridos ácidos que arrastran agua al espacio extracelular y se genera, en algunas especies, el espacio de fertilización, entre la membrana plasmática y la membrana pelúcida. Estos dos fenómenos llevan a que ambas membranas se separen de modo que un nuevo espermatozoide, al atravesar la membrana pelúcida, no contacte directamente con la membrana del ovocito II. c) Se liberan enzimas peroxidasas, que catalizan la unión (“cross-linking”) entre residuos de tirosina. Esto hace que las proteínas de la membrana pelúcida formen una red compacta que dificulta el paso de los espermatozoides a través de ella. d) Se liberan enzimas que degradan o que modifican la ZP3 y, en consecuencia, inhiben el contacto-reconocimiento primario del espermatozoide con la membrana pelúcida (SC 1-6 El contacto y reconocimiento entre las gametas). Una de dichas enzimas elimina los azúcares terminales de los oligosacáridos de la ZP3. La N-acetilglucosaminidasa de las vesículas corticales remueve N-acetilglucosamina de la porción glucídica de la ZP3. Este azúcar sirve como receptor específico para algunas moléculas del espermatozoide. De este modo, los espermatozoides libres ya no pueden realizar el contacto primario y los que lo hicieron se sueltan. e) Se liberan proteasas que degradan la ZP2 impidiendo el contacto secundario. La degradación de la ZP2 hace que los espermatozoides que están atravesando la membrana pelúcida se suelten de ella.
Fig. SC 1-9-1. La secuencia A-D muestra cómo los espermatozoides que se hallan unidos o atravesando la membrana pelúcida se sueltan de ella a medida que la reacción cortical progresa desde el sitio inicial del contacto E-O (arriba a la derecha) hasta el polo opuesto (abajo-izquierda). En D se observa que en el sitio de contacto E-O ha quedado el cono de fertilización. También puede observarse la formación del espacio de fertilización entre la membrana pelúcida y el ovocito.
En algunas especies, las vesículas corticales también liberan proteínas (hialina) que forman una cubierta relativamente rígida alrededor de la célula huevo y de las blastómeras durante la segmentación. Dado que la membrana de la célula huevo se une a dicha cubierta, se ha propuesto que posee un papel morfogenético durante el período denominado segmentación.