Tecnicas de Biología Molecular II

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Tecnicas de Biología Molecular II
El siguiente link lleva a un pdf que contiene brevemente explicadas la mayoría de las técnicas de biología molecular: http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/23IngenGenet1_23749.pdf
Blotting 
Es una técnica que permite la detección de una secuencia determinada en una mezcla compleja resultante de una corrida electroforética.
Hibridación por sondas:
Una sonda es un fragmento de tamaño variable que puede ser ADN o ARN, que se une específicamente por complementariedad de bases a la secuencia que se encuentra en la membrana de nylon junto con cientos de fragmentos más. La sonda hibrida con el fragmento específico. Una característica fundamental de la sonda es que lleva alguna marca para que pueda detectarse la unión y, por ende, identificar la secuencia de interés a la cual se unió. Una de las técnicas más ampliamente utilizadas para marcar la sonda es la incorporación de un nucleótido radioactivo. Existen nucleótidos comerciales marcados con fosforo radioactivo que al incorporarse en una sonda por diferentes técnicas le permite ser detectada mediante la exposición de la membrana a una placa autorradiografica (como la de los rayos x).
Extracción Digestión Electroforesis en gel Desnaturalización Transferencia a membrana Hibridación con sonda radioactiva Lavado Revelado
Si se trata de proteínas, la técnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con radioactividad para identificar cuál es la banda que presenta la proteína que me interesa localizar
Si se trata de DNA, la técnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (moléculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda
Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (moléculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda
Electroforesis
Electroforesis Cuantitativa: Cuantificar que cantidad tengo en cada banda.
Electroforesis Preparativa: Preparar para un trabajo posterior.
La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de éstas en un campo eléctrico. La separación puede realizarse sobre la superficie hidratada de un soporte sólido (p. ej., electroforesis en papel o en acetato de celulosa), a través de una matriz porosa (electroforesis en gel), o bien en disolución (electroforesis libre). Dependiendo de la técnica que se use, la separación obedece en distinta medida a la carga eléctrica de las moléculas y a su masa.
La electroforesis se usa en una gran mayoría en la materia del ADN recombinante ya que nos permite saber la carga que poseen los polipéptidos, y separar los diferentes polipéptidos resultantes de las variaciones del experimento del ADN recombinante. La variante de uso más común para el análisis de mezclas de proteínas o de ácidos nucleicos utiliza como soporte un gel, habitualmente de agarosa o de poliacrilamida. Los ácidos nucleicos ya disponen de una carga eléctrica negativa, que los dirigirá al polo positivo, mientras que las proteínas se cargan al unirse con sustancias como el SDS (detergente) que incorpora cargas negativas de una manera dependiente de la masa molecular de la proteína. Al poner la mezcla de moléculas y aplicar un campo eléctrico, éstas se moverán y deberán ir pasando por la malla del gel (una red tridimensional de fibras cruzadas), por lo que las pequeñas se moverán mejor, más rápidamente. Así, las más pequeñas avanzarán más y las más grandes quedarán cerca del lugar de partida.
SDS-Page
Es una técnica para separar las proteínas de acuerdo a su movilidad electroforética (en función de la longitud de la cadena polipeptídica, masa molecular, modificaciones postraduccionales y otros factores). Gracias al SDS las proteínas se desnaturalizan, perdiendo su conformación tridimensional. De este modo se obtiene un fraccionamiento que obedece a: la diferencia de peso; la longitud de la cadena (tamaño); y la forma de la proteína. Es el método de electroforesis empleado con mayor profusión para analizar proteínas.
La disolución de proteínas que se van a analizar se mezcla en primer lugar con SDS, un detergente aniónico que desnaturaliza las proteínas, eliminando sus estructuras secundaria y terciaria (pero sin alterar los enlaces disulfuro y además confiere una carga negativa a cada proteína en proporción a su masa). Sin SDS, las distintas proteínas que tienen masas moleculares similares migran de forma diferente debido a diferencias en la proporción carga/masa, ya que cada proteína tiene un punto isoeléctrico distinto. Si la electroforesis se realiza así, sin añadir SDS, se habla de PAGE nativa. El problema se resuelve añadiendo SDS, puesto que al unirse y desplegar la proteína, le proporciona una carga negativa casi uniforme a lo largo de la longitud de la cadena polipéptidica.