PRACTICA N 7 - Metabolismo de Lipidos

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PRACTICA No 7
METABOLISMO DE LÍPIDOS: HÍGADO GRASO EXPERIMENTAL
RELACIÓN DE EXPERIMENTOS 
1. Producción de un hígado graso en rata
2. Determinación de ácidos grasos en el hígado de una:
· Rata control
· Rata a la cual se ha administrado Etionina
· Rata a la cual se ha administrado Etionina + Metionina
INTRODUCCIÓN 
El rol que cumple el hígado en el metabolismo lipídico es sumamente importante. En este sentido podemos decir que los siguientes procesos se realizan en la:
· Oxidación de los ácidos grasos
· Síntesis de ácidos grasos y colesterol
· Síntesis de lipoproteínas plasmáticas :Lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL); lipoproteínas de alta densidad (HDL)
· Síntesis de ácidos biliares
· Se encarga casi exclusivamente de la síntesis de cuerpos cetónicos 
En ocasiones puede ocurrir alteraciones de estos procesos en el hígado, lo que determina un anormal aumento en su contenido graso, esta situación se denomina hígado graso o esteatosis hepática. Esta entidad merece una especial atención del médico ya que resulta ser con frecuencia el antesala de la cirrosis hepática. 
Desde un punto de vista general podemos considerar hasta cuatro situaciones importantes que pueden ocasionar hígado graso. 
· Aumento en la cantidad de ácidos grasos que llegan al hígado; sea procedentes de la alimentación o de otros tejidos
· Menor oxidación de los ácidos grasos en el hígado 
· Mayor síntesis de ácidos grasos en el hígado
· Disminución en la salida lipídica del hígado generalmente debido a un defecto en la síntesis de lipoproteínas plasmáticas.
METIONINA
ATP Metionina Adenosil Transferasa
PPi + Pi
ATP
METIONIL - AMP
ATP
PPi
Metionil-tRNA Sinteasa
Met-tRNA
S-Adenosilmetionina
Síntesis Proteica
S-adenosilhomocisteina
LIPOPROTEINAS
Fosfatidil 
colina
Fosfatidil
etanolamina
 
tRNA
AMP
Estrógeno
ETIONINA
ATP Metionina Adenosil Transferasa
PPi + Pi
ATP
ETIONIL - AMP
ATP
PPi
Metionil-tRNA Sinteasa
S-Adenosiletionina
Síntesis Proteica
S-adenosilhomocisteina
LIPOPROTEINAS
Fosfatidil 
etilcolina
Fosfatidil
etanolamina
 
tRNA
Estrógeno
Arriba: Mecanismo por el cual la metionina participa en la síntesis de lipoproteinas. 
Abajo: Como la etionina afecta la síntesis de lipoproteinas.
FIGURA Nº 7.. Rol de la Metionina y efecto de Etionina sobre el metabolismo 
 lipídico
 
Nota: Las líneas discontinuas indican que el evento no se está realizando.
Experimentalmente se puede inducir el hígado graso mediante la administración de diversos agentes, como el tetracloruro de carbono, puromicina, ácido orótico, etionina, etc. En esta práctica estudiaremos el hígado graso inducido por la etionina, tomando como parámetro el contenido de ácidos grasos del hígado, ya que a pesar que el hígado graso puede ser inducido de diversas formas, es común denominador el aumento de triglicéridos
Etionina es un compuesto estructuralmente relacionado al aminoácido esencial metionina y por lo tanto tiene un comportamiento de antagonista competitivo, en la síntesis de proteínas y de fosfatidilcolina, de esta manera bloquea la síntesis de lipoproteínas y finalmente la salida de lípidos del hígado.
 COOH COOH
 
 CH – CH2 – CH2 – S – CH3 CH – CH2 – CH2 – S – CH2 – CH3 
 NH2 NH2
 Metionina Etionina
Objetivos: 
 1.- Conocer el mecanismo bioquímico por el cual etionina induce esteatosis hepática
 2.- Conocer el fundamento de la determinación de los ácidos grasos en el hígado
 3.- Estudiar el efecto de la metionina sobre el hígado graso producido por metionina
 4.- Indicar algunas alternativas de tratamiento en pacientes que sufren esteatosis 
 hepática
Metodología. 
El día anterior a la práctica se inyecta vía intraperitoneal a un lote de tres ratas hembras, las siguientes soluciones: 
1. Rata control: Solución salina isotónica 3 ml. Inyectar la misma cantidad a las 2:30, 5 horas y 7 horas después de la primera inyección.
2. Rata tratada con Etionina: Se inyectará intraperitonealmente 3 ml de una solución de DL-Etionina (16,7 mg/ml). Inyectar la misma cantidad a las 2,5 horas; 5 horas y 7 horas después de la primera inyección.
3. Rata tratada con Etionina + Metionina: Recibe el mismo tratamiento que la rata con etionina, pero además se le inyecta 3 ml de L-metionina ( 20 mg/ml ) una hora antes de la primera inyección de etionina y una hora después de cada inyección de etionina. 
En este experimento se usarán ratas hembras, debido a que el incremento de grasa hepática es mucho más pronunciada en hembras que en machos.
DETERMINACIÓN DE LOS ÁCIDOS GRASOS 
- Transcurridas 24 horas de iniciado el tratamiento de los animales se les sacrifica y se les retira rápidamente del hígado un trozo de 2,5 g, el que se fragmenta con la ayuda de tijeras y se deposita en un Erlenmeyer de 250 ml.
- Se le añade luego 10 ml de hidróxido de potasio al 33% y 40 ml de etanol al 96% con alcohol isoamílico al 0,4%.
- Se calienta la preparación en baño maría hirviente durante 20 minutos, teniendo cuidado que no se proyecte el contenido.
- Añadir 17 ml de HCl al 25%, mezclar y dejar en reposo algunos minutos
- Añadir luego con pipeta volumétrica 25 ml de éter de petróleo.
- Tapar cuidadosamente el recipiente y agitar fuertemente durante un minuto. Dejar en reposo por 10 minutos para conseguir una adecuada separación de las fases éter de petróleo y etanol-ácido. Para esta última etapa se puede utilizar una probeta en lugar del Erlenmeyer, con la ventaja de mirar mejor la separación de las dos fases.
- Retirar 5 ml de la capa etérea (superior), y colocarlos en un Erlenmeyer y añadir 1 ml de solución de etanol-alcohol isoamílico y dos gotas de azul de timol.
- Finalmente titular con NaOH 0.1 N hasta obtener un color azul verdoso que debe permanecer estable por lo menos 3 minutos.
Para efecto de los cálculos asuma que el PM promedio de los ácidos grasos que se están titulando es de 284
Complete la siguiente tabla:
Tabla 1. (Valentina)
	
	Características del hígado
	
	Peso total
	Color
	Consistencia
	Rata control
	6.8
	rojo- granate
	un hígado normal 
	Rata con etionina
	7.3
	amarillo
	un hígado en mal estado por el color que se observa
	Rata con Etionina + Metionina
	7.2
	rojo-naranja
	hígado semi dañado
Anote el contenido de ácidos grasos en miliequivalentes en el volumen de titulación y en miligramos por gramo de tejido hepático húmedo. 
Tabla 2. (Paola)
	
	Contenido de ácidos grasos
	
	NaOH 0,1 N
ml gastados
	mEq / 5 ml
	mEq / 25 ml
	mg de A.G. por gramo
de hígado
	Rata Control
	1.3
	0.13
	0.65
	73.84
	Rata con etionina (E)
	3.6
	0.36
	1.8
	204.48
	Rata con E + Metionina
	2.0
	0.2
	1
	113.6
Cálculos: (Paola)
1. Rata Control
· mEq / 5 ml
· mEq / 25 ml
· mg de A.G. por gramo de hígado
2. Rata con Etionina (E)
· mEq / 5 ml
· mEq / 25 ml
· mg de A.G. por gramo de hígado
3. Rata con E + Metionina
· mEq / 5 ml
· mEq / 25 ml
· mg de A.G. por gramo de hígado
INTERROGANTES
1. Haga una interpretación adecuada de los esquemas mostrados
Interpretación de la Tabla 1 (Valentina)
Para la primera tabla , se puede obtener las diferentes características de los tipos de ratas , en la rata de control o de muestra el peso es de 6.8 , de color es rojo, este higado es un higado que se encuentra en un buen estado, en cambio en la segunda rata que contiene etionina el peso es 7,3 es mas grande , presenta un color amarillo ,y esto nos indica que este tejido esta en las estado por el exceso de grasa, en la tercera rata que tiene etionina mas mateionia su peso es de 7.2 , de color rojo naranja, este higado tiene la consistencia que esta semi dañano.
Interpretación de la Tabla 2 (Vyctoria)
Según los resultadosde la tabla 2, se puede identificar que entre las tres ratitas la que estaba inyectada con etionina fue la que más contenido de ácido graso presentó por gramo de hígado (204, 48 mg/g), lo que indica que había una mayor acumulación de grasa en el hígado a comparación de las otras dos y, por lo tanto, se puede decir que el animalito estaría en riesgo de una esteatosis hepática. Como se sabe, la etionina es un competidor metabólico de la metionina, por lo que interviene en las vías metabólicas en las que participa afectando la formación de las lipoproteínas, y como consecuencia, produciendo una acumulación de lípidos en exceso. (1)
Por otro lado, la ratita control es la que mostró el menor valor de miligramos de ácido graso por gramo de hígado (73, 84 mg/g) ya que no estaba inyectada con algún tipo de inhibidor o sustrato que afectará la vía metabólica de los ácidos grasos, y por lo tanto el hígado pudo llevar a cabo su trabajo de manera normal. 
Por último, y como valor intermedio, la ratita inyectada con etionina y metionina presentó un valor de 113, 6 mg de ácido graso por gramo de hígado, y, a pesar de no tener una acumulación tan significativa como en la segunda ratita, tampoco poseía un valor mínimo como en la rata control. Esto se debe a que la metionina inyectada controlaba de cierta manera el efecto de la etionina, llegando a veces a la síntesis proteica y otras veces fallando, lo que muestra el efecto competitivo de ambos. 
2. ¿Por qué la deficiencia de ácido pantoténico puede determinar hígado graso? (Grecia)
El ácido pantoténico (vitamina B5) es una vitamina esencial para la degradación y asimilación de grasas, proteínas y carbohidratos para la vida. Sabiendo esto cuando no hay o hay deficiencia de este puede provocar más enfermedades además del hígado graso, porque no es posible degradarlo lo que consecuentemente lleva a su acumulacion en el órgano que lo degrada el cual es el hígado, por eso su deficiencia termina en hígado graso no alcohólico. (2)
3. ¿Qué conocimientos tiene en relación al hígado graso inducido por etanol? (Daniela)
Un hígado graso inducido por etanol (hepatotoxicidad) ligada por su metabolismo mediante las vías de la alcohol deshidrogenasa y del citocromo P450 y la producción de acetaldehído tóxico. El metabolismo del etanol mediado por alcohol deshidrogenasa genera la forma reducida de nicotinamida adenina dinucleótido (NADH), que va a promover la esteatosis al estimular la síntesis de ácidos grasos y oponerse a su oxidación. La esteatosis también es promovida por el exceso de lípidos en la dieta y puede atenuarse mediante su reemplazo con triglicéridos de cadena media. A través de la reducción del piruvato, el NADH elevado también aumenta el lactato, que estimula la síntesis de colágeno en los miofibroblastos. Además, la actividad de CYP2E1 es inducible por sus sustratos, no solo el etanol sino también los ácidos grasos. Su exceso y metabolismo por esta vía van a generar la liberación de radicales libres, que van a provocar estrés oxidativo, y peroxidación de lípidos además de daño de la membrana no hay que olvidarnos de las alteraciones de enzimas.
Referencias
1. Ferrano S, López Ortega A. Actividad antioxidante de la melatonina sobre el hígado graso inducido por etionina en ratones. Archivos de medicina veterinaria [Internet]. 2008 [cited 14 October 2021];40(1). Available from: https://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0301-732X2008000100007
2. Licata M. Ácido pantotenico [Internet]. www.zonadiet.com. 2020 [citado 14 octubre de 2021]. Disponible en: https://www.zonadiet.com/nutricion/pantotenico.htm
3. Lieber, C. S. (2004). Alcoholic fatty liver: its pathogenesis and mechanism of progression to inflammation and fibrosis. Alcohol, 34(1), 9–19. https://doi.org/10.1016/j.alcohol.2004.07.008 
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