teórico cromatografía

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CROMATOGRAFÍA
Fase estacionaria: sólido o líquido fijado a un sólido
Fase móvil: fluído (líquido o gas) que arrastra la muestra a través de la fase estacionaria
Los distintos componentes de la mezcla interaccionan de manera diferente con las dos fases estableciéndose un reparto entre ambas
Se establece un equilibrio entre partículas adsorbidas y desorbidas
α = [moléculas adsorbidas]
 [mol. adsorbidas] + [mol. desorbidas]
coeficiente de reparto
FASE ESTACIONARIA
FASE MÓVIL
Clasificaciones de cromatografía
1. Según como se encuentre la fase estacionaria
b. batch 
a. columna 
c. plana cromatografía en papel y en capa fina
2. Según el tipo de fase estacionaria y fase móvil
Fase estacionaria
Líquido adsorbido
Fase móvil
Sólida
Líquida o gaseosa
Líquida o gaseosa
3. Según el tipo de flujo empleado
a. Gravedad
b. Capilaridad (papel, capa fina)
c. Fluído a presión (HPLC)
HPLC (high performance liquid chromatography)
Se basa en los mismos principios que la cromatografía a baja presión
Tiene mejor resolución, tiempos menores, mejor reproducibilidad
El material empacado en las columnas está formado por pequeñas partículas de tamaño muy uniforme y gran rigidez
Permite trabajar con flujos altos para lo que se requiere aplicar presión
Se requiere de columnas especiales construidas en acero inoxidable o vidrio grueso
FPLC (fast protein liquid chromatography)
Es una variante del HPLC con columnas y equipamiento especialmente diseñado para separar o purificar proteínas
Las columnas de FPLC soportan menos presión que las de HPLC
4. Según la finalidad del experimento
Separación y purificación
Preparativa
Separación, cuantificación y caracterización
Analítica
4. Según la interacción entre la fase móvil y el soluto
a. Cromatografía de intercambio iónico		carga-carga
b. Cromatografía de interacción hidrofóbica		efecto hidrofóbico
c. Cromatografía de afinidad		variada pero específica
d. Cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC)		
e. Cromatografía de fase normal y reversa		dipolos
enlaces covalentes
Cromatografía de intercambio iónico
La separación se basa en diferencias de carga a un pH dado
Las interacciones son electrostáticas
Dos tipos
Elución: puede llevarse a cabo mediante cambios de pH, fuerza iónica o ambos
Intercambio aniónico: matriz cargada positivamente (DEAE, TEA, QAE) 
Intercambio catiónico: matriz cargada negativamente (carboximetilos, sulfonatos, fosfatos)
Condiciones iniciales
Aplicación de la muestra
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Aumento en la concentración de sales
Elución de la proteína de interés
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Cromatografía de afinidad
Se basa en una interacción biológica específica:
Enzima-sustrato
Anticuerpo-antígeno
Enzima-coenzima
Proteína-ligando específico
La elución se puede lograr agregando el ligando (el que está unido a la columna) en solución o mediante cambios en el buffer que sean capaces de debilitar la interacción
IMAC (immobilized metal affinity chromatography)
Se basa en la formación de enlaces de coordinación entre iones metálicos inmovilizados y grupos básicos en proteínas (histidinas)
Principalmente a los iones divalentes de metales de transición como Fe, Co, Ni, Cu y Zn 
La elución se lleva a cabo adicionando quelantes más fuertes como el imidazol a distintas concentraciones o cambios en el pH
Es muy utilizada para la purificación de proteínas recombinantes
Generalmente se adicionan 6 histidinas en el extremo Nt o en el Ct
Cola de (Histidina)6
Ni2+
Cromatografía de interacción hidrofóbica
El soporte está sustituído con cadenas alifáticas de 2 a 10 carbonos u otros grupos hidrofóbicos
La interacción es de tipo hidrofóbica
La fase móvil debe tener una alta concentración de sales ((NH4)2SO3 2 – 4 M)
Salting out
Para la elución se disminuye la concentración de sales en la fase móvil
Cromatografía de fase reversa
Está muy relacionada con la cromatografía de interacción hidrofóbica pero son diferentes
El soporte está sustituído por alifáticas pero más largas (8 -18 carbonos) y la densidad de sustituyentes es mayor 
La unión es más fuerte y por eso requiere mezclas con solventes no polares para la elución
Desnaturaliza proteínas
Se utiliza en HPLC
Gel filtración (cromatografía de exclusión molecular)
No es una cromatografía
La separación se da por tamaño
El gel debe ser inerte, de tamaño de poro definido y sin carga
Múltiples aplicaciones:
	Cambios de buffer
	Separación de moléculas de bajo peso molecular de otras de mayor 	tamaño
	Determinación del peso molecular
Resultado final: cromatograma
Velución (mL)
Velución (mL)
y
y
y = unidades de absorbancia, unidades de fluorescencia relativa, intensidad del pico (espectrometría de masa), entre otras
La pregunta más importante…	
¿En qué son distintas las sustancias que deseo separar?
Concluyendo….