Practica 8e

Vista previa del material en texto

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE MEDICINA Y HOMEOPATÍA
	ASIGNATURA:
	INMUNOLOGÍA MÉDICA
	GRUPO: 
	EQUIPO: 
	FECHA 
	PRÁCTICA:
	Técnicas inmunológicas 3
	PROFESOR:
	Sánchez Cruz Pedro 
	ESTUDIANTES
	Cortes Morales Josue Antuan 
	
	
RÚBRICA DEL REPORTE DE PRÁCTICA DE LABORATORIO
	Criterio de evaluación 
	NIVELES DE CONSOLIDACIÓN DE COMPETENCIAS 
	Puntos obtenidos
	
	4 Amplio
	3 Regular
	2 Bajo
	1 Escaso
	
	Objetivos
(5%)
	El alumno escribe objetivos general y particulares de forma clara y concisa.
5 puntos
	El alumno escribe objetivos general y particulares no de forma clara ni concisa.
3-4 puntos
	El alumno escribe objetivos general y particulares de forma incompleta.
1-2 puntos
	El alumno no escribe objetivos general ni particulares 
0 puntos
	
	
Marco teórico (Introducción)
(30%) 
	El alumno redacta la introducción de manera clara, sustentando el texto con al menos tres fuentes de información, esta parafraseado e ilustrado .
25-30 puntos 
	El alumno redacta la introducción de manera regular, con al menos tres fuentes de información. Regular parafraseado e ilustrado
16-24 puntos 
	El alumno redacta la introducción de manera regular, sustentando la información en una o dos fuentes de información. Mal parafraseo e ilustrado
9-15 puntos
	El alumno no redacta ni sustenta la información de la introducción. No esta parafraseado ni ilustrado
0-8 puntos
	
	
Diagrama de flujo
(5%) 
	El alumno elabora el diagrama completo, incluyendo conexiones correctas y colocando relaciones en estas, obteniendo como resultado final un diagrama que es fácil de interpretar
5 puntos
	El alumno coloca la mayoría de los conceptos, estableciendo relaciones apropiadas la mayoría de las veces, dando como resultado un diagrama fácil de interpretar.
3-4 puntos
	El alumno coloca pocos conceptos, estableciendo poca relación entre ellos, dificultando el entendimiento del diagrama
1-2 puntos
	Los conceptos son incongruentes, sin relaciones correctas, dando como resultado un diagrama imposible de interpretar. 
0 puntos
	
	
Resultados 
(20%) 
	El alumno reporta totalmente las observaciones y mediciones realizadas, utilizando diversos recursos para presentarlos. 
17-20 puntos
	El alumno reporta parcialmente las observaciones y mediciones realizadas, utilizando diversos recursos para presentarlos. 
13-16 puntos
	El alumno reporta parcialmente las observaciones y mediciones realizadas, sin utilizar diversos recursos para presentarlos. 
9-12 puntos
	El alumno no reporta a través de algún recurso las observaciones y mediciones realizadas 
0-8 puntos
	
	Análisis de Resultados
(10%)
	El alumno redacta análisis de resultados de la práctica con sentido crítico y bien fundamentado.
9-10 puntos
	El alumno redacta análisis de resultados de la práctica de manera parcial, con sentido crítico.
7-8 puntos
	El alumno redacta análisis de resultados de la práctica sin sentido crítico ni fundamento.
5-6 puntos
	El alumno no es capaz de redactar análisis de resultados de la práctica
0-4 puntos
	
	
Conclusiones 
(10%) 
	El alumno redacta conclusiones de la práctica con sentido crítico y bien fundamentado.
9-10 puntos 
	El alumno redacta conclusiones de la práctica de manera parcial, con sentido crítico y fundamentado. 
7-8 puntos
	El alumno redacta conclusiones de la práctica de manera parcial, sin sentido crítico ni fundamento. 
5-6 puntos
	El alumno no es capaz de redactar conclusiones de la práctica
0-4 puntos
	
	Cuestionario o trabajo de laboratorio
(15%) 
	El alumno contesta de manera correcta la totalidad de las preguntas del cuestionario o entrega su investigación completa.
Con referencias
12-15 puntos 
	El alumno contesta algunas preguntas del cuestionario de manera correcta, o entrega su investigación parcialmente completa. Con referencias
8-11 puntos
	El alumno contesta algunas preguntas del cuestionario de manera incorrecta, o entrega su investigación incompleta.
Referencias incompletas
4-7 puntos
	El alumno no contesta el cuestionario, o no entrega su investigación. 
Sin referencias
0-3 puntos
	
	Referencias
(5%)
	El alumno escribe de 3 a 5 referencias con estilo APA
5 puntos
	El alumno escribe de 3 a 5 referencias pero sin estilo.
3-4 puntos
	El alumno anota menos de 3 referencias sin estilo APA
1-2 puntos
	El alumno no escribe referencias.
0 puntos
	
	Calificación (total de puntos)
	
REPORTE Práctica 8
TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS III (WB Y CITOMETRÍA DE FLUJO)
OBJETIVO GENERAL. 
Reconocer la importancia de las técnicas inmunológicas especializadas Western Blot y Citometría de Flujo en el diagnóstico inmunológico, a través del análisis de las características de la reacción antígeno-anticuerpo y de las diferencias de las técnicas que les permitan ser utilizadas en diferentes pruebas diagnósticas.
OBJETIVOS PARTICULARES
Observar el desarrollo las técnicas para saber en que funcionan 
Desarrollar la habilidad para realizar dichas técnicas 
MARCO TEÓRICO (INTRODUCCIÓN). A) De las técnicas de Western Blot y Citometría de flujo
Western blot es una técnica de laboratorio utilizado para detectar una proteína específica en una muestra de sangre o tejido. El método implica el uso de electroforesis en gel para separar las proteínas de la muestra. Las proteínas separadas se transfieren del gel a la superficie de una membrana. La membrana se expone a un anticuerpo específico contra la proteína en estudio. La unión del anticuerpo se detecta usando un marcador radiactivo o químico. Un Western Blot se utiliza a veces para diagnosticar enfermedades.
La especificidad del Western Blot se logra mediante el uso de un anticuerpo que reconoce y se une a un epítopo único de la proteína de interés.
Básicamente, las transferencias de Western son herramientas útiles en cualquier momento en que le gustaría obtener información sobre la expresión de proteínas en sus muestras. Se puede usar para indicar si la muestra expresa la proteína de interés o para realizar comparaciones cuantitativas de los niveles de proteína entre diferentes muestras o grupos de tratamiento. Es muy útil para validar la especificidad de un anticuerpo si su objetivo final es usarlo en inmunohistoquímica, o inmunocitoquímica, ya que la reacción cruzada se puede ver fácilmente en el western blot.
La citometría de flujo representa un método rápido objetivo y cuantitativo de análisis de células, núcleos, cromosomas, mitocondrias u otras partículas en suspensión.
El principio en el que se basa esta tecnología es simple: hacer pasar células u otras partículas en suspensión alineadas y de una en una por delante de un haz luminoso. La información producida puede agruparse en dos tipos fundamentales: la generada por la dispersión de la luz y la relacionada con la emisión de luz por los fluorocromos presentes en la célula o partícula al ser excitados por el rayo luminoso. Las señales luminosas detectadas se transforman en impulsos eléctricos que se amplifican y se convierten en señales digitales que son procesadas por una computadora
La citometría de flujo permite medir diferentes parámetros de una célula. Éstos se dividen en: 
· Parámetros nucleares
· Parámetros citoplásmicos
· Parámetros de superficie
· Parámetros extracelulares
DIAGRAMA DE FLUJO. De la técnica de WB y de la técnica de Citometría de flujo. 
RESULTADOS 
Complete el cuadro
	Comparación de los Tipo de Western Blot
	Tipo de WB
	Ventajas
	Desventajas
	Semi seca
	Es mucho más rápida 
	Se puede secar al momento de pasar las proteínas 
	Medio húmedo
	Mejor para proteinas más grandes y es permisible en temperaturas bajas como de 5°C a 10°C 
	Suele tardar más 
	Bandas en el Western Blot que indican resultado positivo a infección por VIH
	Abs vs Ag. (PM de la banda)
	Ubicación del antígeno en el virión
	Gp120
	Kda 140/ ENV
	P24
	Kda 25/proteína interna 
	P31
	Kda 50/proteína transmembrana 
	Gp41
	Kda 35 
Complete el cuadro
	MARCADORES DE LINFOCITOS (CD)) IDENTIFICADOS POR CITOMETRÍA DE FLUJO
	Tipo de célula
	CD
	Tipo de célula
	CD
	Células troncales
	CD34+, CD117-, CD31
	LinfocitosB
	CD45+, CD19+, CD20+, CD24+, CD38+, CD22
	Todos los linfocitos T
	CD3+, CD45 
	Linfocitos NK
	CD16+, CD56+, CD3-, CD31, CD30, CD38
	Linfocitos T citotóxicos
	CD3 CD45 CD8
	Linfocitos NKT
	CD16+, CD56+
	Linfocitos T cooperadores
	CD4, CD3, CD45
	Granulocitos
	CD45+ CD11b, CD15+, CD24+, CD114+, CD182+
	Linfocitos T reguladores
	FOXP3, CD25, CD4
	Monocitos
	CD4, CD45+, CD14+, CD114+, CD182+
Complete el cuadro
	FLUOROCROMO UTILIZADOS EN CITOMETRÍA DE FLUJO
	Fluorocromo
	Color
	FITC 
	Verde 
	Aloficocianina APC
	Rojo
	ECD
	Naranja
	PerCP
	Guinda 
	AMCA
	Azul
ANÁLISIS DE RESULTADOS sobre las ventajas del WB y en comparación de la técnica de ELISA.
Las membranas húmedas son flexibles y fáciles de manipular.
Las proteínas bloqueadas en la membrana son accesibles para los diferentes ligandos.
Fotografías al momento de la muestra 
Mayor especificidad 
Puede funcionar por más tiempo 
Explicación la utilidad de la citometría de flujo para la determinación de las subpoblaciones de linfocitos.
Se amplia la posibilidad de analizar marcadores para subpoblaciones, su especificidad tiene el plus del uso del citómetro, uso por dispersión de luz, tamaño y la selección del área de trabajo 
Explicación de las diferencias entre la citometría de flujo (FACS) y la inmunofluorescencia.
El primero permite la medición de las células de acuerdo a las características para con ello dar acabo un resultando mientras que en la inmunofluorescencia esta es llevada acabo por citocromos los cuales únicamente se van a iluminar con la presencia del patógeno 
CONCLUSIONES (Con base a los objetivos y los resultados).
Podemos concluir que estas técnicas son de gran importancia en la práctica clínica ya que de acuerdo a estas es la mejor manera de acuerdo a la enfermedad que se llegue a presentar tal como ya se habló de VIH claro, esta con cierto tipo de mediciones, por lo que nos lleva a que llevar acabo correctamente estas técnicas es de suma importancia para evitar en ciertos casos lo que es un falso positivo 
CUESTIONARIO Práctica No. 8 
1. ¿Cuáles son las aplicaciones del WB?
Detectar la presencia de la proteína diana en una muestra concreta. Cuantificar dicha proteína mediante la carga en gel de los controles correspondientes que permitan la normalización de su concentració
2. Además del uso de conjugados unidos a peroxidasa ¿Qué otros sistemas de detección se utilizan en el WB?
· Biologia celular 
· Biomarcadores 
3. ¿Cuáles son los tres sistemas que componen al citómetro de flujo?
· Optico
· Electrico 
· Fluorhidrico 
4. ¿Qué significa los términos SSC y FSC en la citometría de flujo?
La desviación frontal de la luz determina el tamaño celular (FSC) mientras que la dispersión lateral determina la complejidad (SSC).
5. ¿Qué tipo de gráficos se pueden analizar en la citometría de flujo?
Histogramas univariantes, donde se representa un parámetro relativo a la fluorescencia en el eje de abscisas y el número de células en el eje de ordenadas.
REFERENCIAS 
BARRERA RAMÍREZ, LOURDES MARÍA, DRAGO SERRANO, MA. ELISA, PÉREZ RAMOS, JULIA, SAINZ ESPUÑES, TERESITA DEL ROSARIO, ZAMORA, ANA CECILIA, GÓMEZ ARROYO, FABIOLA, & MENDOZA PÉREZ, FELIPE. (2004). CITOMETRÍA DE FLUJO: VÍNCULO ENTRE LA INVESTIGACIÓN BÁSICA Y LA APLICACIÓN CLÍNICA. Revista del Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias, 17(1), 42-55. Recuperado en 06 de noviembre de 2022, de http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0187-75852004000100007&lng=es&tlng=es.
BARRERA RAMÍREZ, LOURDES MARÍA, DRAGO SERRANO, MA. ELISA, PÉREZ RAMOS, JULIA, SAINZ ESPUÑES, TERESITA DEL ROSARIO, ZAMORA, ANA CECILIA, GÓMEZ ARROYO, FABIOLA, & MENDOZA PÉREZ, FELIPE. (2004). CITOMETRÍA DE FLUJO: VÍNCULO ENTRE LA INVESTIGACIÓN BÁSICA Y LA APLICACIÓN CLÍNICA. Revista del Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias, 17(1), 42-55. Recuperado en 06 de noviembre de 2022, de http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0187-75852004000100007&lng=es&tlng=es. 
Abcam (2020), Wester blot Protocol, abcam research, recuperado el 05 de noviembre de 2022 de: https://www.abcam.com/protocols/general-western-blot-protocol 
Western Blot 
Preparacion de la muestra 
Electroforesis en gel (SDS-PAGE)
Transferencia electroforetica a una membrana de nitrocelulosa 
Bloque de la membrana de nitrocelulosa 
Hibridación del anticuerpo (muestra)
Detección de Bandas 
Citomertria de flujo 
Mezclar 100µL de sangre periférica del reactivo a identificar 
Incubar 20min en oscuridad a temperatura ambiente 
Añadir 1ml de buffer de lisis de globulos rojos 
Incubar 10 min a temperatura ambiente en oscuridad 
Lavado: pasar muestra aun tubo falcon de 15ml contenido de 10 ml de PBS frio. Centrifugar a 400xmin 5min
Descartar el sobrenadante por volcado y suspender el el pellet de células en 1 ml de PBS
Analizar por citometria de flujo 
Preparar tubo control del isotopo 
Mantener en hielo y resguardar de la luz