PRACTICA N 8 - BIOQUIMICA I

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PRÁCTICA N° 8 : EFECTO DEL PH, TEMPERATURA Y CONCENTRACIÓN
DE ENZIMA SOBRE LA ACTIVIDAD DE LACTASA
INTRODUCCIÓN
La actividad enzimática de la lactasa es esencial para el proceso catabólico del disacárido
lactosa. En esta práctica se mide la actividad de la lactasa en los suplementos dietéticos a
través de un ensayo colorimétrico. Esto proporciona a los estudiantes una plataforma
experimental para la comprensión de la actividad de la lactasa y la cinética enzimática.
Entender cómo las enzimas trabajan usando ejemplos de la vida real, es fundamental para una
amplia gama de carreras en las ciencias biomédicas. Este sencillo protocolo fue desarrollado
para estudiantes de pregrado de los primeros años y proporciona una introducción básica a
procedimientos analíticos para el análisis enzimático. La enzima de elección es lactasa, ya
que ella representa un ejemplo de una enzima disponible, comercialmente relevante para la
práctica del tratamiento de una enfermedad humana.
La lactasa, glicósido hidrolasa (EC 3.2.1.23/26), es una enzima de importancia nutricional
para mamíferos. La actividad de la lactasa se conserva altamente a través de la evolución y
deriva de la familia de enzimas beta-galactosidasas, presentes desde Escherichia coli hasta el
Homo sapiens; son proteínas tetraméricas.
La importancia de la lactasa en un entorno nutricional humano proviene de su papel en
permitir la descomposición de la lactosa en sus componentes monosacáridos constituyentes,
que se pueden entonces utilizar para generar energía en el cuerpo. La lactasa cataliza la
hidrólisis del enlace glucosídico de la lactosa, liberando galactosa y glucosa.
Luego, estos monosacáridos se usan principalmente para la generación de ATP al ingresar a
la glicólisis, ciclo de Krebs, cadena Respiratoria y fosforilación oxidativa.
En el recién nacido y en el infante (hasta 2 años), la lactasa es altamente expresada por los
enterocitos del sistema digestivo humano, pues la lactosa proveniente de la leche materna es
el principal hidrato de carbono de la dieta durante los primeros años de vida. Una deficiencia
congénita de lactasa (EPC), patología autosómica recesiva rara causada por mutaciones en el
gen de la lactasa (LCT), destaca la importancia médica de esta enzima. Recién nacidos con
enfermedad pulmonar crónica exhiben muy poca actividad de la lactasa, de esta forma, no
pueden ser alimentados con leche materna o cualquier otro tipo de leche o fórmula que
contenga lactosa.
Durante la infancia, normalmente se reduce la expresión de la lactasa; sin embargo, esta
reducción tras destete varía geográficamente, con aproximadamente el 35% de adultos en
todo el mundo, continúan expresando la enzima. Una expresión sostenida de la lactasa,
conocida como persistencia de la lactasa, permite a los individuos digerir la leche y productos
lácteos de una variedad de fuentes. Por el contrario, la pérdida de expresión de la lactasa
puede conducir a la intolerancia a la lactosa, también conocido como el adulto-tipo
hipolactasia (ATH), resultante de la incapacidad de descomponer la lactosa en el intestino.
ATH se caracteriza por un aumento de lactosa en el colon después de su ingestión. En el
colon, se fermenta la lactosa acumulada por la flora microbiana intestinal, liberando gases
como hidrógeno, metano y dióxido de carbono. La producción de estos gases en individuos
con deficiencias de lactasa promueve la distensión abdominal, aumento de flatulencia, dolor,
náuseas y borborygmi (ruidos de estómago). El aumento de los niveles de lactosa en el tracto
digestivo también puede llevar a heces sueltas.
La intolerancia a la lactosa en los recién nacidos (deficiencia de lactasa congénita) es debida
a mutaciones en el gen LCT. La intolerancia a la lactosa en la edad adulta está causa por la
disminución gradual de la expresión del gen LCT después de la infancia. La expresión del
gen LCT es controlado por una secuencia de ADN denominado elemento regulador, que se
encuentra en el gen MCM6. Esta modulación se realiza por polimorfismos en intrones del
gen MCM6 cercano. Individuos con la expresión sostenida de lactasa llevan polimorfismos
que funcionan como potenciadores distales fuertes de la expresión génica de LCT, regulando
la transcripción del LCT durante el destete y en consecuencia mantienen la expresión de la
lactasa en la edad adulta. Se han encontrado polimorfismos de reforzamiento en otras
especies de mamíferos.
Los síntomas resultantes de ATH ocurren por reducción de la ingesta de lactosa, por ejemplo
mediante la eliminación de productos lácteos de la dieta. Una alternativa para la ATH, es el
uso de suplementos de lactasa, recientemente disponibles en las farmacias. Estos
suplementos proporcionan lactasa aislada de una variedad de fuentes, incluyendo levaduras y
bacterias, en forma de píldoras o suspensiones que pueden ser tomadas o añadidas a la lactosa
que contiene los alimentos. El suplemento hidroliza una parte de la lactosa presente en los
alimentos a los productos glucosa y galactosa, permitiendo así su absorción y evitar la
acumulación de sustrato de lactosa no digerida en el intestino.
Basados en el uso de suplementos de lactasa como una ayuda dietética, hemos desarrollado
un experimento de laboratorio de enzimología simple. Este experimento aprovecha de
suplementos de lactasa disponible comercialmente y de Orto-nitrofenol
-beta-D-galactopiranósido (ONPG) para proporcionar un método, colorimétrico para medir la
ruptura de los enlaces glucosídicos de lactasa:
ONPG actúa como sustrato artificial para la lactasa, que cuando se hidroliza por acción de la
enzima, produce D-galactosa y Orto-nitrofenol. Este último producto posee un color amarillo,
que absorbe luz en una longitud de onda de 420 nm, cuando en medio alcalino se transforma
en orto-nitrofenolato.
Mediante la cuantificación de los cambios de absorbancia a 420 nm por la exposición de
ONPG a lactasa, es posible estimar la actividad de esta enzima. Este experimento ofrece una
demostración de la actividad enzimática. Realizando ensayos en diferentes condiciones, es
posible incorporar análisis más sofisticados de la cinética de la enzima, proporcionando un
valioso ejemplo de la vida real de las enzimas en acción relevante para la salud humana.
PARTE EXPERIMENTAL
SEGURIDAD: Esta práctica debe llevarse a cabo según las reglas de práctica de laboratorio:
equipos de protección personal, incluyendo mandil abotonado y limpio, guantes desechables
y gafas de seguridad, en todo momento en el laboratorio.
PROCEDIMIENTO
MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS:
- Pastillas de lactasa de 200 mg
- buffer fosfato 0.1 M pH 6.5 (PBS), otros buffers 0.1M pero de pHs: 4.0, 5.0, 8.0 y 9.0
- Orto nitrofenol galactopiranósido (ONPG) 5 mM
- Carbonato de sodio 1 M
- Mortero, tubos Eppendorf, gradillas, cubetas descartables de espectrofotómetro, tibs,
tubos de ensayo, hielo triturado
- Vortex, centrífuga, 3 baños maria, micropipetas automáticas, espectrofotómetro
1. Extracción de la enzima
- Triturar una pastilla de lactasa, de 200 mg de enzima, utilizando un mortero.
- Coloque el polvo resultante en un tubo de 15 mL rotulado con "suspensión" y
resuspender en 10 mL de buffer fosfato 100 mM, pH 6.5 (PBS)
- Mezclar en Vortex durante 1 minuto
- Transferir 1 mL de la suspensión a un tubo de centrífuga de 1.5 mL y centrifugar por
1 min a 3000 rpm.
- Transferir 500 μl del sobrenadante a un tubo limpio de 1.5 mL esto constituye el
"Extracto de lactasa".
2. Observación de la reacción colorimétrica
1) Pipetear 390 μl de PBS 100 mM en un tubo de 1,5 mL etiquetado "A".
2) Añada 100 μl de solución ONPG 5 mM y mezclar bien todo con un vórtex.
PRECAUCIÓN: El Orto-nitrofenol -beta-D-galactopiranósido (ONPG) sustrato sustituto de
lactosa, es un compuesto fenólico, debe ser manejado con precaución. En caso de contacto
con la piel se debe lavar inmediatamente. Cualquier derrame debe ser limpiado
inmediatamente con toallas de papel y desechados en el recipiente de residuos apropiado.
3) Añadir 10 μl de extracto en el tubo dereacción A y mezclar bien con un vórtex.
4) Observa la mezcla de reacción durante 5 minutos y anota cualquier cambio
colorimétrico en la solución.
3. Medición actividad enzimática
1) Rotular dos tubos de 1,5 mL: uno como "B" (blanco) y el otro "M" (muestra).
2) Añadir 390 μl de PBS 100 mM al tubo M y 400 μL de PBS de 100 mM para el tubo B
y luego agregar 100 μl de ONPG 5 mM a cada tubo.
3) Mezcle el contenido con un vórtex.
4) Añada 10 μl de extracto de lactasa al tubo M, mezclar con un vórtex y permitir que la
reacción proceda durante 1 minuto a temperatura ambiente.
5) Transcurrido 1 minuto, añadir 500 μl de carbonato de sodio de 1 M a ambos tubos
para inhibir la enzima lactasa al aumentar el pH, lo que termina la reacción.
6) Transferir 500 μl de cada tubo en cubetas de espectrofotómetro y medir la absorbancia
a 420 nm
7) Calibrar el “cero” del espectrofotómetro con el contenido del tubo B, luego leer la
absorbancia de la muestra para obtener el cambio en la absorbancia debido a hidrólisis
de ONPG en presencia de enzima activa.
4. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática
1) Preparar 6 tubos, un blanco y cinco de reacción según se describe en la sección 3 y
etiquetarlos como “B”, “4 ° C”, "Temperatura ambiente", "37° C", “60° C” y “baño
hirviente”. Pre Incubarlos por 5 minutos en sus respectivas temperaturas rotuladas.
Sin retirarlos de sus respectivos baños,
2) adicionar el extracto enzimático e incubar los tubos nuevamente en sus respectivos
baños por exactamente 1 minuto.
3) Detener la reacción mediante la adición de 500 μl de carbonato de sodio 1 M a cada
tubo.
4) Medir la absorbancia a 420 nm para cada tubo como se describe en la sección 3.
Registrar los valores
DISEÑE el procedimiento a realizar, para un segundo y tercer experimentos, donde se
estudia el efecto del pH (pHs: 4.0, 5.0, 6.5, 8.0 y 9.0) y el efecto de la [E] (agregando
diferentes cantidades del extracto enzimático, 5, 10, 15 y 20 µL, modificando también los
volúmenes respectivos del PBS); sobre la actividad de lactasa
RESULTADOS
Como no se hace curva de calibración, use como V0 los valores de absorbancia, pues son
proporcionales
Haga las gráficas con los resultados obtenidos de las lecturas:
EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD DE LACTASA
RÓTULO DEL TUBO TEMPERATURA DO420
B TA 0
4 4°C 0.44
20 20°C 1.05
37 37°C 1.72
60 60°C 0.85
92 92°C 0.22
EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD DE LACTASA
RÓTULO DEL TUBO pH DO420
B 6.5 0
4 4.0 0.19
5 5.0 0.73
6.5 6.5 1.68
8 8.0 0.75
9 9.0 0.27
EFECTO DE LA [E] SOBRE LA ACTIVIDAD DE LACTASA
RÓTULO DEL TUBO µL de extracto DO420
B 0 0
5 5 0.43
10 10 0.86
15 15 1.35
20 20 1.78
CUESTIONARIO
1. ¿Cuál sería el valor de Energía de activación (Ea) de esta reacción enzimática?
2. ¿Cuál es el pH óptimo de la enzima lactasa?
Tal y como se muestra en la gráfica y en la tabla el pH vendría a hacer 6.5, poniéndolo
así en un medio ácido pero no tan fuerte.
3. ¿Qué aminoácidos podrían estar involucrados en el centro catalítico de lactasa,
de acuerdo al experimento de pH? ¿Por qué?
Los aminoácidos que podrían estar presentes en la lactosa de acuerdo al experimento
de pH podría ser la Valina y la Leucina, ambos aminoácidos esenciales. Esto se
debería a el mismo grado de pH en él que se trabajaría mejor que vendría a ser el 6.5.
4. Si seguimos aumentando la cantidad de enzima, en este experimento, seguirá
aumentando la velocidad de reacción? ¿hasta cuándo? Explique
Si la velocidad de reacción seguirá aumentando hasta que la cantidad de sustrato
empiece a disminuir, en ese momento la velocidad de reacción bajará hasta que la
reacción sea completada.
5. La lactasa en humanos, ¿Es una enzima globular que actúa libremente en la luz
intestinal? Explique
La lactasa en los humanos se presenta una vez nosotros somos bebés, ya que es
necesaria para procesar la leche materna por este motivo la lactasa actúa libremente
en nuestro intestino. Ya que puede existir casos en la que la lactosa se asienta en el
intestino se descompone y la persona se volvería intolerante a la lactosa.
6. ¿La lactasa se expresa en todo el tiempo que vive una persona? Explique
Si y no, en las personas sin problemas intestinales o personas que no son intolerantes
a la lactosa si se presenta esta enzima en todo el tiempo de vida de la persona, si la
persona es intolerante a la lactosa el cuerpo pierde la capacidad de producir esta
enzima.
BASES MOLECULARES
En los seres humanos el consumo de productos lácteos determina la persistencia de la lactasa.
Alrededor del 35% de los adultos actuales la presenta, pero dicho porcentaje varía según
distintas localizaciones. Algunos ejemplos son:
● 15-54% Europa del este y sur
● 62%-86% Europa central y oeste
● 89-96% Gran Bretaña y Escandinavia
● En India la frecuencia es más alta en el norte (63%) que en el sur (23%)
● Asia del este presenta valores bajos, no superando el 30%
La capacidad de producir lactasa en la etapa adulta es en parte debida a un polimorfismo de
un solo nucleótido (SNP, Single Nucleotide Polymorphism), es decir, a un cambio en la
secuencia de ADN que afecta a una única base llamada 13910*T. Dicha base fue hallada en
un intrón de un gen vecino al de la lactasa. Estudios in vitro indican que este cambio de
nucleótido afecta a la actividad del promotor de la lactasa y hace que sea más probable que el
individuo posea una persistencia en la producción de lactasa de adulto.
CUESTIONARIO
1. ¿Qué tipos de intolerancia a la lactosa se pueden encontrar?
La intolerancia a la lactosa se clasifica en tres tipos diferentes.
➢ Intolerancia congénita
Causada por una mutación en el gen de la lactasa que provoca una actividad
mínima o nula de esta. Es extremadamente rara. Los bebés experimentan
diarrea desde la primera exposición a la leche materna y dura toda la vida.
➢ Intolerancia primaria o racial
Se produce una pérdida progresiva de la producción de la lactasa. Suele darse
a lo largo de la vida en ciertos grupos étnicos.Su causa es genética.
➢ Intolerancia secundaria o adquirida
Provocada por un daño intestinal temporal que disminuye la actividad de la
lactasa.
2. Hay alguna prueba molecular que nos podría permitir el diagnóstico de una
intolerancia congénita o una tendencia a perder la lactasa con la edad? Explique
El test genético de intolerancia a la lactosa se trata de una prueba fácil y no invasiva,
que se realiza una vez en la vida y que distingue entre una intolerancia primaria de
una secundaria en la que el intestino es incapaz de absorber la lactosa.
Se fundamenta en el análisis de las variaciones en el gen MCM6, denominado
elemento regulador, que modula la expresión del gen LCT (al menos cuatro
variaciones han sido identificadas en el elemento regulador). Cada una de estas
variaciones dan lugar a la codificación de la lactasa sostenida en el intestino delgado y
la capacidad reducida para digerir la lactosa durante toda la vida. Por lo tanto, las
personas sin estos cambios tienen capacidad reducida para digerir lactosa a medida
que envejecen, lo que da lugar a los signos y síntomas de la intolerancia a lactosa.
Esta prueba se realiza midiendo la cantidad de glucosa en la sangre con 8 horas de
ayuno y post ingesta de un líquido con una dosis estándar de lactosa. Luego, se realiza
una prueba de biología molecular, en la cual se buscan los polimorfismos del gen
MCM6 (13910C/C y 22018G/G), que codifica un elemento regulador para la
expresión de la enzima. Si el nivel de glucosa no se eleva, significa que el cuerpo no
digiere ni absorbe adecuadamente la bebida con lactosa.
3. ¿Qué es un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP)? ¿Cuál es la importancia
de su presencia en una población?
El polimorfismo de un solo nucleótido SNP que representa a las variantes genéticas
encontradas en el genoma humano. Debido a su amplia distribución, estos
polimorfismos se localizan en cualquier parte de la estructura de los genes y genomas.
Son funcionales sobre los niveles de expresión genética se denomina SNP reguladores(rSNP), mientras que los que alteran la traducción de los ARN mensajeros (ARNm),
el corte y empalme, la eficiencia para potenciar o inhibir el corte y empalme, la
estabilidad de los ARNm y la función de las proteínas sin alterar su estructura se
denominan SNP ARN estructurales (srSNP).
4. ¿Qué es un intrón y qué relación tiene con la epigenética?
Un intrón es una parte del gen que no codifica ningún aminoácido. En las células
vegetales y animales, la mayoría de las secuencias que codifican para los genes están
partidas por uno o más intrones. Las zonas de la secuencia del gen que se expresan en
las proteínas se llaman exones porque se expresan, mientras que aquellas que no lo
hacen se denominan intrones por encontrarse entre los exones. La epigenética se
definió como el estudio de las interacciones causales entre genes y sus productos que
llevan al fenotipo durante el desarrollo.
5. ¿En qué países es más frecuente esta intolerancia a la lactosa? ¿A qué se debe?
Si bien actualmente existe una mezcla entre lugares y razas, el porcentaje más elevado
de personas con intolerancia a la lactosa aún se mantiene en ciertos países del África,
donde la intolerancia a la lactosa alcanza hasta un 80% de la población, y Asia, donde
más del 95% de la población podría presentar esta alteración.
6. ¿Qué tipo de tratamientos se usan actualmente para resolver este problema?
● El tratamiento a la dieta baja en lactosa es el uso de enzimas sustitutivas de la
lactasa endógena. Existen diversos preparados comerciales que contienen
B-galactosidasas de origen bacteriano o fúngico. Los pacientes con
intolerancia a la lactosa pueden emplear estas enzimas exógenas cuando
prevén una ingesta de lactosa mayor a 10-15 g.
● Se han realizado estudios con fármacos hacia los pacientes con intolerancia a
la lactosa que prolongan el tiempo de tránsito intestinal o el de vaciamiento
gástrico, pero no obtuvo un efecto significativo sobre la absorción de la
lactosa.
● No consumir leche o productos lácteos en la dieta puede llevar una carencia de
calcio, vitamina D y proteínas, por eso se recomienda los suplementos que
contengan calcio y vitamina D.
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