PRACTICA N6 - Glucogeno Hepatico

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UNIVERSIDAD CATÓLICA SANTA MARÍA
FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS, BIOQUÍMICAS Y BIOTECNOLÓGICAS
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA BIOTECNOLÓGICA
CURSO: BIOQUÍMICA APLICADA
DOCENTE: JULITZA LINDSEY PAREDES FUENTES
GRUPO: 1 - “C”
PRESENTADO POR:
GONZALES LOAIZA GRECIA SHIRLEY
HUALPA RODRIGUEZ PAOLA FABIOLA
MARTINEZ CANDIA VYCTORIA LUZ
MOROCCO BASTIDAS VALENTINA FABIANA
PINTO AMESQUITA DANIELA ALEJANDRA 
 AREQUIPA-2021
PRACTICA N° 6
GLUCOGENO HEPATICO
RELACIÓN DE EXPERIMENTOS
1. Determinación de glucógeno hepático en animal alimentado
2. Determinación de glucógeno hepático en animal en ayunas
3. Determinación de glucógeno hepático en animal tratado con adrenalina 
4. Determinación de glucógeno hepático en animal tratado con aloxano
INTRODUCCIÓN
El glucógeno es una forma de almacenamiento de glucosa fácilmente movilizable. Al igual que la amilopectina del almidón, es un polisacárido ramificado, constituido por unidades de D-glucosa unidas mediante enlaces alfa (1-4) , y ramificaciones ligadas por enlaces alfa (1-6). Las ramificaciones están separadas unas de otras por lo menos cuatro residuos en las porciones más centrales de la molécula haciéndola más compacta.
El glucógeno, polisacárido de reserva, se encuentra en los tejidos animales, pero abunda especialmente en el hígado y en el músculo. Aparece en las células como partículas discretas, las cuales evidentemente son agregados de moléculas con un peso molecular que varía alrededor de 2 X 107. La cantidad de glucógeno varía ampliamente, no solamente entre diferentes tejidos, sino también dentro de un mismo tejido, dependiendo del suministro de glucosa y de la demanda metabólica de energía. El hígado y el músculo contienen los más grandes depósitos de glucógeno, por lo que nosotros nos ocuparemos de su metabolismo en estos órganos.
En general la dieta afectará más el contenido de glucógeno del hígado que el del músculo, mientras que el ejercicio físico afectará más el contenido de glucógeno muscular que el del hígado. Además los depósitos de glucógeno hepático y muscular tendrán diferentes roles. El glucógeno muscular está presente para servir como una reserva de combustible para la síntesis de ATP dentro del músculo, mientras que el glucógeno hepático funcionará como una reserva de glucosa para el mantenimiento de la concentración de glucosa en sangre (glicemia). 
Un valor típico para el contenido de glucógeno hepático en una persona bien alimentada es alrededor de 6,5g/100g de tejido; hay mucho menos después del ayuno y mucho más después de una dieta rica en carbohidratos. El músculo esquelético típicamente tiene 1,4g/100g de tejido, el cual no cambia mucho después del ayuno nocturno o con una dieta rica en carbohidratos.
El glucógeno hepático puede formarse a expensas de glucosa y otros monosacáridos (glucogénesis), como también de residuos provenientes del metabolismo intermediario de los hidratos de carbono, proteínas y lípidos (gluconeogénesis). Las vías de síntesis de glucógeno (glucogénesis) y de degradación hasta glucosa (glucogenolisis), son independientes, lo que determina que los mecanismos regulatorios del metabolismo del glucógeno actúen independientemente.
El glucógeno sinteasa y el glucógeno fosforilasa son las enzimas regulatorias de síntesis y degradación de glucógeno respectivamente. Ellas son reguladas recíprocamente; cuando una es estimulada, la otra es inhibida, nunca están completamente activas simultáneamente.
 Síntesis de glucógeno favorecida
GLUCOGENO SINTEASA A ACTIVA
GLUCOGENO FOSFORILASA B INACTIVA 
GLUCOGENO FOSFORILASA A ACTIVA
ATP
ADP
H2O
Pi
OH
OH
O - P 
GLUCOGENO SINTEASA B INACTIVA
O - P 
 
 
 
 
 Degradación de glucógeno favorecida
 
Regulación recíproca de la glucógeno sinteasa y la glucógeno fosforilasa por fosforilación y desfosforilación. Los grupos seril fosforilados se muestran como -O-P
OBJETIVOS:
1. Realizar la determinación de glucógeno hepático
2. Cuantificar los niveles de glucógeno hepático en diferentes estados nutricionales y hormonales:
· Animal alimentado normalmente (ad libitum)
· Animal en ayunas
· Animal tratado con adrenalina
· Animal Diabético (tratado con aloxano)
PROCEDIMIENTO:
1. PREPARACIÓN DE LOS ANIMALES EXPERIMENTALES 
a) Rata A: Que recibirá su alimentación habitual sin restricción alguna.
b) Rata B: Que permanecerá en ayunas por lo menos 24 horas antes del experimento.
c) Rata C: Estando el animal bien alimentado, pesarlo y proceder a inyectarle 0,025 mg de adrenalina por cada 100 g de peso, con dos horas de anticipación a la práctica. Utilizar una solución de adrenalina que contenga 0,25 mg / ml. 
d) Rata D: 24 horas antes del experimento se inyectará por vía subcutánea una solución de aloxano ( 50 mg / ml ) a razón de 200 mg / Kg de peso. 
2. EXTRACCIÓN DEL GLUCÓGENO
Método: Método de krisman
Fundamento:
Se trata un trozo de tejido hepático con una base fuerte (KOH) en caliente, siendo degradadas las proteínas y otros constituyentes; quedando preservado el glucógeno, el cual es precipitado con etanol y se le hace reaccionar con el yodo para hacer su determinación colorimétrica. Se aumenta la sensibilidad de esta reacción con la presencia del cloruro de calcio.
 Reactivos: 
1. Solución iodo-iodurada: Pesar 0,26 g de yodo y 2,6 g de yoduro de potasio. Disolver en 10 ml de agua destilada
2. Cloruro de calcio saturado a temperatura ambiente. Pesar 97,7 g de cloruro de calcio, disolver en 100 ml de agua. Filtrar antes de usar
3. Reactivo de yodo: Mezclar 130 ml de la solución de cloruro de calcio con 0,5 ml de la solución iodo-iodurada. Guardar en frasco oscuro a 0 °C, durante siete días máximo.
 
 Procedimiento:
1. En un tubo de centrífuga medir 0,9 ml de KOH al 33 % y colocarlo en un baño maría hirviente
2. Sacrificar los animales por decapitación y tan rápido como sea posible extraer el hígado y pesar 100 mg de él. Colocar inmediatamente el trozo de hígado en la solución de KOH que se encuentra en el baño hirviente y dejarlo allí por 20 minutos, agitando de vez en cuando para permitir la disgregación del tejido. 
3. Retirar el tubo del baño y enfriar. Añadir 1,3 ml de etanol al 96% mezclar y calentar la solución hasta la ebullición teniendo cuidado que no se proyecte. Enfriar inmediatamente en baño de hielo por 5 minutos, para permitir la precipitación del glucógeno
4. Centrifugar a 3000 rpm por 15 minutos y decantar el sobrenadante. Colocar el tubo boca abajo sobre un papel filtro
5. Neutralizar el exceso de álcali añadiendo 0,2 ml de cloruro de amonio saturado y mezclar cuidadosamente con una varilla de vidrio permitiendo que la solución añadida entre en contacto con toda la pared interna del tubo
6. Preparar un blanco para lo cual se mide 0,4 ml de agua destilada y 2,6 ml del reactivo de yodo; proceder enseguida igual que las muestras problema.
7. Colocar el tubo en baño maría hirviente durante 15 minutos y enfriar. Añadir 0,2 ml de agua destilada y 2,6 del reactivo de yodo. Si la cantidad de glucógeno precipitado es grande, hacer en esta etapa una dilución apropiada.
8. Medir la absorbancia utilizando filtro verde
9. Para preparar las soluciones estándar se pueden medir 0,4 ml de soluciones que contengan 0,06 mg, 0,18 mg y 0,24 mg de glucógeno. A cada una de estas tres soluciones estándar, añadir 2,6 ml del reactivo de iodo , mezclar y proceder de la misma forma que la señalada para la muestra de hígado.
 Resultados	(Paola)
1. Anotar el aspecto y tamaño del hígado de los animales de experimentación
Rata A: El hígado de la rata A tiene la apariencia de unhígado normal, el cual es de color marrón y presenta un superficie lisa. Además, presenta un tamaño promedio y pesa 5.35 g.
Rata B: El hígado de la rata B presenta un color rojizo menos intenso que un hígado normal. Además, se muestra un tamaño reducido y pesa 4.50 g.
Rata C: El hígado de la rata C tiene una apariencia semejante al de la rata B. Sin embargo, tiene un peso menor, el cual es de 4.32 g.
Rata D: El hígado de la rata D presenta un color rojo oscuro, mucho más intenso que el de la rata A. Por otro lado, se puede observar que tiene un tamaño mucho menor que los hígados de las ratas A, B y C. Asimismo, tiene un peso igual a 3.98g.
2. Observar la cantidad de precipitado después de centrifugar. 
	
	Absorbancia bruta
	Absorbancia neta
	Concentración de Glucógeno (mg)
	Factor de calibración
	BLANCO
	0.118
	-
	-
	-
	ESTÁNDAR 1
	0.192
	0.074
	0.06
	0.81
	ESTÁNDAR 2
	0.338
	0.22
	0.18
	0.82
	ESTÁNDAR 3
	0.416
	0.298
	0.24
	0.81
3. Calcular el factor de calibración: 	0.81 
4. Graficar la curva de calibración con los datos anteriores. Utilizando papel milimetrado
5. Calcular la concentración de glucógeno en cada una de las muestras Expresar los resultados en mg de glucógeno por 100 mg, 200 mg y en el peso total del tejido hepático
	
	Peso del hígado (mg)
	Ab Bruta
	Ab Neta
	CONCENTRACIÓN en mg
	
	
	
	
	/ 200 mg
Hígado
	/ 100 mg
Hígado
	/ Hígado
Total
	Rata A 
(Alimentado )
	5.35
	1.20
	1.08
	0.875
	0.44
	23.54
	Rata B
(ayunas)
	4.50
	0.50
	0.38
	0.31
	0.16
	7.2
	Rata C
(trat. con adrenalina)
	4.32
	0.44
	0.32
	0.26
	0.13
	5.6
	Rata D 
(trat. con aloxano)
	3.98
	0.38
	0.26
	0.21
	0.11
	4.4
6. Calcular el porcentaje de disminución del glucógeno en 100 mg de hígado con relación al animal alimentado
	
	mg de glucógeno/
100 mg de hígado
	Porcentaje de disminución en relación al animal alimentado
	RATA A
	0.44
	-
	RATA B
	0.16
	63.64
	RATA C
	0.13
	70.46
	RATA D
	0.11
	75
 
7. Haga la interpretación de los resultados para cada rata:
Rata A: A partir de los resultados obtenidos podemos decir que, en la rata A no hubo porcentaje de disminución de glucógeno en 100 mg de hígado, puesto que la enzima reguladora llamada insulina aumentó después de la ingesta de alimentos, favoreciendo la síntesis de glucógeno por la estimulación de la actividad de la glucógeno sinteasa.
 
Rata B: En la rata B se obtuvo un porcentaje de disminución del glucógeno en 100 mg igual a 63.64%, ya que al encontrarse la ratita en ayuno, no pudo almacenar glucógeno. Asimismo, el ayuno provocó el aumento de glucagón, lo que estimuló la reacción de glucogenólisis al fosforilar a la fosforilasa b (inactiva) y convertirla en fosforilasa a (activa). 
 
Rata C: El caso de la rata C es muy parecido al de la rata B, ya que la adrenalina administrada tiene una acción muy parecida al glucagón. Por lo tanto, al encontrar grandes cantidades de adrenalina, la insulina no es capaz de inhibirla, en consecuencia se lleva a cabo la activación de la glucógeno fosforilasa a, la cual finalmente estimula la glucogenólisis.
Rata D: La rata D tuvo un mayor porcentaje de disminución del glucógeno en 100 mg, el cual fue de 75%. Esto se puede explicar en la acción del aloxano como una droga tóxica que causa necrosis sobre las células beta pancreáticas y que también actúa como inductora de diabetes experimental. Asimismo, se sabe que la diabetes es una enfermedad en la que el cuerpo no produce suficiente insulina o no la consume de la forma en que debería hacerlo. Por lo tanto, se puede decir que al no haber un inhibidor para las enzimas glucagón y adrenalina, se llevará a cabo la glucogenólisis, sin un control adecuado de la cantidad de glucosa en la sangre.
INTERROGANTES 
1. ¿Qué ventaja tiene la fosforólisis del glucógeno en comparación con la hidrólisis? (Vyctoria) 
La fosforolisis agrega un grupo fosfato a la glucosa, dando glucosa 1-P, mientras que en la hidrólisis no, y además se hace gasto de agua.
 
2. ¿Qué diferencia hay entre la acción glucogenolítica de la adrenalina y glucagón en el hígado y en el músculo. (Grecia)
La diferencia es que al accionar el glucagón no tiene receptores en el hígado, pero la adrenalina encuentra receptores en músculo e hígado.(2)
3. Represente esquemáticamente el mecanismo de acción de la adrenalina sobre la regulación en el metabolismo del glucógeno. (Valentina)
4. Si se administra leucina marcada con C-14 será factible la identificación posterior de glucógeno marcado con C-14. (Daniela)
No será factible ya que la leucina tiene un aspecto cetogénico, aparte de no ser un aminoácido glucogénico; por tal motivo la leucina no será factible para la identificación del glucógeno marcado con C-14.
5. ¿Cómo se explica que el animal diabético tenga menores niveles de glucógeno hepático que su contraparte normal. (Valentina)
El animal durante la comida, almacena en su hígado glucosa en forma de glucógeno y lo utiliza cuando lo necesita, pero cuando el animal es diabético la acumulación de sus alimentos le ocasiona hipoglucemia, que son niveles menores de glucosa en sangre a diferencia de lo altos niveles de insulina y los niveles de glucagón suprimidos durante una comida el almacenamiento de glucosa como glucógeno.
6. Representa esquemáticamente el mecanismo de acción de la insulina sobre el metabolismo del glucógeno. (Vyctoria)
 
REFERENCIAS
1. Unican.es. [cited 2021 Oct 11]. Available from: https://ocw.unican.es/pluginfile.php/1327/course/section/1638/Tema17-Glucogeno08-09.pdf