High-throughput detection of banana bunchy top virus in banana plants and aphids using real-time TaqMan PCR

Vista previa del material en texto

High-throughput detection of banana bunchy top virus in banana plants and aphids using real-time TaqMan®PCR
Detección de alto rendimiento del cogollo racimoso del banano (Banana Bunchy Top Virus o BBTV) en plantas de banano y pulgones utilizando Real Time PCR con sondas Taqman
Yan chen del instituto de microbiología de la academia china de ciencias de Beijing, China
Xiaoping Hu del laboratorio estatal de biología en estrés de cultivos en zonas áridas de la universidad Northwest A&F de Yangling, China
Familia: Nanoviridae				
Género: Babuvirus				Otro género de Nanoviridae: Nanovirus
Especie: Banana Bunchy Top Virus (BBTV)
Babu viene de Banana Bunchy Top Virus
Nanoviridae tiene viriones de 17 a 20 nm. Cápside icosaédrica T1. 60 subunidades 
Casi todos los fragmentos de DNA de los nanovirus codifican una única proteína.
Lípidos: no conocidos
Carbohidratos: no conocidos
La información se encuentra distribuida en 6 a 8 (6 para BBTV) moléculas de ssDNA circular
El virus es propagado por áfidos (pulgones). Pentalonia nigrovernosa Coquerel. (Aphididae). O por propagación vegetativa (Los retoños).
Virus tipo 2: virus de ssDNA
BBTV tiene 6 segmentos de DNA circular de una sola cadena (cssDNA)
Bunchy top disease, caused by Banana Bunchy top virus (BBTV) is one of the most important constraints on banana production in several countries of Asia, Africa, and the Pacific, including Hawaii.
Es considerada la plaga más devastadora del fruto en todo el mundo y cobra mayor relevancia por tratarse del cuarto alimento más importante a nivel internacional, después del arroz, el trigo y el maíz
La enfermedad fue reportada inicialmente en Fiji en 1889 (Jackson y Wright, 2005), sin embargo, es probable que estuviera presente desde 1879; a principios de 1900 se reportó en Taiwán y en 1901 en Egipto, posteriormente apareció en Sri Lanka y en Australia en 1913, ambas infecciones fueron originadas probablemente por la importación de hijuelos infectados provenientes de Fiji. En 1940, fue introducida en la India probablemente de Sri Lanka (Dale, 1987). Actualmente, se encuentra distribuida en varios países
El rango de hospedantes de Banana bunchy top virus parece estar limitado a seis especies, de las cuales, cinco pertenecen a la familia Musaceae (Musa x paradisiaca, M. textiles, M. banksii, Ensete ventricosum, y Ensete suberbum.
Los síntomas son expresados entre 25 y 85 días de la infección inicial.
BBTV es un virus sistémico, una vez que infecta a la planta, se mueve a todas las partes de esta, incluyendo hijuelos y rizomas, sin embargo, si es infectada en edad avanzada, los hijuelos pueden escapar a la infección.
La infección por BBTV invade específicamente los tejidos del floema (el floema es el tejido vivo que transporta nutrientes orgánicos, en particular, sacarosa, un azúcar, a todas las partes de la planta donde sea necesario), causando retraso del crecimiento (Stunting), clorosis (La clorosis es el amarillamiento del tejido foliar causado por la falta de clorofila), y rayas de color verde oscuro en las venas de las hojas
Typical bunchy top symptoms include chlorosis of the leaf margins, narrowing and bunching of successive leaves, Morse code dashes, hooking along the midrib (nervio principal) of the leaves, and dark green streaking of petioles (peciolo)
 
Muchas plantas maduras infectadas se evitan que den frutos. Pero en los casos en los que la fruta es producida, las manos (racimo) y dedos (banana individual) de la banana a menudo se encuentran desfigurados y torcidos. 
Los suckers que se desarrollan de una planta madre infectada tienen un retraso del crecimiento y se quedan enanos. Sus hojas son pequeñas y no se pueden expandir. Se mantienen pegadas al pseudoestema. Estos suckers generalmente no producen fruta. 
 
BBTV belongs to the genus Babuvirus of the family Nanoviridae. The size of the isometric virion is 18–20 nm in diameter. 
BBTV is a multi-component virus which consists of at least six particles. Each particle is packed with a distinct circular single-stranded DNA (cssDNA). 
Each genomic component is approximately 1 kb in size (BBTV DNA-R, -S, -M, -C, -N and -U) (Harding et al 1993, Burns et al 1995, Vetten et al 2005).
 A single protein of 19.6 kDa associated with the virions is assumed to be the coat protein (Harding et al 1991, Burns et al 1995, Wanitchakorn et al 1997). 
BBTV-DNA R encodes a master replication initiation protein (Rep). 
The functions of DNA-U is unknown, while DNA-M, -C and -N encode the movement protein, cell-cycle link (clink) protein, and the nuclear shuttle protein, respectively (Wanitchakorn et al 2000).
Pulgón se come al virus, pasa por su tracto digestivo, a la sangre, termina en su saliva e infecta a plantas sanas. Necesita al menos 17 horas para que pueda volver a infectar.
No infecta al pulgón.
Método de extracción de DNA anterior
Optimization of DNA isolation and PCR protocol for RAPD analysis of banana / plantain (Musa spp.)
Das B. K, Jenna R.C
DNA isolation protocol
a. Freshly harvested young and tender or old leaf samples (1 g) were ground in liquid Nitrogen using a pre-chilled mortar and pestle.
b. The ground powder was quickly transferred into a clear autoclaved 50 ml centrifuge tube and then 10 ml of pre-warmed (60oC) extraction buffer was added and shaken gently to form slurry.
c. The tubes were incubated at 60oC in circulating water bath for one hour with intermittent shaking for every 10 minutes with occasional inversion and cold to normal temperature.
d. An equal volume of chloroform: isoamyl alcohol (24:1) was added and mixed properly by inverting the tubes 20-25 times to form an emulsion and centrifuged at 12000 rpm for 20 minutes at RT to separate the phases (long term mixing of samples in chloroform: isomyl alcohol approximately for 30 minutes, will help in removal of pigments and formation of brownish colour in DNA sample can be omitted).
e. The supernatant was carefully decanted and transferred to a new tube and the second chloroform: isoamyl alcohol (24:1) extraction performed for the cloudy nature of aqueous phase due to presence of PVP.
f. Again the supernatant was carefully decanted and transferred to a new tube and was precipitated with two volume of pre chilled (-20oC) 95 % ethanol and sodium acetate (final concentration 0.3 M), and gently mixed by inverting up and down (10 minutes) to produce fibrous DNA and incubated at -20oC for a minimum of one hour.
g. The samples were centrifuged at speed 10,000 rpm for 15 minutes. Pour off the supernatant and the pellet was washed twice and thrice with 70 % ethanol. Decanted the supernatant and air dried DNA pellet at RT until the whitish pellet turned to transparent and resuspended in 300 μl of TE Buffer and 6μl of RNAase (10 μg/μl) was added incubated at 37oC for two hour ( RNAase treatment helped achieving in proper genomic DNA). To this 600 μl of Ice chilled ethanol and 10 ml of 3M sodium acetate was added and incubated at -20oC for one hour to re-precipitate DNA.
h. The solution was centrifuged at 10,00 rpm for 15 minutes; DNA pellet was dried at 37oC and resuspended in 300 μl of Tris–EDTA (TE) buffer. All the centrifugation steps were carried out at RT to avoid precipitation with (CTAB, DNA degradation and to obtain good quality of DNA.
El Bromuro de hexadeciltrimetilamonio o Bromuro de cetiltrimetilamonio ((C16H33)N(CH3)3Br) es una sal de amonio cuaternario, uno de cuyos grupos alquilo es de gran longitud, con actividad detergente. Se le conoce también por las siglas CTAB, del inglés Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide.
Es un surfactante catiónico. Sus usos incluyen la utilización como solución tamponante para la extracción de ADN.
El CTAB es un detergente catiónico que tiene la propiedad de precipitar ácidos nucléicos y polisacáridos ácidos en soluciones de baja concentración iónica. Bajo estas condiciones las proteínas y los polisacáridos neutros permanecen en solución.
Método del paper para extraer DNA
PCR2.3.1. High-throughput extraction of BBTV ssDNA from bananaplants
Approximately2 mm2 sections of leaf lamina near the midribof banana leaves was removed by cutting with a sharp disposable blade, which were then transferred into the wells of a 96-wellplate. 
Approximately 50 ul of freshly prepared extraction buffer I (100 mM NaOH; 2% Tween®20) was added, and the plate was incubated for 10 min at 95◦C. 
An equivalent volume of buffer II (100 mM Tris–HCl; 2 mM EDTA; pH 2.0) was then added and the sample was mixed. 
One microliter of the supernatant was used as template in the TaqMan®PCR amplifications.
Extracción mejorada, en 2 pasos, más eficiente, menos posibilidad de contaminaciones .
NaOH: medio alcalino. Disrupts the hydrogen bonding between the DNA bases, converting the double-stranded DNA (dsDNA) in the cell, including the genomic DNA (gDNA) and your plasmid, to single stranded DNA (ssDNA).
Tween 20 (polisorbato 20 o monolaurato de polioxietilen(20)sorbitano): es un tensoactivo tipo polisorbato usado como detergente y emulsionante 
Tris-HCl: Tris es el nombre abreviado del compuesto orgánico conocido como tris(hidroximetil)aminometano, de fórmula (HOCH2)3CNH2. Se utiliza para preparar disoluciones tampón.
EDTA: agente quelante
Métodos actuales de detección
ELISA (Enzyme Linked Inmuno Sorbent Assay) 
ELISA is a plate-based assay technique designed for detecting and quantifying soluble substances such as peptides,proteins, antibodies, and hormones. Other names, such as enzyme immunoassay (EIA), are also used to describe the same technology. 
In an ELISA, theantigen (target macromolecule) is immobilized on a solid surface (microplate) and then complexed with an antibody that is linked to a reporter enzyme.Detection is accomplished by measuring the activity of the reporter enzyme via incubation with the appropriate substrate to produce a measurable product. 
The most crucial element of an ELISA is a highly specific antibody-antigen interaction.
Although many variants of ELISA have been developed and used in different situations, they all depend on the same basic elements:
1. Coating/capture –direct or indirect immobilization of antigens to the surface of polystyrene microplate wells.
2. Plate blocking –addition of irrelevant protein or other molecule to cover all unsaturated surface-binding sites of the microplate wells.
3. Probing/detection –incubation with antigen-specific antibodies that affinity-bind to the antigens.
4. Signal measurement –detection of the signal generated via the direct or secondary tag on the specific antibody.
Tipos de ELISA
PTA (Plate Trapped Antibody) ELISA
ATA (Antibody trapped Antibody) ELISA
DAS (Double Antibody Sandwich) ELISA
	
Plate coating is achieved through passive adsorption of the protein to the plastic of the assay microplate. This process occurs though hydrophobicinteractions between the plastic and non-polar protein residues. 
Although individual proteins may require specific conditions or pretreatment for optimalbinding, the most common method for coating plates involves adding a 2–10 μg/ml solution of protein dissolved in an alkaline buffer such as phosphate-buffered saline (pH 7.4) or carbonate-bicarbonate buffer (pH 9.4). 
The plate is left to incubate for several hours to overnight at 4–37° C. Typically, afterremoving the coating solution, blocking buffer is added to ensure that all remaining available binding surfaces of the plastic well are covered
It is important to note that optimal coating conditions and plate binding capacity can vary with each protein/antibody and must be determined experimentally.
Some proteins, especially antibodies, are best coated on plates at a concentration lower than the maximum binding capacity in order to prevent nonspecific binding in later steps by a phenomenon called "hooking". 
Hooking results from proteins getting trapped between the coating proteins, which prevents effective washing and removal of unbound proteins. When hooking nonspecifically traps detection of primary and secondary antibodies, high background signal results, thus lowering the signal to noise ratio and sensitivity of an assay.
Production of Monoclonal Antibodies Againts Banana Bunchy Top Virus and Their Use in ELISA (Wu and Sue 1991)
Un hibridoma es una línea celular híbrida obtenida mediante la fusión de un linfocito B productor del anticuerpo específico de interés, con una línea celular de mieloma (linfocito B canceroso) que no produce una inmunoglobulina propia.
Mieloma múltiple. Las células de mieloma múltiple son células plasmáticas anormales (un tipo de glóbulo blanco) que se acumulan en la médula ósea y forman tumores en muchos huesos del cuerpo.
HAT Medium (hypoxanthine-aminopterin-thymidine medium) is a selection medium for mammalian cell culture, which relies on the combination of aminopterin, a drug that acts as a powerful folate metabolism inhibitor by inhibiting dihydrofolate reductase, with hypoxanthine (a purine derivative) and thymidine (a deoxynucleoside) which are intermediates in DNA synthesis. 
The trick is that aminopterin blocks DNA de novo synthesis, which is absolutely required for cell division to proceed, but hypoxanthine and thymidine provide cells with the raw material to evade the blockage (the "salvage pathway"), provided that they have the right enzymes, which means having functioning copies of the genes that encode them.
Aislamiento del virus
Virus recolectado de plantaciones de banana en el sur de Taiwán por protocolo de Wu y Sue, que incluía pulverización del tejido infectado con nitrógeno líquido, clarificación del extracto con cloroformo – butanol, concentración del virus por ciclos de centrifugación diferencial, stirring (Turbulento – Mezcla) e incubación a 4°C, seguida de un segundo ciclo de centrifugación diferencial y centrifugación en un gradiente de densidad de sacarosa.
Producción de anticuerpos
Dos inyecciones intraperitoneales con 2 semanas de separación entre cada una y conteniendo 15-26 ug de BBTV in 0.15 ml de solución salina mezclada con el mismo volumen de Freund adjuvant se les pusieron a ratones de 6-8 semanas. 
Freund's adjuvant is a solution of antigen emulsified in mineral oil and used as an immunopotentiator (booster). The complete form, Freund's Complete Adjuvant (FCA or CFA) is composed of inactivated and dried mycobacteria (usually M. tuberculosis), whereas the incomplete form (FIA or IFA) lacks the mycobacterial components (hence just the water in oil emulsion). It is named after Jules T. Freund.
CFA is a suspension of dessicated mycobacterium in paraffin oil and mannide monooleate that induces inflammation, tissue necrosis, and ulceration.
Una semana después de la segunda inyección, a los ratones se les puso una inyección final de la misma cantidad de virus purificado sin el adjuvant en la vena de la cola. 
La vena de la cola o vena caudal es la vena más grande en la cola de los animales vertebrados.
Tres días después los mataron y se removió su bazo por fusión celular aséptica.
 
Sodium diethyldithiocarbamate is the organosulfur compound with the formula NaS2CN(C2H5)2. It is a pale yellow, water soluble salt
El tampón fosfato salino o buffer fosfato salino (conocido también por sus siglas en inglés, PBS, de phosphate buffered saline) es una solución tampón empleada en la investigación biológica, bioquímica y de inmunología diagnóstica. Es una solución acuosa y salina que contiene cloruro sódico, fosfato sódico, cloruro de potasio y fosfato de potasio.
DAS - ELISA del paper con Kit marca Agdia (Double Antibody ELISA)
Microtiter plate – Placa microtituladora
Preparar el anticuerpo de captura: el capture antibody se diluye en buffer de revestimiento de carbonato 1X, se mezclan y se ponen en cada espacio de la placa. Se incuba en una cámara húmeda 4 horas a temperatura ambiente (18-30°C) o toda la noche (2-8°).
Preparación del control positivo y negativo: se usa buffer general de extracción (GEB2) para hidratar controles frescos
Preparación de la muestra y carga de placas: El extractode la planta se diluye en buffer de extracción GEB 1x.
La placa se enjuaga 3 veces con PBST 1X (Buffer salino de fosfatos con Tween 20 o Triton X-100) y se seca por encima con toalla de papel absorbente.
Agregamos 100 uL de las muestras y controles diluidos en buffer.
Incubamos por 2 horas a temperatura ambiente o por toda la noche.
Preparación de la solución de detección: Se mezcla el anticuerpo de detección con el conjugado de enzima (Botellas A y B) y se diluyen en buffer ECI 1X. 
Hacemos 8 limpiezas con buffer PBST y limpiamos con papel absorbente. 
Agregamos 100 uL de la solución de detección a cada placa.
Incubamos en caja húmeda por 2 horas a t. ambiente.
Preparación del sustrato: agregamos 1 tableta de sustrato PNP por cada 5 mililitros de buffer de sustrato PNP.
Enjuagamos 8 veces con buffer PBST 1x y secamos. 
Agregamos 100 uL de PNP a cada celda.
Incubamos protegiendo de la luz por una hora a T ambiente.
Resultados: leer absorbancia a 405 nanómetros en un espectrofotómetro
Composición de buffers:
Carbonate Coating Buffer: Carbonato de sodio, bicarbonato de sodio y azida de sodio. pH 9.4
ELISA Carbonate Coating Buffer is intended for use as a plate coating buffer for Invitrogen Antibody Pairs or when developing a sandwich ELISA. The buffer is a 50 mM carbonate buffer.
Composición GEB (General Extraction Buffer): sulfito de sodio, polivinilpirrolidona (PVP), azida de sodio, albúmina de huevo de gallina grado 2, Tween 20. pH 7.4.
PBST: Cloruro de sodio, fosfato de sodio dibásico, fosfato de sodio monobásico, clorudo de potasio, Tween 20. pH 7.4.
PBS stands for phosphate buffered saline. Adding of the detergent Tween 20 or Triton X-100 makes it PBST (people use the name PBST/PBS-T for both).
ECI: BSA (Bovine serum albumin – Albumina de suero bovino), PVP (polivinilpirrolidona). pH 7.4
PNP substrate buffer: hexahidrato de cloruro de magnesio, azida de sodio, dietanolamida. pH 9.8.
Reacción de color
Fosfatasa alcalina
La fosfatasa alcalina (EC 3.1.3.1, CAS n.º 9001-78-9 ) (50.000 - 60.000 Da) es una enzima hidrolasa responsable de eliminar grupos de fosfatos de varios tipos de moléculas como nucleótidos, proteínas y otros compuestos fosforilados.
Para-NitroFenilFosfato
para-Nitrophenylphosphate (pNPP) is a non-proteinaceous chromogenic substrate for alkaline and acid phosphatases used in ELISA and conventional spectrophotometric assays.
Phosphatases catalyze the hydrolysis of pNPP liberating inorganic phosphate and the conjugate base of para-nitrophenol (pNP). The resulting phenolate is yellow, with a maximal absorption at 405 nm.
This property can be used to determine the activity of various phosphatases including alkaline phosphatase (AP) and protein tyrosine phosphatase (PTP).
PCR tradicional
Molecular cloning, sequence analysis and detection of banana bunchy top virus in Hawaii.
W.S Xie and J. S. Hu. 1994
Ellos secuenciaron algunos de los componentes del virus. Compararon el genoma del virus encontrado en Hawaii con uno encontrado en Australia. Crearon primers para detectarlo por PCR y compararon el nivel de detección con el método de ELISA de Wu y Sue y con Dot Blot siendo el primero 1000 veces más sensible que los siguientes.
Primer 5: 5’ GGCGAATTCTATAAATAGACCTCCC 3’	
Primer 7: 5’ CCGGAGCGTGCGCTGTAAA 3’
Componente 1 DNA- R – Proteína de iniciación de la replicación (rep)
Dot Blot es una técnica de biología molecular para detectar biomoléculas. Representa una simplificación de los métodos Northern blot, Southern blot o Western blot. 
En un dot blot las biomoléculas para ser detectados no son separadas por cromatografía. En cambio, una gota que contiene la molécula para ser detectada se aplica directamente sobre una membrana. 
Esto es seguido por la detección por sondas de nucleótidos (northern blot y southern blot) o anticuerpos (para un western blot).
La técnica ofrece importantes ahorros en tiempo. Sin embargo, no ofrece información sobre el tamaño de la biomolécula blanco. Además, si dos moléculas de diferentes tamaños son detectadas, se seguirá viendo como un solo punto. Por lo tanto el dot blot sólo puede confirmar la presencia o ausencia de una biomolécula o biomoléculas que pueden ser detectados por las sondas de ADN o el anticuerpo. 
Antecedente de Real Time PCR con SYBR Green en BBTV
Unusual Events Involved in Banana bunchy top virus Strain Evolution
H. C. Fu, et al (2009)
The genome of BBTV consists of six integral components originally named DNA 1 to 6 and recently renamed DNA-R, -U3, -S, -M, -C, and -N, respectively, according to their putative functions (16,63). The integral components were found in all isolates collected around the world (28). Each BBTV-associated component is ≈1.1 kb, and the transcripts have been mapped (2,3, 8,16). 
DNA-R encodes a replication initiation protein (Rep) (20), which later was shown to support the replication of other non- Rep-encoding components (23). The open reading frame (ORF) of DNA-U3 is not consistently present among characterized isolates, and the function of DNA-U3 in BBTV infection is currently unknown. DNA-S encodes a capsid protein (65), DNA-M and DNA-N encode possible movement proteins (64), and DNA-C encodes a protein that can bind retinoblastoma and may be involved in host-cell-cycle manipulation (1,63,64). 
Of interest, in addition to the integral genome components, some viruses within the family Nanoviridae contain several additional components (4,5,7,16,23,24,29,48,53,66,67). The ORFs of these components encode proteins with similarity to replication initiation factors and are known as “additional Reps.”
The existence of additional Reps may suggest opportunities for nanovirus evolution (60); however, solid data is needed to support this speculation.
All BBTV integral components and associated additional Reps contain a stem-loop (SL) structure with a conserved sequence, TA(G/T)TATTAC, in the loop region.
Según artículo principal: este método no es específico para la secuencia diana y es más difícil de repetir que PCR con sonda TaqMan.
Antecedentes de PCR con sonda TaqMan en otros virus de plantas
PCRs del paper
PCR TaqMan áfidos (pulgones)
Muestras de:
DNA de áfidos (pulgones) completos
DNA de la hemolinfa del pulgón
Se denomina hemolinfa al líquido circulatorio del celoma o hemocele de ciertos invertebrados como los artrópodos y moluscos, análogo a la sangre de los vertebrados. los cefalópodos que poseen un sistema circulatorio cerrado carecen de hemolinfa.
DNA del honeydrew (ligamaza – rocío de miel – mielada – mielato) del pulgón
La ligamaza, rocío de miel, mielada, mielato o melado, es una sustancia viscosa rica en carbohidratos que aumenta de viscosidad y adherencia al evaporarse el agua y concentrarse los azúcares disueltos, volviéndose más pegajosa.
Algunas hormigas también recolectan u «ordeñan» el rocío de miel directamente de los áfidos, estableciendo un mutualismo, ya que las hormigas ahuyentan a los predadores como las mariquitas llegando a alcanzar relaciones interespecíficas de gran complejidad.
PCR TaqMan plantas (A)
Tubo de reacción
· Taq polimerasa Immomix
· MgCl2 : cofactor
· Primers F1 y R1
· Sonda T1
· PVP 40: polivinilpirrolidona (40, peso), elimina compuestos fenólicos
· BSA, albumina suero bovino: captura impurezas
· Ácidos Nucleicos
Primers F1 (5’ ACCAGCCGACTACATGTCTG) y R1 (5’ TCCTCAACACGGTTGTCTTC).
40 ciclos. 95° 15s, 58° 30s y 72° 30s.
Sonda TaqMan T1 (5’ ACATTCAACATCTGATGTCCCTGTTGC)
5’ 6-Carboxyfluorescein (6-FAM)
3’ tetra-methylcarboxyrhodamine (TAMRA)
1, 2, 3 Planta infectada ( Estema, Petiola y Hojas)
4, 5, 6 Planta sana (Estema, Petiola y Hojas)
7 Agua
PCR convencional plantas (B)
Llevada a cabo con el procedimiento de Xie y Hu. 
Primers F1 (5’ ACCAGCCGACTACATGTCTG) y R1 (5’ TCCTCAACACGGTTGTCTTC).
Were designed to amplify a155-base pair (bp) fragment of the coat protein gene region of BBTV component S (GenBank Accession Number: AY534140), which is highly conserved among BBTV isolates. 
50 ciclos. 90°,58° y 72°
M Marker
1 Sin DNA (Agua probablemente)
2, 3, 4 Plantas sanas (Estema, petiola,, hojas)
5, 6, 7 Plantas infectadas (Estema, petiola,, hojas)
Electroforesis en gel de agarosa 1% y tinción con bromuro de etidio.
Compararon ambas.
RFU: Relative Fluorescense Units (Unidades de fluorescencia relativa)
La sonda TaqMan está formada por un fluoróforo unido covalentemente al extremo 5 'de un oligonucleótido, y un desactivador de fluorescencia (quencher) en el extremo 3'
El quencher inhibe la fluorescencia del fluoróforo cuando es excitado por la fuente de luz del termociclador.1​ De esta forma, mientras que el fluoróforo y el quencher estén próximos el uno al otro, no habrá señal fluorescente, puesto que el quencher está ejerciendo su actividad inhibidora.
En el extremo 5’ tiene 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) is a fluorescent dye with an absorption wavelength of 495 nm and an emission wavelength of 517 nm
En el extremo 3’ pusieron el quencher tetra-methylcarboxyrhodamine (TAMRA) 
Cuantificación de virus 
PCR TaqMan plantas: DNA viral extraído de hojas infectadas y con diferentes diluciones
Y = mx + b 
Ct = m(log quantity) + b
Quantity = 10 ((Ct – b) / m)
PCR TaqMan plásmido BBTV3- pGEMT: como housekeeping, extraído de bacterias E. coli transformadas
The component S (1075 bp ssDNA) of BBTV was cloned into the vector pGEM-T Easy (Promega) and used in the construction of plasmid BBTV3-pGEMT, which was then transferred to Escherichia coli (DH5a).
BBTV3-pGEMT was extracted from thetransformant and serial dilutions were performed. When 1 ul ofthe diluted samples were used in the TaqMan®PCR assays, a linea rrelationship was observed.
This molecular assay could be used as a standard curve to accurately quantify BBTV in samples containing as low as 2.76 copies of viral genomic DNA. 
DH5-Alpha Cells are E. coli cells engineered by American biologist Douglas Hanahan to maximize transformation efficiency. They are defined by three mutations[1] recA1, endA1 which help plasmid insertion and lacZΔM15 which enable blue white screening. 
The cells are competent and often used with calcium chloride transformation to insert the desired plasmid. A study of four transformation methods and six bacteria strains showed that the most efficient one was the DH5 strain with the Hanahan method
LacZ codifica B- galactosidasa, esta enzima degrada X-gal (BCIG – 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-d-galactopiranosidasa) dando un producto azul. Si la transformación se lleva a cabo se interfiere el gen lac, no hay galactosidasa y las colonias crecen blancas.