Desarrollo de una bebida funcional fermentada a base de soja

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2020 
 
Desarrollo de una bebida 
funcional fermentada a base 
de soja 
 
NICOLE MANAGÓ 
Directora: Carolina Iraporda 
Co-director: Julio C. Caione 
Licenciatura en Tecnología de Alimentos 
 
 
El presente trabajo de Tesis fue desarrollado como requisito para optar el 
título de grado de Licenciada en Tecnología de los Alimentos. 
 
Agradecimientos 
A la Universidad Nacional del Centro y a todos los profesores de la Facultad de Ingeniería Olavarría 
por permitirme formarme y capacitarme para obtener mi título de Licenciada en Tecnología de los 
Alimentos, por adaptarse con tanta predisposición a nuestras forma de cursada y haberlo hecho 
posible; 
Al Departamento de Ingeniería Química y Tecnología de los Alimentos por permitirme desarrollar 
mi Proyecto final de Tesis brindándome sus instalaciones, materiales y medios; 
A Caro e Ire por guiarme y ayudarme durante estos dos años, por su paciencia, por brindarme todo 
su conocimiento y comprometerse tanto con este proyecto, por estar siempre para despejar cada 
una de mis duda, contenerme cuando me desbordaba y por su enorme apoyo; 
A Julio por permitirme desarrollar el proyecto dentro de las instalaciones de su laboratorio, 
brindarme materiales y medios para poder llevarlo a cabo; 
A mi familia por haberme inculcado de chica la importancia de estudiar y tener una profesión, por 
convencerme de que todo es posible cuando no lo podía ver, por haberme ayudado y acompañado 
todos estos años, por sus palabras de aliento, por su contención y por su amor infinito; 
A mi amor, Agustín, por su paciencia infinita, su cariño y amor, por apoyarme en cada decisión y 
contenerme todos estos años, por estar siempre y por hacer todo más especial. Por cada viaje a 
Olavarría que hizo posible este logro; 
A Ro, por acompañarme estos últimos años de carrera, por su hermosa amistad, sus palabras de 
aliento, su paciencia, su gran ayuda y apoyo. A tu familia hermosa que siempre estuvo para mí con 
enorme predisposición y cariño; 
A todos mis compañeros del Lab. por su buena energía y predisposición, por permitirme acaparar 
las mesadas para desarrollar mi proyecto, por bancarme siempre. 
A Cele, por abrirme las puestas de su casa, por alentarme a seguir, por su contención, por sus 
interminables mates; 
A cada uno de mis amigos por estar siempre, por cada palabra de aliento, por celebrar siempre mis 
logros y alegrase por ellos, por hacerme reír cuando lo necesitaba y también escucharme en mis 
peores días. A Meli por alojarme en su casa para que pueda viajar; 
 
A todos ustedes, ¡Muchísimas Gracias! 
 
 
1 
 
 
 
 
Índice 
 
2 
Índice 
 Página 
Índice 2 
 
Resumen 6 
 
Introducción 8 
 
 1. Alimentos funcionales 8 
 1.I. Prebióticos 9 
 1.I.i. Inulina 10 
 1.I.i.a. Efectos de la inulina a nivel fisiológico 11 
 1.I.i.b. Aplicaciones tecnológicas de la inulina 12 
 1.II. Probióticos 12 
 1.II.i. Mecanismos de acción de los microorganismos probiótico 14 
 2. Alimento con probióticos 15 
 2.I. Bacterias ácido lácticas 16 
 2.II. Probióticos en matrices vegetales 19 
 3. Soja 20 
 3.I. Bebida a base de soja 22 
 
Hipótesis 26 
 
Objetivos 28 
 
Materiales y Métodos 30 
 
 1. Microorganismos y condiciones de cultivo 30 
 
2. Evaluación del crecimiento de las bacterias ácido lácticas, acidificación 
y pH en MRS y extracto de soja 
30 
 2.I. Determinación de la acidez titulable 30 
 
3. Actividad antimicrobiana de las bacterias ácido lácticas y sus 
sobrenadantes de cultivo 
31 
 4. Desarrollo de la bebida fermentada a base de soja 31 
 5. Caracterización de la bebida fermentada 32 
 5.I. Caracterización fisicoquímica 32 
 5.I.a.Determinación del contenido de humedad 32 
 5.I.b. Determinación del contenido de cenizas 32 
 5.I.c. Determinación del contenido proteico 33 
 5.I.d. Determinación del contenido de lípidos 34 
 
3 
 5.I.e. Determinación del contenido de carbohidratos 35 
 5.I.f. Valor energético 35 
 5.II. Determinación de la actividad antioxidante 35 
 5.III. Determinación de la actividad antimicrobiana 36 
 
6. Resistencia de las bacterias ácido lácticas en bebidas fermentadas 
sometidas a la simulación de pasaje a través del tracto gastrointestinal 
36 
 
7. Determinación de la viabilidad de las bacterias ácido lácticas en la 
bebida fermentada durante el almacenamiento 
37 
 8. Análisis estadísticos 38 
 
Resultados y Discusión 40 
 
 
1. Caracterización de bacterias ácido lácticas y crecimiento en bebida de 
soja 
40 
 
2. Actividad antimicrobiana de las bacterias ácido lácticas y sus 
sobrenadantes 
46 
 3. Bebida de soja fermentada 49 
 3.I. Características generales de la bebida fermentada 49 
 3.II. Análisis composicional y valor energético 52 
 3.III. Actividad antioxidante de la bebida de soja fermentada 53 
 3.IV. Actividad antimicrobiana de la bebida de soja fermentada 54 
 
4. Resistencia de las bacterias ácido lácticas a las condiciones 
gastrointestinales simuladas 
58 
 5. Almacenamiento de las bebidas de soja fermentadas 59 
 
Conclusión 66 
 
Proyecciones 68 
 
Anexo 1 70 
 
 Información nutricional de la leche de soja en polvo Nutrilon Soya 70 
 
Anexo 2 72 
 
 Procedimientos para la observación microscópica de bacterias 72 
 
Anexo 3 75 
 
4 
 
 Composición y preparación de medios de cultivo y soluciones empleadas 75 
 Soluciones y reactivos para técnica micro-kieldahl 80 
 Reactivos para la técnica Soxhlet 81 
 
Soluciones para la simulación del pasaje a través del tracto 
gastrointestinal 
81 
 
Bibliografía 84 
 
5 
 
 
 
 
Resumen 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
6 
Resumen 
 Hoy en día existe una mayor conciencia por parte de los consumidores sobre la 
estrecha relación entre la alimentación y la salud, reconociéndose los efectos beneficiosos 
de la dieta sobre el desarrollo, la inmunidad, el crecimiento y la composición corporal, 
entre otros. Esto conlleva a la demanda creciente de productos que contribuyan a un 
buen estado de salud y por ende a un mayor bienestar y calidad de vida. Debido a ello, en 
los últimos años se ha incrementado el interés de la industria alimentaria y el ámbito 
científico por la investigación y el desarrollo de alimentos funcionales. Este tipo de 
alimentos ejercen además de su función meramente nutritiva, una acción beneficiosa 
sobre algunos procesos fisiológicos y/o reducen el riesgo de padecer ciertas 
enfermedades. Entre los ingredientes bioactivos de mayor relevancia para la elaboración 
de alimentos funcionales, se encuentran los prebióticos y los probióticos. La mayoría de 
los alimentos comercializados con este tipo de componentes se basan en matrices lácteas 
y por tanto ciertos sectores de la población, como los alérgicos a las proteínas de la leche, 
veganos y/o intolerantes a la lactosa, no pueden consumirlos. Por ello, surge como desafío 
explorar la incorporación de ingredientes prebióticos y probióticos a matrices no lácteas 
para ofrecer a los consumidores una alternativa a los productos lácteos fermentados. 
 En el presente proyecto se desarrolló una bebida funcional fermentada a base de 
soja (Glycine max L. Merr.) con la adición combinada de microorganismos probióticos, 
como el Lacticaseibacillus paracasei BGP1 y Lactiplantibacillus plantarum CIDCA 8327 y 
prebióticos como la inulina. Como objetivo se planteó establecer las condiciones de 
elaboración del producto fermentado, el estudio de algunas de sus propiedades 
funcionales y el efecto de la inulina sobre la viabilidad y la sobrevida de las bacterias en la 
bebida fermentada de soja. Ambas bacterias ácido lácticas fueron capaces de fermentar la 
bebida de soja. La bebida fermentada con L. plantarum presentó mayores recuentos 
finales, pH más bajos, mayor porcentaje de acidez titulable, efecto bactericida frente a 
cepas patógenas, mantuvo la actividad antioxidante de la bebida de sojasin fermentar y 
presentó mayores porcentajes de sobrevida en el paso a través de tracto gastrointestinal 
in vitro. El agregado de inulina aumentó la viabilidad de los probióticos en la matriz 
durante el período de almacenamiento y se obtuvieron mejores resultados en la 
simulación del pasaje a través del tracto gastrointestinal. De este modo, los resultados 
obtenidos en el presente estudio contribuyen al futuro desarrollo de alimentos 
funcionales basados en matrices vegetales. 
 
 
 
7 
 
 
 
 
Introducción 
 
8 
Introducción 
1. Alimentos funcionales 
 El papel principal de la dieta es proporcionar suficientes nutrientes para cumplir 
con los requisitos metabólicos, al tiempo que brindaría al consumidor una sensación de 
satisfacción y bienestar. Sin embargo, el avance en investigación y tecnología ha logrado 
que más allá de satisfacer las necesidades nutricionales, la dieta pueda modular varias 
funciones fisiológicas y desempeñar papeles beneficiosos frente a ciertas enfermedades. 
En este sentido, surge el concepto de alimento funcional (Granato et al., 2010), el que fue 
utilizado por primera vez en Japón, en la década de los ochenta en referencia a los 
alimentos de uso específico para la salud denominados FOSHU (Food for specific health 
use), y que luego fue adoptado por otros países (Ramos et al., 2012). Actualmente, los 
alimentos funcionales se definen como un alimento que es, o parece ser similar, a un 
alimento convencional, que forma parte de una dieta estándar y se consume de forma 
regular, en cantidades normales. Además, tiene beneficios para la salud comprobados 
dado que reducen el riesgo de enfermedades crónicas específicas o afectan de manera 
beneficiosa las funciones objetivo más allá de sus funciones nutricionales básicas (Bultosa, 
2016). Estos alimentos pueden ser productos en los que uno o varios ingredientes son 
añadidos, retirados o están presentes de forma natural y proporcionan efectos 
beneficiosos en la salud de los consumidores o reducen el riesgo de padecer ciertas 
enfermedades (Roberfroid, 2005). Los compuestos bioactivos se definen como 
componentes de los alimentos que influyen en las actividades celulares y fisiológicas 
obteniendo, tras su ingesta, un efecto beneficioso para la salud (Champagne et al., 2005). 
Normalmente, estos compuestos están en cantidades muy pequeñas en los alimentos que 
consumimos como parte de nuestra dieta habitual y en la mayoría de los casos, provienen 
de fuentes alimentarias vegetales. Así como también, pueden añadirse de manera natural, 
modificarse o mejorarse, con el fin de propiciar beneficios en la salud en cuanto a 
desarrollo, defensa contra el estrés oxidativo, regulación de procesos metabólicos, 
fisiología cardiovascular y gastrointestinal, rendimiento mental, cognitivo, físico y 
deportivo. Entre ellos pueden mencionarse los siguientes (Lamos et al., 2018): 
◆ Compuestos con actividad antioxidante: fenoles, ácidos fenólicos, antocianinas, 
triterpenos, flavonoides, carotenoides, entre otros. 
◆ Ácidos grasos esenciales: ácido grasos poliinsaturados como ácido linolénico, 
docosahexaenoico, eicosapentaenoico (de la familia omega-3) y linoleíco (omega-
6), entre otros. 
◆ Fibras vegetales: celulosa, hemicelulosa, lignina, pectinas y ceras. 
 
9 
◆ Prebióticos: fructooligosacáridos (FOS), galactooligosacáridos (GOS), inulina, 
isomalto-oligosacáridos (IMO), xilo-oligosacáridos (XOS), almidón resistente y 
oligosacáridos de soja (SOS), entre otros. 
◆ Probióticos: Algunas especies de Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus, 
Pediococcus, Propioniobacterium, entre otros. 
◆ Vitaminas y minerales 
1.I. Prebióticos 
 Los prebióticos son definidos como “sustratos que son utilizados selectivamente 
por microorganismos hospedadores que confieren un beneficio para la salud” (Gibson et 
al., 2017). 
Para que un ingrediente alimentario o un alimento pueda considerarse como 
prebiótico debe cumplir una serie de requisitos tales como (Roberfroid, 2007): 
◆ Ser resistente a la acidez y a la hidrólisis por enzimas digestivas y no ser absorbido 
en el tracto gastrointestinal (TGI) superior (esófago, estómago y duodeno) y, por lo 
tanto llegar al colon prácticamente inalterados. 
◆ Ser fermentado selectivamente por la microbiota intestinal y estimular 
selectivamente el crecimiento y/o actividad de bacterias intestinales que 
contribuyen a la salud y el bienestar. 
◆ Ser capaz de inducir efectos fisiológicos beneficiosos para la salud. 
Entre todos los componentes de los alimentos, los carbohidratos no digeribles 
(oligo- y polisacáridos) son los candidatos más importantes para ser considerados 
prebióticos. Estos carbohidratos pueden estar presentes de forma natural en alimentos 
tales como leche, hortalizas, frutas, cereales (trigo, avena, etc.), legumbres y frutos secos, 
aunque también se los puede obtener de diversas fuentes vegetales por métodos 
químicos y enzimáticos para ser luego utilizados como ingredientes en formulaciones 
alimentarias (Charalampopoulos y Rastall, 2012; Corzo et al., 2015). 
Los carbohidratos no digeribles se clasifican en dos grupos, colónicos (fibra 
alimentaria) y prebióticos (Weisstaub y Zuleta, 2013; Corzo et al., 2015). Los ingredientes 
colónicos son carbohidratos que llegan al colon, sirven como sustrato para los 
microorganismos que lo habitan originando energía, sustratos metabólicos y 
micronutrientes esenciales para el hospedador. Dentro de este grupo se incluyen los 
polisacáridos estructurales de plantas, tales como pectinas, hemicelulosas, celulosa, 
gomas o algunos oligosacáridos derivados de la soja, glucooligosacáridos, 
arabinooligosacáridos, etc. Entre los prebióticos más importantes se encuentran los 
fructooligosacáridos (FOS), la inulina y galactooligosacáridos (GOS), mientras que los 
prebióticos emergentes incluyen isomalto-oligosacáridos (IMO), xilo-oligosacáridos (XOS), 
almidón resistente y oligosacáridos de soja (SOS), estos últimos aún en estudio (Heydari et 
 
10 
al., 2011; Charalampopoulos y Rastall, 2012). Los prebióticos realizan todas las actividades 
mencionadas anteriormente, y además, estimulan el crecimiento selectivo de 
determinadas especies beneficiosas de la microbiota intestinal, principalmente 
bifidobacterias y lactobacilos (Corzo et al., 2015). 
 
1.I.i. Inulina 
 La inulina se encuentra en la naturaleza como carbohidrato de reserva de diversos 
vegetales siendo las principales fuentes el topinambur (Helianthus tuberosus L.) (89%), 
achicoria (Cichorium intybus) (79%), dalia (Dahlia spp.) (59%), entre otras (Tabla 1). 
 Tabla 1: Contenido promedio de inulina en diferentes especies vegetales 
(Adaptado de Madrigal y Sangronis, 2007). 
FUENTE Inulina (g/100 g base seca) 
Topinambur (Helianthus tuberosus) 89 
Achicoria (Cichorium intybus) 79 
Raíz de Dalia (Dahlia spp.) 59 
Cebolla (Allium cepa L) 48 
Puerro (Allium porrumL.) 37 
Ajo (Allium sativum) 29 
Yacón (Smallanthu ssonchifolius) 27 
Espárrago (Asparragus officinalis L.) 4 
Banana (Musa cavendishii) 2 
Centeno (Secale cereale) 1 
 
La inulina consiste en un polímero lineal de unidades de fructosa unidas mediante 
enlaces glicosídicos de tipo β-(2→1)fructosil-fructosa, siendo el término "fructanos" 
usado para denominar este tipo de compuestos. Las cadenas de fructosa tienen la 
particularidad de terminar en una unidad de glucosa unida por un enlace α-(1,2) (residuo 
D-glucopiranosil) pero también el monómero terminal de la cadena puede corresponder a 
una unidad de fructosa (residuo D-fructopiranosil) (Figura 1) (Madrigal y Sangronis, 2007). 
 
11 
Dado que, durante la obtención de inulina de una fuente determinada, se pueden extraer 
cadenas con longitudes variables, para la caracterización del compuesto obtenido se 
calcula el grado de polimerización promedio (GPn) (Madrigal y Sangronis, 2007). Se refiere 
en general, como inulina de “bajo gradode polimerización” cuando el GPn es menor a 10 
unidades, de “alto grado de polimerización” cuando el GPn es mayor o igual a 23 y se 
denominan fructooligosacáridos a los fructanos con grado de polimerización entre tres y 
siete unidades (Apraez y Castillo, 2015, Shoaib et al., 2016). 
 
Figura 1: Estructura química de la inulina (A) con una molécula terminal de glucosa (β-D-glucopiranosil) (B) 
con una molécula terminal de fructosa (β-D-fructopiranosil) (Madrigal y Sangronis, 2007) 
1.I.i.a. Efectos de la inulina a nivel fisiológico 
 Dentro de los efectos nutricionales de la inulina se destacan los siguientes (Aryana 
y McGrew, 2007): 
◆ Dado que no se digiere en el tracto gastrointestinal superior, no provoca un 
aumento significativo del nivel de glucosa sérica, ni estimula la secreción de 
insulina. 
◆ Mejora la biodisponibilidad de minerales como calcio, magnesio y hierro. 
◆ Estimula la actividad metabólica de bacterias beneficiosas e inhibe bacterias 
dañinas en el tracto digestivo. 
◆ Proporciona los beneficios para la salud normalmente asociados con la fibra 
dietética, previniendo el estreñimiento y contribuyendo a la eliminación de 
toxinas. 
 
12 
◆ Contribuye a reducir el colesterol en sangre y disminuir la incidencia de cáncer de 
colon. 
◆ Estimula el sistema inmunológico. 
1.I.i.b. Aplicaciones tecnológicas de la inulina 
Como ingrediente bioactivo comercial, se presenta como un polvo blanco, inodoro 
y de sabor neutro. La funcionalidad tecnológica está determinada por los componentes de 
la formulación donde se encuentre incluida, como así también por su grado de 
polimerización (Shoiab et al., 2016). La inulina de bajo GPn se utiliza comúnmente con 
fines endulzantes, mientras que la inulina de alto GPn se emplea como modificador de 
textura, reemplazante de materia grasa, espesante, estabilizante de espuma y emulsiones, 
entre otros usos (Franck, 2002; Shoiab et al., 2016). Además de las aplicaciones 
mencionadas, la inulina se añade a menudo a alimentos que contienen microorganismos 
con el objetivo de mejorar la viabilidad y resistencia de los mismos frente a condiciones 
adversas del entorno como pueden ser pH extremos, la acción de las enzimas digestivas, 
etc. (Casarotti et al., 2015). 
1.II. Probióticos 
 El término probiótico define a los microorganismos vivos que, administrados en 
cantidades adecuadas, confieren efectos beneficiosos para la salud del consumidor (Hill et 
al., 2014). Entre los microorganismos utilizados como probióticos, los géneros 
Lactobacillus y Bifidobacterium ocupan el lugar más destacado, pero también se utilizan 
bacterias que pertenecen a los géneros descriptos en la Tabla 2. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
13 
 Tabla 2: Principales especies de microorganismos utilizados como probióticos en la 
industria alimentaria (Adaptado de Champagne et al., 2005) 
MICROORGANISMOS PROBIÓTICOS 
Lactobacillus Bifidobacterium Otras 
L. acidophilus 
L. bulgaricus 
L. casei 
L. crispatus 
L. delbrueckiisubsp. 
L. fermentum 
L. johnsonii 
L. lactis 
L. paracasei 
L. plantarum 
L. rhamnosus 
L. reuteri 
L. salivarius 
B. adolescentis 
B. bifidum 
B. breve 
B. essensis 
B. infantis 
B. lactis 
B. longum 
Enterococcus faecalis 
Enterococcus faecium 
Pediococcus acidilactici 
Propioniobacterium freudenreichii 
Saccharomyces boulardii 
Streptococcus thermophilus 
Para que un microorganismo sea considerado un probiótico, debe cumplir los 
siguientes requisitos (Smith, 2014): 
◆ Se debe poder identificar inequívocamente el género, la especie, subespecie y la 
cepa. 
◆ Debe ser inocuo para la salud del consumidor, es decir ser reconocido como GRAS 
(Generally Recognized As Safe). No deberá presentar o promover la traslocación 
bacteriana (pasaje de bacterias del intestino más allá de los nódulos mesentéricos) 
en las concentraciones en que se encuentra en el alimento. 
◆ Debe ser genéticamente estable. 
◆ Las cepas probióticas no deben ser portadoras de genes de resistencia a 
antibióticos. 
◆ Deben presentar capacidad de adherirse a la superficie de la mucosa intestinal y de 
colonizar el tracto intestinal. 
◆ Deben poder obtenerse a escala industrial. 
◆ Deben mantenerse viables en el producto en el que se incorporan, durante la vida 
útil del mismo. 
◆ Deben sobrevivir al pasaje por el tracto gastrointestinal, resistiendo al pH gástrico, 
las enzimas digestivas y la acción detergente e inhibidora de las sales biliares y 
permanecer viable en el intestino en la concentración exigida. 
 
14 
◆ Deben ejercer efectos benéficos para la salud huésped, que hayan sido 
científicamente demostrados. 
1.II.i. Mecanismos de acción de los microorganismos probióticos 
 Dentro de los mecanismos de acción descriptos para las bacterias probióticas 
podemos mencionar (Arribas et al., 2008): 
◆ Competición con bacterias patógenas: Los probióticos pueden establecer una 
competencia con bacterias nocivas (patógenos) tanto por los sitios de unión al 
epitelio intestinal o por los sustratos disponibles, impidiendo así su desarrollo o 
adhesión y de este modo, reducir las posibilidades de infecciones. 
◆ Actividad antagónica frente a patógenos: Los probióticos pueden producir una 
modificación del pH en el lumen intestinal, debido a la producción de ácidos 
orgánicos derivados de su actividad metabólica, o bien compuestos 
antibacterianos como pueden ser bacteriocinas o compuestos de bajo peso 
molecular como peróxido de hidrógeno, diacetilo, dióxido de carbono entre otros y 
así inhibir el desarrollo de bacterias patógenas (Hati et al., 2018). 
◆ Mejora de la función de la barrera intestinal: Los probióticos pueden contribuir a 
mejorar la función de barrera del epitelio intestinal mediante la inducción de la 
expresión génica en favor de la proliferación celular de enterocitos y/o colonocitos, 
así como por la estimulación de la síntesis de mucus y proteínas que forman parte 
de las uniones estrechas, impidiendo el pasaje de potenciales factores dañinos 
desde la luz gastrointestinal al medio interno (Turpin et al., 2010). 
◆ Producción de vitaminas: Algunas cepas probióticas son capaces de producir 
vitamina B, riboflavina, folato y cobalamina y de este modo su consumo ayudaría a 
evitar posibles deficiencias vitamínicas promotoras de enfermedades graves 
(Turpin et al., 2010). 
◆ Digestión de nutrientes: los probióticos pueden contribuir con la digestión de 
compuestos, como por ejemplo lactosa, así como también otros oligosacáridos y 
proteínas, debido a la presencia de enzimas específicas (Turpin et al., 2010). 
◆ Degradación de factores antinutricionales: Algunos probióticos son capaces de 
descomponer factores antinutricionales que se encuentran en alimentos como las 
legumbres, entre ellos por ejemplo lectinas, inhibidores enzimáticos, y quelantes 
de iones metálicos aumentando la biodisponibilidad de los micronutrientes de los 
alimentos (Turpin et al., 2010). 
◆ Inmunomodulación: Los probióticos actúan sobre la inmunidad intestinal específica 
e inespecífica. Dentro de los posibles mecanismos se encuentran la potenciación 
de la actividad fagocítica, activación de células Natural Killer, producción de 
inmunoglobulinas (por ejemplo IgA) y citoquinas. La IgA presente en la luz 
intestinal posee la capacidad de aglutinar bacterias patógenas y virus promoviendo 
 
15 
su eliminación a través de las heces, impidiendo que dañen el epitelio intestinal 
(Arribas et al., 2008). 
 Los mecanismos de acción pueden ser ejercidos en forma conjunta y/o 
complementaria por diferentes cepas de microorganismos probióticos, es decir que una 
única cepa probiótica no necesariamente cumple todas las funciones a nivel intestinal. En 
la Figura 2 se ilustran los diferentes mecanismos de acción ejercidos por las bacterias 
probióticas mencionados previamente. 
 
Figura 2: Mecanismos de acción de las bacterias probióticas en el intestino (Herrera et al., 2018).2. Alimentos probióticos 
Según el Código Alimentario Argentino – Capítulo XVII – ALIMENTOS DE REGIMEN O 
DIETÉTICOS – Artículo 1389 – (Res. Conj. SPReI N° 261/2011 y SAGyP N° 22/2011), con la 
denominación de “Alimento con Probióticos”, se entiende aquel alimento con una carga 
de células viables que deberá estar comprendida entre 106 y 109 UFC/g durante su 
período de duración mínima. 
Para el desarrollo de un alimento con microorganismos probióticos se deben tener en 
cuenta los siguientes aspectos (Champagne et al., 2005): 
◆ Selección de cepas: La selección de probióticos se basa en criterios microbiológicos 
generales que se refieren a la seguridad, la funcionalidad tecnológica, el 
 
16 
rendimiento y los beneficios para la salud. En cuanto a la funcionalidad 
tecnológica, debe estudiarse la posible producción de biomasa a gran escala, la 
supervivencia a la congelación o liofilización, la capacidad de adaptación de las 
cepas a las matrices alimentarias, así como a las etapas de elaboración a las cuales 
se somete el alimento. 
◆ Propiedades biológicas: El nivel de microorganismos viables en un alimento 
probiótico debe mantenerse luego de su consumo y pasaje a través del tracto 
gastrointestinal, para así permitir que los probióticos desempeñen su función 
biológica en el intestino humano. De manera estratégica se pueden diseñar 
combinaciones de cepas probióticas que permitan obtener un alimento con 
funciones específicas para determinado grupo de consumidores, entre ellos niños, 
adultos mayores, etc. 
◆ Propiedades tecnológicas: Las características tecnológicas que deben poseer las 
cepas probióticas para el desarrollo del cultivo para su comercialización consisten 
en altos rendimiento de biomasa a gran escala, supervivencia al congelamiento y 
secado. También, es necesario que las cepas no pierdan viabilidad durante la 
elaboración o almacenamiento del producto. La viabilidad de los probióticos en la 
matriz alimentaria está relacionada con factores como el pH, la temperatura de 
almacenamiento, los niveles de oxígeno y la presencia de inhibidores o 
microorganismos competidores (Granato et al., 2010). 
 
2.I. Bacterias ácido lácticas 
 Las bacterias ácido lácticas (BAL) son un grupo heterogéneo de bacterias Gram 
positivas que comparten la característica de generar ácido láctico como producto del 
metabolismo fermentativo (Levin, 2003). Las BAL son anaerobias facultativas, no forman 
esporas, son no móviles y carecen de la enzima catalasa. Son cocos o bacilos de longitud 
variable y de grosor de 0,5-0,8 μm. Fisiológicamente son un grupo uniforme que carecen 
de actividad respiratoria a causa de la ausencia de la enzima citocromo oxidasa, contienen 
un grupo hemina que les permite poner en marcha la cadena respiratoria con el oxigeno 
como aceptor de electrones (Huertas, 2010). Son microorganismos con una limitada 
capacidad biosintética que requieren factores de crecimiento complejos como vitaminas 
del grupo B, purinas, pirimidinas y aminoácidos (Hati et al., 2018). Las BAL no pueden 
asimilar el nitrógeno inorgánico, pero son capaces de degradar proteínas y péptidos para 
satisfacer sus necesidades de crecimiento (Shihata y Shah, 2000). 
 Dentro de las BAL, el género Lactobacillus está integrado por microorganismos de 
carácter no patogénico, que han adquirido el status GRAS, resistentes a cambios de pH y 
de amplia capacidad metabólica, constituye el principal representante de 
microorganismos probióticos (Zamudio y Zavaleta, 2003). 
 
17 
 Según los metabolitos finales de la fermentación de hidratos de carbono, las BAL se 
pueden clasificar como homo o heterofermentativas. Las homofermentativas fermentan 
la glucosa generando fundamentalmente ácido láctico con poca acumulación de otros 
productos finales. En esta reacción el piruvato se reduce a ácido láctico por acción de la 
enzima lactato-deshidrogenasa a través de la ruta Embden-Meyerhoff-Parmás o vía 
glucolítica (Varela y Grotiuz, 2008). De esta forma se convierte 1 mol de glucosa en 2 
moles de ácido láctico (Huertas, 2010) (Figura 3A) según en la siguiente reacción: 
 
Glucosa (C6H12O6) + 2 ADP + 2 Pi → 2 Lactato (C3H6O3) + 2 ATP 
 
 En contraste, en las BAL heterofermentativas sólo la mitad de la glucosa 
fermentada se convierte en ácido láctico y el resto se transforma en una mezcla de 
anhídrido carbónico (CO2), ácido fórmico, ácido acético, entre otros productos. En esta 
fermentación se emplea fundamentalmente la vía de las pentosas (Varela y Grotiuz, 2008) 
y se convierte 1 mol de glucosa en 1 mol de ácido láctico, 1 mol de etanol y 1 mol de CO2 
(Huertas, 2010) (Figura 3B), como se muestra en la siguiente reacción: 
 
Glucosa (C6H12O6) + 2 ADP + 2 Pi → Lactato (C3H6O3) + Etanol (C2H5OH) + Dióxido de 
carbono (CO2) + 2 ATP 
 
 
18 
 
 Figura 3: Metabolismo (A) homofermentativo y (B) heterofermentativo, llevados a cabo por las bacterias 
ácido lácticas (Rivero, 2019). 
 Dentro del grupo de las BAL heterofermentativas se encuentran cepas de las 
especies Lactiplantibacillus plantarum y Lacticaseibacillus paracasei. A su vez, según la 
temperatura óptima de crecimiento las BAL pueden clasificarse como mesófilas (con 
temperaturas óptimas entre 30-35°C) o termófilas (con temperaturas óptimas entre 40-
45°C) (Huertas, 2010) siendo las especies Lactiplantibacillus plantarum y Lacticaseibacillus 
paracasei, mesófilas. 
 Las BAL se han utilizado desde hace mucho tiempo para la fermentación de 
diversos alimentos como carnes, cereales, verduras y frutas o leche, con el objetivo de 
mejorar la conservación de los alimentos por medio de la acidificación o bien para el 
desarrollo de sabores o texturas específicos (Champagne et al., 2005). La leche representa 
una matriz beneficiosa para el desarrollo de bacterias probióticas, posicionándose como el 
sustrato elegido para el desarrollo de alimentos funcionales. En particular, el yogur es una 
leche fermentada con las bacterias Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y 
Streptococcus salivarius subsp. termophilus y actualmente el 60% de los yogures 
comerciales, se encuentran adicionados con bacterias probióticas individuales (monocepa) 
o combinadas (multicepa) (Lin et al., 2004; Champagne et al., 2005). Sin embargo, se sabe 
 
19 
que la alergia a las proteínas lácteas junto con la intolerancia severa a la lactosa y el 
contenido de colesterol, así como también el aumento de la práctica del veganismo o el 
vegetarianismo estricto, son factores que limitan el consumo de productos lácteos. Este 
hecho hace que resulte necesario el desarrollo de nuevos alimentos o bebidas probióticas 
no lácteos para así poder satisfacer la demanda de los consumidores que, por cuestiones 
de salud o idiosincrasia, no consumen productos lácteos. De este modo, se busca 
reemplazar la leche y sus derivados por otras matrices, como por ejemplo matrices 
vegetales (cereales, frutas y verduras) para el desarrollo de alimentos y bebidas con 
probióticos (Granato et al., 2010). 
2.II. Probióticos en matrices vegetales 
 Además de la respuesta a las tendencias actuales a dietas vegetarianas y veganas y 
considerando también una alternativa para las personas con intolerancia a la lactosa, 
existen tradiciones y razones económicas que limitan el uso de productos lácteos en 
países como Japón, China y algunos países africanos, que impulsan la idea de reemplazar 
los lácteos por matrices vegetales, como vehículos de microorganismos probióticos 
(Granato et al., 2010). Como consecuencia, la investigación y el desarrollo de alternativas 
de productos probióticos no lácteos es un área que se encuentra en constante 
crecimiento. Los vegetales resultan atractivos como matrices alternativas dadas sus 
propiedades nutricionales intrínsecas (por ser fuente de componentes nutricionales 
fundamentales como vitaminas, fibra dietaria, minerales y fitoquímicos) a las que podrían 
sumarse otraspropiedades benéficas, aportadas por los microorganismos incorporados 
(Castro et al., 2017). En este sentido, en la formulación de bebidas a base de vegetales con 
probióticos, se debe garantizar su viabilidad, así como la bioactividad y estabilidad 
fisicoquímica y sensorial del producto durante su vida útil. Por ejemplo, se han 
desarrollado bebidas a base de uva adicionadas con orujo de uva (residuo de la fabricación 
del vino blanco) fermentada con L. rhamnosus que presentó actividad bacteriostática 
frente a bacterias patógenas responsables de enfermedades transmitidas por alimentos 
(ETAs) (Dias et al., 2018). Por otro lado, se ha demostrado actividad antimicrobiana y 
antioxidante aumentadas en un extracto de arándanos fermentado con B. 
amyloliquefaciens, L. brevis y S. bombicola (Oh et al., 2017). También se han desarrollado 
bebidas a base de vegetales como la remolacha adicionada con hojas de moringa 
fermentadas con L. plantarum que mostraron actividad antibacteriana contra patógenos 
transmitidos por los alimentos como B. cereus, E. coli, L. monocytogenes y Staphylococcus 
aureus, y que también exhibieron actividad captadora de radicales libres (Vanajakshi et al., 
2015). 
 
https://www.sciencedirect.com/topics/food-science/food-pathogen
https://www.sciencedirect.com/topics/food-science/food-pathogen
https://www.sciencedirect.com/topics/food-science/food-pathogen
https://www.sciencedirect.com/topics/food-science/listeria-monocytogenes
https://www.sciencedirect.com/topics/food-science/staphylococcus-aureus
https://www.sciencedirect.com/topics/food-science/staphylococcus-aureus
https://www.sciencedirect.com/topics/food-science/staphylococcus-aureus
 
20 
3. Soja 
 La soja es una leguminosa de ciclo anual que posee un alto valor nutricional y 
representa una importante fuente de proteínas y aceites. Según el Código Alimentario 
Argentino – Capítulo XI Artículo 886– (Res. Conj. SPReI N° 261/2011 y SAGyP N° 22/2011) 
con el nombre de “Soya” o “Soja”, se entiende la semilla del Glycine max L. Merr. y sus 
variedades. La soja, originaria del norte y centro de China, ha sido y continúa siendo un 
alimento milenario de los pueblos de Oriente. Su expansión a gran escala se efectuó en la 
cuarta década del siglo XX en los Estados Unidos, quien en la actualidad sigue liderando la 
producción de esta leguminosa. En la Argentina, la producción se incrementó 
notoriamente en los años setenta hasta alcanzar en la actualidad el tercer puesto como 
productor mundial, siendo el rubro de exportación de mayor incidencia y el mayor 
generador de divisas. Actualmente el cultivo ocupa una amplia zona ecológica que se 
extiende por todo el país, concentrándose principalmente en la región Pampeana (Ridner, 
2006). La soja, para su producción no requiere de suelos muy ricos en nutrientes, se 
desarrolla en suelos neutros o ligeramente ácidos, con un pH de 6-7. Tiene una cierta 
resistencia a la salinidad. Es especialmente sensible a los encharcamientos del terreno, por 
lo que en los de textura arcillosa con tendencia a encharcarse no es recomendable para su 
cultivo. Sin embargo, es una planta que requiere mucha agua, por lo que en los terrenos 
arenosos deberá regarse con frecuencia. Su temperatura de crecimiento óptima es de 30 
°C, pero puede desarrollarse adecuadamente en temperaturas comprendidas entre 20 y 
30 °C (Salvagiotti, 2009). El menor costo de la proteína de soja respecto a las alternativas 
de origen animal y los bajos requerimientos de suelo y clima, probablemente son las 
principales razones de la gran distribución geográfica de la soja. 
 La soja y sus subproductos han sido ampliamente utilizados en la alimentación 
humana desde hace miles de años en países asiáticos. Sin embargo, su gran difusión y el 
conocimiento de sus propiedades nutricionales posicionaron a la soja y sus diversos 
subproductos como alimentos ampliamente utilizados para la alimentación humana y 
animal a nivel mundial. El grano de soja contiene, en promedio, un 36,5% de proteínas, 
20% de lípidos, 30% de hidratos de carbono, 9% de fibra alimentaria, 8,5% de agua y 5% 
de cenizas (Ridner, 2006). Además, la soja es fuente de minerales como hierro, potasio, 
magnesio, zinc, cobre, fósforo, manganeso y vitaminas del complejo B (Penha et al., 2014). 
Dentro de los nutrientes más importantes del grano de soja se destacan: 
 Proteínas y aminoácidos esenciales: La soja es la legumbre que contiene mayor 
porcentaje de proteínas, de alta calidad y es de gran interés para la alimentación por sus 
altos niveles de aminoácidos esenciales (Penha et al., 2014). Posee proteínas de elevado 
valor biológico (cantidad de nitrógeno que aportan al cuerpo y que puede emplearse para 
el mantenimiento y crecimiento) y con una gran digestibilidad (proporción de nitrógeno 
que es absorbida por el organismo) (Garay, 2006). 
https://www.infoagro.com/instrumentos_medida/categoria.asp?k=53
 
21 
 Hidratos de carbono: La soja aporta 9% de fibra alimentaria, que principalmente 
consiste en lignina, celulosa y hemicelulosas. La cáscara de la soja contiene la mayoría de 
la fibra del grano (87%). Los hidratos de carbono de la soja se clasifican en solubles e 
insolubles. Los carbohidratos hemicelulosas, celulosa, lignina, pectinas insolubles y otros 
polisacáridos no digeribles, constituyen la fracción de fibra dietaria insoluble de la soja. 
Los solubles son mayoritariamente oligosacáridos como galactooligosacáridos (GOS), 
rafinosa, estaquiosa y verbascosa; y polisacáridos solubles, que comprende la fibra soluble 
(principalmente pectinas). Los GOS, junto con la rafinosa y la estaquinosa no son 
hidrolizados por las enzimas del tracto digestivo de los mamíferos, y por ello llegan 
intactos al colon donde son fermentados por la microbiota, produciendo gases y, en 
ciertos casos, esto conduce a la distención abdominal y flatulencias (Rinder, 2006). 
 Lípidos: El aceite de soja es rico en ácidos grasos poliinsaturados y se destaca por 
su elevado contenido de ácido linoleico (51%) y su proporción de ácido linolénico (7 a 9 
%), un ácido graso esencial precursor de los ácidos Omega 3 (ω-3), cuya función es reducir 
el colesterol LDL. Ambos ácidos grasos son importantes para el crecimiento y desarrollo 
del cerebro. Además, contiene ácidos grasos monoinsaturados (ω-9) y en menor 
proporción ácidos grasos saturados. Otros compuestos de interés en la fracción lipídica de 
la soja son los tocoferoles, los cuales actúan como antioxidantes naturales y tienen 
funciones de vitamina E (Rinder, 2006). 
 Vitaminas y minerales: La soja contiene minerales como calcio, hierro, cobre, 
fósforo y zinc, sin embargo, la biodisponibilidad de estos micronutrientes es baja debido 
que también contiene fitatos, los cuales actúan como antinutrientes, quelando los 
minerales y disminuyendo su biodisponibilidad. Las vitaminas son, fundamentalmente 
tiamina (B1), riboflavina (B2), piridoxina (B6), niacina, ácido pantoténico, biotina, ácido 
fólico, provit-A, inositol, colina y ácido ascórbico (vit-C) (Rinder, 2006). 
 Isoflavonas: Las isoflavonas son componentes bioactivos presentes en los 
vegetales (fitoquímicos) que tienen importantes efectos beneficiosos para la salud. 
Forman parte de una subclase de un grupo mayor de fitoquímicos de naturaleza fenólica, 
llamados isoflavonoides. La soja y sus derivados contienen grandes cantidades de 
isoflavonas que se encuentran como una mezcla compleja de conjugados de glucósidos, 
siendo los más abundantes los glucósidos de genisteína y daidzeína. Dentro de los 
múltiples beneficios que aportan, las isoflavonas también pueden actuar como 
compuestos con actividad antioxidantes (Rinder, 2006). 
La soja representa actualmente el cultivo a partir del cual se obtienen numerosos 
productos alimenticios, tales como los que se describen en la Tabla 3. 
 
 
 
22 
Tabla 3: Aplicaciones del grano de soja en la alimentación humana (INTA-Rafaela)POROTOS VERDES 
Ensaladas Platos calientes Conservas - Encurtidos Sopas – 
Salsas 
Guisos - Locro - Puchero Ensaladas - Rellenos Dulces 
Mermeladas Tortas- Licuados 
POROTOS SECOS 
LECHE DE SOJA 
Bebidas - Cuajada o Queso 
- Dulces - Flanes - Budines 
- Papillas - Tortas - Postres 
- Salsas - En polvo - 
Condensada 
BAGAZO DE LECHE 
DE SOJA 
Masitas - Panqueques -
Croquetas - Budines - 
Tortillas - Pastos 
Soja tostada 
Soja frita 
Como sustituto del café 
HARINA DE SOJA 
Pan - Pastelería - Alimentos infantiles y p/diabéticos - 
Salsas, pizzas, rellenos - Polvos p/helados - Bollos - Pastas 
alimenticias - En embutidos, sustituyendo la carne 
BROTES DE SOJA Frescos - enlatados congelados 
3.I. Bebida a base de soja 
 La bebida a base de soja, comúnmente llamada “leche de soja” hace referencia al 
extracto acuoso obtenido a partir de la molienda del grano de soja crudo, y que contiene 
un alto contenido de proteínas, de alto valor biológico. Además, la “leche de soja” 
contiene componentes funcionales tales como vitaminas, isoflavonas, saponina, 
fitosteroles, lecitina, ácido fítico e inhibidores de proteasa, que desempeñan funciones 
importantes en la nutrición humana (Fakuda et al., 2017; Hati et al., 2018). Este extracto 
acuoso, no contiene colesterol ni lactosa y solo una pequeña cantidad de ácidos grasos 
saturados y por lo tanto puede ser consumido por personas intolerantes a la lactosa 
(Wang et al., 2003). El término “leche de soja” no resulta totalmente adecuado, dado que 
por definición del Código Alimentario Argentino – Capítulo VIII – ALIMENTOS LÁCTEOS – 
Artículo 554 – (Res. Conj. SPRyRS N° 22 30/01/95) “con la denominación de Leche sin 
calificativo alguno, se entiende el producto obtenido por el ordeño total e ininterrumpido, 
en condiciones de higiene, de la vaca lechera en buen estado de salud y alimentación, 
 
23 
proveniente de tambos inscriptos y habilitados por la Autoridad Sanitaria Bromatológica 
Jurisdiccional y sin aditivos de ninguna especie”; sin embargo la denominación de “leche 
de soja” ha sido ampliamente difundida, y en adelante se referirá con este término al 
extracto acuoso obtenido del grano de soja o sus derivados. Debido a la calidad nutricional 
de la soja y sus derivados y sus efectos terapéuticos, los productos a base de soja se 
encuentran en auge dentro del mercado de alimentos funcionales. De hecho, los 
productos a base de soja representan una categoría de gran crecimiento en el sector 
alimentario (Bhatnagar et al., 2017). Además, los productos de soja se consideran un buen 
sustrato para el desarrollo de alimentos funcionales fermentados, ya que mediante la 
fermentación se reducen los niveles de los carbohidratos que pueden ser responsables de 
la producción de gas y molestias intestinales y además, se contribuye a aumentar la 
diversidad en la población bacteriana del tracto intestinal. Durante la fermentación de la 
leche de soja, muchos compuestos orgánicos se descomponen en moléculas más 
pequeñas por las enzimas microbianas que luego ejercen varios efectos fisiológicos 
(Fakuda et al., 2017), por ejemplo los glicósidos de isoflavonas se pueden convertir en sus 
correspondientes agliconas mediante la acción de glicosidasas, mejorando su absorción en 
el intestino. Además, las proteínas de soja se pueden hidrolizar mediante proteasas 
microbianas, con la consecuente liberación de péptidos bioactivos que podrían ejercer 
efectos antihipertensivos, antioxidantes, antiobesidad, inmunomoduladores, 
antidiabéticos, hipocolesterolémicos y anticancerígenos. Por otro lado, los fitatos 
presentes en la leche de soja pueden ser hidrolizados durante la fermentación mejorando 
la biodisponibilidad y absorción de minerales (Fakuda et al., 2017). El sistema de 
bioconversión de los componentes funcionales de la leche de soja durante la 
fermentación se resume en Figura 4. Con el objetivo de utilizar bacterias ácido lácticas 
para fermentar leche de soja, las cepas deberían ser capaces de emplear los azúcares u 
oligosacáridos presentes en dicho medio como fuente de energía. Para poder hidrolizar 
los azúcares, las bacterias deben contener una enzima llamada α-galactosidasa que actúa 
hidrolizando los enlaces α-D-galactosídicos y reduce los oligosacáridos en azúcares simples 
que luego son empleados como sustrato para su metabolismo (Mital y Steinkraus, 1974; 
Hati et al., 2014). En particular, la fermentación de leche de soja con bacterias ácido 
lácticas podría contribuir a aumentar el valor nutricional, mejorar su sabor, aumentar la 
biodisponibilidad de las isoflavonas y calcio, ayudar a la digestibilidad de las proteínas 
presentes, aumentar la actividad antioxidante del producto y reducir el contenido de los 
oligosacáridos responsables de ocasionar problemas digestivos (Wang et al., 2006; Rekha 
y Vijayalakshmi, 2008; Božanić et al., 2011; Zhao y Shah, 2014; Rani y Pradeep, 2015; 
Bhatnagar et al., 2017). 
 
 
24 
 
Figura 4: Sistema de bioconversión de componentes funcionales de la leche de soja durante la fermentación 
por BAL 
 La leche de soja se comercializa en estado líquido, en polvo o como aislado 
proteico. La proteína aislada de soja se obtiene a partir de un proceso de refinación de los 
concentrados o de las harinas, posee alta digestibilidad y se usa para mejorar la calidad y 
cantidad de proteína en las dietas y también por sus propiedades funcionales (Pérez et al., 
2009). En el mercado existen productos a base de soja como aislados proteicos o leche de 
soja, de diversas marcas, los cuales están destinados principalmente a la alimentación en 
la primera infancia, como por ejemplo el polvo comercial, Nutrilon Soya (Nutricia Bagó, 
Argentina). Esta fórmula infantil consiste en un aislado proteico de soja, recomendado 
para lactantes desde el nacimiento. Dentro de sus componentes, cuenta con el agregado 
de carbohidratos (jarabe de glucosa) y aceites vegetales (palma 35 %, girasol 25 %, canola 
20 % y coco 20 %) (ANEXO 1). En el presente trabajo esta matriz fue empleada como base 
para el desarrollo de una bebida funcional fermentada. 
 
 
 
25 
 
 
 
 
Hipótesis 
 
26 
Hipótesis 
 Es posible desarrollar una bebida fermentada a base de soja mediante la adición de 
Lacticaseibacillus paracasei BGP1 o Lactiplantibacillus plantarum CIDCA 8327 en 
combinación con inulina de achicoria, con actividad antioxidante y antimicrobiana, 
manteniéndose la viabilidad de las cepas en el producto durante su almacenamiento 
refrigerado. 
 
27 
 
 
 
 
Objetivos 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
28 
Objetivo general 
 El objetivo general del presente trabajo de tesis fue desarrollar una bebida 
fermentada a base de soja con la incorporación de Lacticaseibacillus paracasei BGP1 o 
Lactiplantibacillus plantarum CIDCA 8327 combinada con inulina de achicoria y estudiar 
propiedades indicadoras de su funcionalidad. 
 
Objetivos específicos 
◆ Analizar el crecimiento de Lacticaseibacillus paracasei BGP1 y Lactiplantibacillus 
plantarum CIDCA 8327 en la bebida de soja a diferentes temperaturas. 
◆ Caracterizar fisicoquímicamente la bebida fermentada obtenida y determinar su 
perfil nutricional. 
◆ Determinar la actividad antioxidante y antimicrobiana de las bebidas fermentadas. 
◆ Evaluar la sobrevida de Lacticaseibacillus paracasei BGP1 y Lactiplantibacillus 
plantarum CIDCA 8327 en la bebida fermentada frente a condiciones 
gastrointestinales simuladas. 
◆ Evaluar la viabilidad de Lacticaseibacillus paracasei BGP1 y Lactiplantibacillus 
plantarum CIDCA 8327 durante el almacenamiento refrigerado de las bebidas 
fermentadas. 
 
 
 
29 
 
 
 
 
Materiales y Métodos 
 
30 
Materiales y Métodos 
1. Microorganismos y condiciones de cultivo 
 Se utilizaron las siguientes cepas de bacterias ácido lácticas (BAL): Lacticaseibacillus 
paracasei BGP1 (CLERICI-SACCO, Cadorago, Italia) y Lactiplantibacillus plantarum CIDCA8327, aislada de gránulos de kéfir (Gangoiti et al., 2017). Los cultivos de BAL puros se 
conservaron a -20 °C en medio Man, Rogosa, Sharpe (MRS) (Britania, Argentina) con leche 
bovina descremada (La Serenísima, Argentina) (1:1). Las cepas fueron activadas en caldo 
MRS y se incubaron en estufa para cultivo bacteriológico (40/60-H, Faeta, Argentina) a 
37 °C durante 24-48 h. Se verificó la pureza de los cultivos mediante observación de 
morfología macroscópica en agar MRS y microscópica mediante coloración de Gram 
(ANEXO 2). 
Se utilizaron los siguientes microorganismos patógenos indicadores: Escherichia 
coli, Staphylococcus aureus y Salmonella sp. aisladas de cultivos bacteriológicos realizados 
en el laboratorio para diagnóstico veterinario “Laboratorio 9 de Julio” ubicado en la 
Ciudad de 9 de Julio. Los mismos se almacenaron a 4 °C en medios específicos para su 
desarrollo: agar Mac Conkey (Britania, Argentina), Chapman (Brizuela, Argentina) y 
Salmonella Shigella (Britania, Argentina), respectivamente y luego se incubaron en caldo 
Nutritivo (Britania, Argentina) a 37 °C durante 24 h (ANEXO 3). 
 
2. Evaluación del crecimiento de las bacterias ácido lácticas, grado de acidificación y pH 
del medio de cultivo 
 Se estudió el crecimiento de BAL en MRS y en extracto de soja (Nutrilon Soya) 
rehidratado según las especificaciones del fabricante. Para ello se tomó 1 mL de cultivo 
crecido 24 h en MRS a 37 °C, se centrifugó (Biofuge pico, Heraeus, Alemania) (9500 xg, 10 
min) y se lavó el pellet obtenido, dos veces con buffer PBS estéril (ANEXO 3). Luego, se 
resuspendieron 0,5 mL del pellet en 5 mL de caldo MRS o extracto de soja estéril y se 
incubaron a 37 o 42 °C, en aerobiosis. Se analizaron el número de microorganismos viables 
mediante recuento en placas de agar MRS y se midió el pH cada 2 h, durante 24 h. Los 
resultados se expresaron como unidades formadoras de colonia por mililitro (UFC/mL) en 
función del tiempo de incubación en cada medio. Asimismo, a cada tiempo también se 
evaluó la acidez titulable producida en ambos medios. 
2.I. Determinación de la acidez titulable 
 La acidez titulable se determinó como el volumen de solución de NaOH 0,11 M 
utilizado para titular 1 mL de cultivo en presencia de fenolftaleína. El resultado de acidez 
titulable se expresó como porcentaje de ácido láctico (% AL), según la siguiente fórmula: 
 
31 
 
 
 
Dónde: 90 g/mol es el peso molecular del ácido láctico. 
3. Actividad antimicrobiana de las bacterias ácido lácticas y sus sobrenadantes de 
cultivo 
Se evaluó la capacidad inhibitoria del crecimiento de microorganismos patógenos 
indicadores, tanto de las cepas Lacticaseibacillus paracasei BGP1 y Lactiplantibacillus 
plantarum CIDCA 8327 como de sus sobrenadantes de cultivo en MRS, mediante ensayo 
de difusión en agar. Para ello, se colocaron gotas de 10 μL de cultivo BAL crecido 24 h a 37 
°C sobre placas de agar MRS y se incubaron a 37 °C durante 24 h. Luego se colocó una 
capa de 10 mL de agar nutritivo templado, inoculado previamente con 100 µL de una 
solución de cada patógeno indicador en solución fisiológica ajustada a 0,5 de la escala 
McFarland (ANEXO 3). Se incubaron las placas nuevamente a 37 °C durante 24 h. 
Finalmente, se determinó la presencia/ausencia de halos de inhibición y se midieron sus 
diámetros. 
 Por otro lado, se determinó el efecto antimicrobiano de los sobrenadantes de las 
BAL obtenidos por centrifugación (9500 xg, 10 min) de una alícuota del cultivo en MRS 
como se muestra en la Figura 5. Luego, se sembraron 30 µL de sobrenadante en pocillos 
de 5 mm de diámetro generados sobre placas con 10 mL de agar nutritivo (ANEXO 3), 
previamente inoculado con 100 µL de una solución ajustada a 0,5 de la escala McFarland 
del microorganismo patógeno indicador. Se incubaron las placas a 37 °C por 24 h, se 
determinó la presencia/ausencia de halos de inhibición y se midieron sus diámetros. 
 
Figura 5: Obtención de sobrenadantes por centrifugación de una alícuota de cultivo de las 
bacterias ácido lácticas (BAL) en MRS. 
 
 
32 
4. Desarrollo de la bebida fermentada a base de soja 
 
 Se utilizó extracto de soja comercial en polvo (Nutrilon Soya) que se reconstituyó 
con agua destilada de acuerdo a las instrucciones recomendadas en el envase del 
producto y se esterilizó en autoclave (15 min, 1 atm de sobrepresión, 121 °C). El extracto 
se soja estéril se almacenó refrigerado, en envases plásticos herméticamente cerrados. En 
la fermentación se utilizaron cultivos activos de las cepas de BAL para inocular 50/100 mL 
de extracto de soja estéril al 1 % (aproximadamente 106 y 107 UFC/mL). El extracto 
inoculado se incubó a 37 °C durante 8 h, se midió el pH, la acidez titulable y se realizaron 
recuentos de microorganismos viables, siguiendo las técnicas descriptas previamente. 
 Posterior a la fermentación, se ajustó el pH a 4 con ácido láctico y se adicionó 
inulina de achicoria (GR Beneo-Orafti, Bélgica, GPn≥10 o HP Beneo-Orafti, Bélgica, GPn>23) 
al 3 % p/v. Las bebidas obtenidas con o sin inulina, se almacenaron refrigeradas, en 
envases plásticos herméticamente cerrados, hasta su uso. 
 
5. Caracterización de la bebida fermentada 
5.I. Caracterización fisicoquímica 
 5.I.a. Determinación del contenido de humedad 
 Para la determinación de humedad se llenó un cristalizador de vidrio con 
aproximadamente 15 g de arena calcinada con una varilla de vidrio pequeña y se secó en 
estufa de circulación forzada (CHRFI, Dalvo, Argentina) a 103 ± 2 °C, luego se dejó enfriar 
en un desecador y pesó (M0). Seguidamente, se colocó la muestra en el cristalizador con la 
arena, se mezcló con la ayuda de la varilla y se pesó (Mi). Se llevó nuevamente a la estufa 
hasta verificar peso constante (Mf) (3-5 h). 
La humedad se calculó según: 
 
 
Donde: 
M1 = peso de la muestra húmeda (Mi - M0). 
M2 = Peso de la muestra seca (Mf- M0). 
 
5.I.b. Determinación del contenido de cenizas 
Para la determinación de los elementos minerales, se realizó la destrucción de la 
materia orgánica por vía seca basada en el método AOAC 942.05 (2000). El residuo 
inorgánico de la bebida de soja es lo que se denominó ceniza y se expresó como 
 
33 
porcentaje en peso seco de bebida de soja. Los crisoles utilizados se colocaron en la mufla 
(CDM-4007R, Estigia, Argentina) durante 30 min. Luego se colocaron en desecador 
durante al menos 1 h y una vez enfriados a temperatura ambiente, se pesó cada crisol (p). 
Luego se pesó con exactitud hasta el mg más próximo alrededor de 2 g de producto en 
cada crisol (M). Se colocaron las muestras previamente secadas por liofilización, dentro de 
crisoles, para luego llevarlos a una placa caliente bajo campana, y se elevó gradualmente 
la temperatura hasta que cesó la emisión de humo y las muestras aparecieron totalmente 
carbonizadas. Se sometió a la combustión de la materia orgánica hasta obtener un residuo 
blanquecino, libre de carbono para lo cual se colocaron los crisoles en la mufla y se 
incineró durante 3 h a 550 °C. Se sacaron los crisoles de la mufla y se colocaron en un 
desecador durante al menos 1 h, hasta que enfriaron completamente. Se volvió a pesar 
cada crisol con sus cenizas hasta el mg más próximo (P). Se calculó por diferencia el peso y 
el porcentaje de cenizas. 
 
Donde: 
P: Peso del cristalizador más la muestra calcinada. 
p: Peso del cristalizador. 
M: Peso de la muestra. 
 
5.I.c. Determinación del contenido proteico 
Para la determinación del contenido proteico de la bebida de soja el método 
utilizado fue Kjeldahl, empleando un digestor y destilador Büchi (AOAC, 1990; 
Guiragossian, 1977). La bebida de soja seca se digirió con ácido sulfúrico concentrado 
utilizando sulfato de cobre/sulfato de potasio como catalizador, para convertir el 
nitrógeno orgánico en iones amonio. Se añadió álcali para liberar el nitrógeno, el que se 
destiló en exceso de ácido bórico. El destiladose tituló con ácido clorhídrico para 
determinar el amonio absorbido por el ácido bórico (ANEXO 3). 
Digestión de la muestra 
La muestra de bebida de soja seca se colocó en el tubo del digestor Büchi junto con 
10 g de catalizador. Seguidamente, se añadieron 25 mL de ácido sulfúrico concentrado y 
se procedió al calentamiento. Se preparó en forma paralela un blanco de reactivos. Una 
vez que la solución se aclaró, se prosiguió el calentamiento por 30 min más, con lo que se 
aseguró que toda la materia orgánica se encontrara oxidada. Se retiró y se dejó enfriar. 
Luego se agregaron cuidadosamente 100 mL de agua. 
 
 
 
34 
Destilación 
Se preparó una solución de ácido bórico al 4 % p/v, a la que se le añadió una 
solución indicadora (5 mL por litro de ácido bórico al 4 % p/v). Se colocaron 50 mL de 
dicha solución ácida, preparada en un Erlenmeyer de 250 mL y se situó a la salida del 
condensador para recoger el amonio destilado. Se añadió a la muestra digerida, hidróxido 
de sodio al 30 % para liberar el amonio, hasta que la solución tomó una coloración azul 
intensa, como resultado de la formación de un complejo entre iones amonio y cobre, 
indicando que la cantidad de NaOH fue suficiente para neutralizar el exceso de ácido 
sulfúrico. La destilación se llevó a cabo hasta recoger aproximadamente 100 mL de líquido 
en Erlenmeyer colector (3 min). Para determinar el amonio absorbido por el ácido bórico 
se tituló el destilado con ácido clorhídrico 0,1 N. Paralelamente se realizó la titulación del 
blanco de reactivos (ANEXO 3). 
Para la determinación del contenido proteico total, primero se calculó el 
porcentaje de nitrógeno (N) y luego el contenido de proteínas con la aplicación del factor 
F= 6,25. 
 
 Cálculo del porcentaje de nitrógeno: 
 
 
 
Donde: 
MHCl: Molaridad del ácido clorhídrico empleado en la valoración. 
Vm: mL de HCl consumidos en la titulación de la muestra 
Vb: mL de HCl consumidos en la titulación del blanco 
P: peso de muestra en gramos, expresado en base seca 
 
 El porcentaje de proteína bruta se determinó según el cálculo: 
 
% Proteína bruta = % N x 6,25 
 
5.I.d. Determinación del contenido de lípidos 
La determinación de grasas totales se realizó por el método de Soxhlet utilizando 
n-hexano como solvente en cantidad necesaria, siguiendo la norma IUPAC 1.122 (IUPAC, 
1992). Para ello, se pesaron 5 g de leche de soja fermentada seca y se colocaron en 
cartuchos de papel. El proceso de extracción se efectuó durante 6 h a ciclos de reflujo 
continuos a 80 °C. Cumplido este tiempo, el solvente fue evaporado en rotavapor (R-114, 
Büchi, Suiza) a 45 °C y luego, los cartuchos se colocaron en estufa a 105 °C durante 1 h. 
 
35 
 El contenido de grasas totales fue determinado gravimétricamente y se expresó 
como porcentaje en peso sobre base seca, según la ecuación: 
 
 
Donde: 
Pb+g: peso balón con grasa (g) 
Pb: tara del balón (g) 
Pms: peso de la muestra seca (g) 
 
5.I.e. Determinación del contenido de carbohidratos 
 El contenido de hidratos de carbono se calculó como la diferencia entre 100 y la 
suma del contenido de proteínas, grasas, humedad y cenizas. 
 
5.I.f. Valor energético 
El valor energético proporciona una medida de la cantidad de energía que aporta 
una porción del alimento. Se calculó a partir de la suma de la energía aportada por los 
carbohidratos, proteínas y grasas. Se expresó en kilocalorías (Kcal) o kilojoules (KJ) cada 
100 mL de producto. Para determinar la energía que proporcionó cada nutriente, se 
consideró que: 
◆ 1 g de carbohidratos aporta 4 Kcal/17 KJ. 
◆ 1 g de proteínas aporta 4 Kcal/17 KJ 
◆ 1 g de grasas aporta 9 Kcal/37 KJ 
 
5.II. Determinación de la actividad antioxidante 
 La actividad antioxidante de la bebida fermentada se evaluó siguiendo el método 
de captación de radicales 2,2-Difenil-1-Picrilhidrazilo (DPPH). El DPPH es un radical libre 
estable de color violeta, que al aceptar un átomo de H en presencia de compuestos 
antioxidantes, se convierte en una molécula DPPH diamagnética incolora o amarillenta 
(Rani y Pradeep, 2015). El análisis se realizó mediante la adición de 100 µl de diluciones 
apropiadas de muestra a una solución de DPPH en etanol (100 µM). A continuación, se 
midió la absorbancia a 517 nm. La absorbancia de DPPH sin antioxidante (control) se 
utilizó como línea de base. La capacidad de las muestras de bebidas para captar los 
radicales DPPH se calculó como porcentaje de inhibición en comparación con un blanco 
que contiene etanol, después de una incubación de 30 min. El porcentaje de inhibición se 
calculó según la siguiente fórmula: 
 
36 
 
 
Donde: 
AM: Absorbancia de la muestra medida a 517 nm. 
AB: Absorbancia del blanco medida a 517 nm. 
 
5.III. Determinación de la actividad antimicrobiana 
 Se evaluó la capacidad inhibitoria del crecimiento de microorganismos patógenos 
de la bebida fermentada y sus respectivos sobrenadantes, mediante el ensayo de difusión 
en agar, según lo descripto en el ítem 3. Por otro lado, se estudió el crecimiento de los 
microorganismos patógenos indicadores inoculados en las bebidas fermentadas con 
Lacticaseibacillus paracasei BGP1 o Lactiplantibacillus plantarum CIDCA 8327. Para ello, se 
adicionaron a 5 mL de bebida, 200 µL del cultivo del patógeno crecido en caldo nutritivo 
(24 h a 37 °C) y se incubó 24 h a 37 °C, realizándose un recuento de microorganismos 
viables inicial y luego de 24 h, en placas de agar selectivo para cada uno de los patógenos 
estudiados. Se empleó Agar Salmonella-Shigella, Agar Mac Conkey y Agar Chapman para 
Salmonella sp., Escherichia coli y Staphylococcus aureus, respectivamente (ANEXO 3). Los 
resultados se expresaron en UFC/mL. 
6. Resistencia de las bacterias ácido lácticas en bebidas fermentadas sometidas a la 
simulación de pasaje a través del tracto gastrointestinal 
 La resistencia de las BAL en las bebidas fermentadas, frente al pasaje a través del 
tracto gastrointestinal se analizó mediante un tratamiento de digestión in vitro. Para ello, 
se realizaron dos incubaciones seriadas de las bebidas fermentadas (sin y con agregado de 
inulina al 3 % p/v), simulando las condiciones gástricas e intestinales, según Grimound et 
al. (2010) (Figura 6). 
 Para el ensayo se tomaron 2,5 mL de bebida fermentada y se colocaron en 2,5 mL 
de solución gástrica (2X), se ajustó el pH a 2,5 y se incubó durante 90 min a 37 °C. Luego se 
añadieron 5 mL de solución intestinal (2X), se ajustó el pH a 8 y se incubó, nuevamente, 
180 min a 37 °C (ANEXO 3). Se realizaron recuentos de microorganismos viables al inicio y 
al final del tratamiento secuencial, en placas de agar MRS (37 °C, 48 h, en aerobiosis). El 
porcentaje de sobrevida se calculó según: 
 
 
 
 
37 
 
 
Donde: 
UFCfinal: Recuento hallado luego del tratamiento secuencial. 
UFCinicial: Recuento inicial en la bebida de soja fermentada. 
 
 
Figura 6: Esquema del ensayo de simulación gastrointestinal sobre la bebida de soja fermentada con BAL. 
7. Determinación de la viabilidad de las bacterias ácido lácticas en la bebida fermentada 
durante el almacenamiento en refrigeración 
 
 Para analizar la viabilidad de las cepas Lacticaseibacillus paracasei BGP1 y 
Lactiplantibacillus plantarum CIDCA 8327 en las bebidas de soja fermentadas, se 
realizaron recuentos bacterianos luego de la fermentación (inicial) y cada 10 días, durante 
30 días, para observar el comportamiento de las cepas durante el almacenamiento 
refrigerado. La Figura 7, ilustra el procedimiento llevado a cabo para la determinación de 
la viabilidad de BAL durante el almacenamiento de la bebida fermentada. Para los 
recuentos bacterianos, se realizaron diluciones decimales seriadas de la bebida de soja 
fermentada con L. paracasei o L. plantarum adicionada o no con inulina al 3 %, 
respectivamente, almacenadas a 4 °C, y se sembraron diluciones apropiadas en placas de 
agar MRS que se incubarona 37 °C por 48 h. Además, se estudió el pH de las bebidas 
fermentadas a cada tiempo. 
 
 
38 
 
Figura 7: Esquema del ensayo de viabilidad de las cepas probióticas durante el almacenamiento del 
producto final. 
 
8. Análisis estadísticos 
 
Los ensayos fueron realizados por triplicado. Los resultados fueron analizados 
mediante ANOVA y las medias obtenidas fueron comparadas mediante el test de 
comparaciones múltiples LSD Fisher, empleando el software InfoStat (Versión 2018e). Los 
resultados de diferencias con valores p<0,05 fueron considerados estadísticamente 
significativos. 
 
39 
 
 
 
 
Resultados y Discusión 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
40 
Resultados y Discusión 
1. Caracterización de bacterias ácido lácticas y crecimiento en bebida de soja 
 Las bacterias ácido lácticas (BAL) son Gram positivas, no formadoras de esporas, no 
móviles y catalasa negativas. Se pueden encontrar en forma de cocos o bacilos de 
dimensiones variables. No contienen la enzima citocromo oxidasa por lo que carecen de 
actividad respiratoria. Son anaerobios tolerantes y en medios de cultivo sólidos forman 
colonias en presencia de oxígeno. La mayoría de las especies de BAL requieren 
aminoácidos y vitaminas del grupo B para su crecimiento. Son quimoorganotróficos y en 
general, crecen solamente en medios complejos. Pueden emplear hidratos de carbonos 
fermentables o alcoholes como fuente de energía para sintetizar ácido láctico 
(homofermentativos) y otros productos como acetato, etanol, CO2, formiato o succinato 
(heterofermentativos) (Huertas, 2010). La especie L. paracasei está conformada por 
bacilos de entre 2,0 y 4,0 μm de largo, a menudo con extremos cuadrados, no móviles y se 
disponen individualmente o en cadenas. Su temperatura de crecimiento está 
comprendida entre 5 y 45 °C (Collins et al., 1989). Esta especie posee un metabolismo 
anaerobio facultativo, heterofermentativo, producen ácido láctico como principal 
producto final de la fermentación y no generan gas a partir de la glucosa. En condiciones 
de glucosa limitadas, producen ácido acético, etanol y ácido fórmico (Montecinos, 2007). 
Por otro lado, la especie L. plantarum está conformada por bacilos con extremos 
redondeados y dimensiones comprendidas entre 0,7 y 1,6 μm (Zapata et al., 2009) y se 
presentan de forma individual o agrupada en cadenas cortas (Todorov y Franco, 2010). Es 
una bacteria anaerobia facultativa, heterofermentativa y tiene la capacidad de absorber y 
utilizar diversos azúcares. Fermenta generalmente hexosas a través de la vía metabólica 
Embden Meyerhof Parnas y pentosas, resultando en la formación de ácido D- y L-láctico y 
acético (Melgar-Lalanne et al., 2012). En la Figura 8 se puede observar la morfología de las 
cepas L. plantarum CIDCA 8327 y L. paracasei BGP1, utilizadas en el presente trabajo en 
preparados obtenidos a partir de cultivos líquidos, teñidos mediante coloración de Gram. 
Las cepas presentaron marcadas diferencias en el modo de agrupación, mientras que no 
mostraron diferencias en su morfología, observándose bacilos rectos, en ambos casos. 
 
41 
 
Figura 8: Fotografías tomadas con microscopio óptico (1000X) de los preparados teñidos mediante 
coloración de Gram de las cepas Lactiplantibacillus plantarum CIDCA 8327 (A) y Lacticaseibacillus paracasei 
BGP1 (B). 
 
 El azúcar mayoritario presente en la bebida a base de soja es sacarosa, con un 
contenido que varía entre 41-67 % de los azúcares totales, seguido de estaquiosa (12-35 
%), fructosa y rafinosa entre 5 y 16 % (Božanić et al., 2011). En particular, el extracto de 
soja empleado en este trabajo consiste en un hidrolizado proteico con agregado de jarabe 
de glucosa. Además la bebida de soja contiene proteínas de alta calidad, no contiene 
colesterol, ni lactosa y solo una pequeña cantidad de ácidos grasos saturados (Wang et al., 
2003). Estas características composicionales, la califican como una matriz base 
conveniente desde el punto de vista nutricional, sumado a que constituye un medio 
potencialmente adecuado para el desarrollo de BAL, aspecto que permitiría obtener un 
alimento funcional fermentado. 
 En el presente trabajo, en primera instancia, se analizó el crecimiento de las cepas 
L. paracasei y L. plantarum, la modificación del pH y la acidez producida durante la 
incubación a 37 y 42 °C en bebida de soja, en comparación con MRS, este último medio de 
cultivo fue utilizado como control positivo de crecimiento. Los resultados de estos análisis 
se muestran en las Figuras 9 y 10. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
42 
 
 
Figura 9: Curvas de crecimiento (UFC/mL vs. t) de Lacticaseibacillus paracasei BGP1 en bebida de soja (A) y 
MRS (B) a 37 °C (∆) y 42 °C (□). 
Curvas pH vs. t de Lacticaseibacillus paracasei BGP1 en bebida de soja (C) y MRS (D) a 37 °C (∆) y 42 °C (□). 
Curvas Acidez titulable expresada como % de ácido láctico (g/L) vs. t de Lacticaseibacillus paracasei BGP1 en 
bebida de soja (E) y MRS (F) a 37 °C (∆) y 42 °C (□). 
 
A B 
C D 
E F 
 
43 
 
Figura 10: Curvas de crecimiento (UFC/mL vs. t) de Lactiplantibacillus plantarum CIDCA 8327 en bebida de 
soja (A) y MRS (B) a 37 °C (∆) y 42 °C (□). 
Curvas pH vs. t de Lactiplantibacillus plantarum CIDCA 8327 en bebida de soja (C) y MRS (D) a 37 °C (∆) y 
42 °C (□). 
Curvas Acidez titulable expresada como % de ácido láctico (g/L) vs. t de Lactiplantibacillus plantarum CIDCA 
8327 en bebida de soja (E) y MRS (F) a 37 °C (∆) y 42 °C (□). 
A B 
C D 
E F 
 
44 
 En la Figura 9 A y B se puede observar que L. paracasei BGP1 creció 
satisfactoriamente en la bebida de soja a las dos temperaturas estudiadas. El conteo 
máximo obtenido en bebida de soja a ambas temperaturas, fue menor que en MRS y en 
ambos medios, los recuentos máximos a 37 °C fueron mayores que a 42 °C. La bebida de 
soja presentó inicialmente un pH de 6,5 y luego de 24 h de fermentación disminuyó hasta 
valores menores a 5,5 para ambas temperaturas. Mientras que para el mismo tiempo de 
fermentación, en MRS los valores de pH obtenidos fueron menores a 3,5. Esto indica que 
la actividad metabólica fermentativa de la bacteria generó productos ácidos. De acuerdo 
con estos resultados, se puede observar que las diferencias en el descenso de pH se 
corresponden con el aumento de la acidez titulable en la bebida de soja, ya que para el 
tiempo final de fermentación (24 h), los valores de acidez obtenidos en la bebida de soja, 
fueron menores a los encontrados en MRS. 
Por su parte, la cepa L. plantarum fue capaz de crecer en la bebida de soja a ambas 
temperaturas, alcanzando recuentos finales cercanos a 109 UFC/mL, similares a los 
obtenidos en MRS (Figura 10). Los valores de pH finales obtenidos luego de 24 h de 
fermentación de la bebida de soja con L. plantarum fueron cercanos a 3,5, para ambas 
temperaturas y no se detectaron diferencias significativas respecto a los obtenidos en 
MRS. No obstante, la acidez titulable obtenida luego de la fermentación de la bebida de 
soja a 37°C, fue menor que a la obtenida en MRS, mientras que a 42°C no se registró un 
incremento en la acidez titulable en ninguno de los medios analizados. Otros autores 
hallaron porcentajes de ácido láctico (medido por acidez titulable) entre 0,3 y 0,5 % en 
bebida de soja fermentada por 24 h a 37°C con S. thermophilus MD2, L. helveticus, L. 
rhamnosus, L. rhamnosus V3, NS6 y NS4 (Hati et al., 2018). Mital y Steinkraus (1974), 
hallaron que la cepa L. plantarum B-246 presentó mayor crecimiento y producción de 
ácido en leche de soja que en leche de vaca a 30°C por 16-18 h debido a su capacidad para 
utilizar sacarosa. 
La relación entre el crecimiento de BAL y la producción de ácido láctico en bebida 
de soja, se encuentra estrechamente vinculada a la capacidad de utilizar los azúcares 
disponibles (Angeles y Marth, 1971; Mital y Steinkraus, 1974; Wang et al., 2002). En el 
presente trabajo tanto la curva dedescenso de pH de la bebida de soja como sus valores 
finales alcanzados por la fermentación con L. plantarum fueron diferentes y menores, 
respectivamente, que los obtenidos con L. paracasei, indicando diferencias metabólicas 
entre estas cepas. Marazza et al. (2009) reportaron que el pH de leche de soja fermentada 
con L. rhamnosus CRL981 disminuyo rápidamente entre las 6 y 12 h de incubación a 37 °C 
y los recuentos alcanzaron valores de 8,85 log UFC/mL después de 12 h. Otros autores 
demostraron que el cultivo mixto ABT5 (Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp., y 
Streptococcus thermophilus) produjo un descenso de pH de la bebida de soja fermentada 
a 42 °C hasta valores de 4,6 en un tiempo más corto que a 37 °C, estas diferencias pueden 
 
45 
deberse a las características de las BAL en el cultivo mixto cuyas temperaturas óptimas de 
crecimiento serían superiores a las de las cepas utilizadas en el presente trabajo. En 
contraste, Wang et al. (2002) indicaron que las cepas L. acidophilus CCRC 14079 y L. 
bulgaricus CCRC 14009 no produjeron una disminución significativa del pH de la bebida de 
soja cuando se fermentó 24 h a 37 °C debido a la ausencia de la enzima α-galactosidasa y 
la consecuente incapacidad de fermentar los azúcares presentes en la bebida de soja. 
La baja capacidad amortiguadora de pH de la bebida de soja, con respecto a otras 
matrices, por ejemplo leche, fue indicada por varios autores (Farnworth et al., 2007; Wang 
et al., 2009). En el presente trabajo se observó que la bebida de soja fermentada con L. 
plantarum a 37 °C, presentó menores valores de pH y mayores porcentajes de acidez 
titulable respecto a la bebida fermentada con L. paracasei, indicando una menor 
capacidad de adaptación al medio, de esta última cepa (Figura 10). En concordancia 
Božanić et al. (2011) informaron que Lactobacillus acidophilus presentó una débil 
capacidad de crecimiento en bebida de soja. 
A partir de las curvas de crecimiento obtenidas, se calculó la velocidad de 
crecimiento de las cepas en los diferentes medios y los resultados se presentan en la Tabla 
4. 
Tabla 4: Velocidad de crecimiento de Lacticaseibacillus paracasei BGP1 y 
Lactiplantibacillus plantarum CIDCA 8327 en MRS y bebida de soja durante la 
fermentación a 37 y 42 °C. 
CEPA 
µ MRS(h-1) µ Bebida de soja (h-1) 
37°C 42°C 37°C 42°C 
Lacticaseibacillus 
paracasei BGP1 
0,45 ± 0,02Aa 0,33 ± 0,03Ba 0,32 ± 0,04Aa 0,18 ± 0,06Aa 
Lactiplantibacillus 
plantarum CIDCA 8327 
0,50 ± 0,01Ab 0,23 ± 0,03Ba 0,40 ± 0,01Aa 0,24 ± 0,06Aa 
μ indica la velocidad de crecimiento (unidad). Valores promedio ± desviación estándar. Análisis de varianza 
seguido de Test de comparación múltiple (LSD-Fisher). Los superíndices con letras mayúsculas indican 
diferencias entre temperaturas en el mismo medio (p<0,05). Letras minúsculas indican diferencias entre 
medios a igual temperatura (p<0,05). 
 
 La velocidad de crecimiento de ambas cepas en la bebida de soja a 37 °C fue mayor 
que a 42 °C, sin embargo estas diferencias no fueron estadísticamente significativas. La 
cepa L. paracasei no presentó diferencias en la velocidad de crecimiento en bebida de soja 
en comparación con MRS a cada temperatura, mientras que la velocidad de crecimiento 
 
46 
de L. plantarum en bebida de soja a 37 °C, fue significativamente menor que en MRS 
(Tabla 4). 
Estos ensayos indicarían que estas cepas podrían emplearse como straters para el 
desarrollo de una bebida fermentada a base de hidrolizado proteico de soja, dada la 
evidencia de su capacidad de desarrollo en esta matriz empleando 37 °C, como 
temperatura de incubación. 
 
2. Actividad antimicrobiana de las bacterias ácido lácticas y sus sobrenadantes 
 Dentro de los beneficios que aportan los microorganismos probióticos, se 
encuentra la capacidad de inhibir el crecimiento de bacterias patógenas a través de 
diversos mecanismos, por ejemplo mediante el descenso de pH del medio, la competencia 
por nutrientes o sitios de adhesión, la estimulación del sistema inmune y la producción de 
sustancias antimicrobianas, como ácido láctico y otros ácidos de cadena corta, 
metabolitos como peróxido de hidrógeno, diacetilo y bacteriocinas (Tabasco, 2009). En el 
presente trabajo se evaluó la actividad antimicrobiana de las cepas L. paracasei BGP1 y L. 
plantarum CIDCA 8327, así como de sus sobrenadantes de cultivo, frente a los siguientes 
microorganismos patógenos indicadores Gram negativos: Escherichia coli y Salmonella sp., 
y Gram positivo: Staphylococcus aureus. Las cepas patógenas indicadoras utilizadas fueron 
seleccionadas por su importancia en la industria alimentaria, siendo unas de las 
principales causantes de Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETAs). Su presencia 
en los alimentos podría deberse a su incorrecta manipulación, falta de higiene, malos 
hábitos, entre otros motivos. 
 En el presente trabajo, mediante el método de difusión en agar, se observaron 
halos traslúcidos en la zona periférica a las colonias desarrolladas por las bacterias lácticas 
sobre placas de cultivo conteniendo a los patógenos. Esto indica que las BAL ejercieron un 
efecto inhibitorio del crecimiento de los patógenos estudiados (Figura 11). Este efecto 
podría atribuirse a alguno/s de los diversos mecanismos de acción mencionados 
previamente. 
 
 
47 
 
Figura 11: Halos de inhibición del crecimiento de los patógenos: A) Staphylococcus aureus. B) Escherichia 
coli. C) Salmonella sp., ejercido por las bacterias probióticas, obtenidos mediante el ensayo de difusión en 
agar. 
En la Tabla 5 se muestran las medidas de los diámetros de los halos de inhibición 
(mm) producidos por las cepas L. paracasei y L. plantarum frente a los microorganismos 
patógenos indicadores. 
Tabla 5: Halos de inhibición (mm) producidos por las cepas probióticas crecidas en 
caldo MRS frente a los microorganismos patógenos indicadores. 
CEPAS 
Halos de inhibición (mm) 
Salmonella 
sp. 
Escherichia 
coli 
Staphylococcus 
aureus 
Lactiplantibacillus plantarum CIDCA 
8327 
34,2 ± 5,2A 30,6 ± 1,7A 28,1 ± 3,9A 
Lacticaseibacillus paracasei BGP1 29,9 ± 1,8A 34,3 ± 5,5A 29,7 ± 3,6A 
Valores promedio ± desviación estándar. Análisis de varianza seguido de Test de comparación múltiple (LSD-
Fisher). Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p>0,05). 
Los resultados obtenidos indicaron que no existieron diferencias significativas 
entre el efecto inhibitorio de las cepas de L. paracasei y L. plantarum frente a los tres 
patógenos indicadores (p>0,05). La actividad antimicrobiana de las BAL podría deberse a 
la presencia de compuestos liberados durante el proceso de fermentación, los cuales 
permanecerían en los medios de cultivo, aún si los microorganismos pierden viabilidad o 
bien son separados por métodos físicos. En la Tabla 6 se presentan las medidas de los 
halos de inhibición producidos por los sobrenadantes obtenidos por centrifugación, de los 
cultivos de las BAL en caldos MRS, frente a los patógenos indicadores. La presencia de 
halos traslúcidos generados por los mismos, en el ensayo de difusión en agar evidencia un 
 
48 
efecto inhibitorio por parte de los sobrenadantes, frente al crecimiento de los patógenos 
estudiados. 
Tabla 6: Halos de inhibición (mm) producidos por los sobrenadantes de las 
bacterias lácticas crecidas en caldo MRS frente a los microorganismos patógenos 
indicadores. 
SOBRENADANTES 
Halos de inhibición (mm) 
Salmonella 
sp. 
Escherichia 
coli 
Staphylococcus 
aureus 
Lactiplantibacillus plantarum CIDCA 
8327 
11,0 ± 1,3A 12,2 ± 0,9A 9,7 ± 0,6A 
Lacticaseibacillus paracasei BGP1 12,5 ± 0,5A 12,7 ± 0,6A 8,8 ± 0,4A 
Ácido Láctico 1% 7,0 ± 0,0A 9,0 ± 0,0A 8,0 ± 0,0A 
Análisis de varianza seguido de Test de comparación múltiple (LSD-Fisher) entre promedios de diámetros 
(mm) para cada microorganismo indicador. Medias con una letra común no son significativamente 
diferentes