PRACTICA N 6 - Quimica de Lipidos

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PRACTICA Nº 6: QUÍMICA DE LÍPIDOS
RELACIÓN DE EXPERIMENTOS:
● Saponificación de una grasa
● Adición de Yodo
● Investigación del colesterol en muestras biológicas
● Determinación cuantitativa del colesterol
INTRODUCCIÓN
Los lípidos son compuestos orgánicos de estructura química muy variada, insolubles en el
agua, pero fácilmente solubles en solventes orgánicos, siendo los ácidos grasos parte
estructural importante en la mayoría de ellos.
Estas moléculas cumplen importante rol biológico ya sea como componentes estructurales de
la membrana celular, constituyendo formas de almacenamiento de energía, moléculas
combustibles, agentes emulsificantes, vitaminas, hormonas, etc. El estudio de los lípidos y su
metabolismo se hace aún más importante por la relación que tienen con muchas
enfermedades como la aterosclerosis, diabetes mellitus, enfermedad coronaria,
hipertiroidismo, etc.
El suero sanguíneo normal, contiene lípidos en cantidades muy variables, donde están
comprendidos los ácidos grasos, colesterol libre y esterificado, acilglicéridos y fosfolípidos,
los mismos que se unen a proteínas transportadoras, constituyendo las lipoproteínas
complejas de naturaleza lábil y fácilmente disociables. Por lo general se estima que la lipemia
en un individuo normal es de 600 mg % por término medio, oscilando entre 400 a 800 mg %.
Se habla de hiperlipidemia cuando, el valor encontrado en los pacientes es superior a la cifra
mencionada. Se produce hiperlipemia en las siguientes condiciones: ayuno prolongado
enfermedades endocrinas como la diabetes mellitus e hipotiroidismos, ictericia de tipo
obstructivo después de la ingestión de comidas ricas en grasas, se presenta hipolipemia en el-
hipertiroidismo y anemia perniciosa.
Por otro lado, el contenido de lípidos en los alimentos es muy variable, así como la calidad de
los mismos dependiendo de la naturaleza y fuente de origen. La calidad de los lípidos puede
ser valorada por el contenido y clase de ácidos grasos presentes, donde cabe señalar que las
grasas o aceites de origen vegetal tienen un alto contenido de ácidos grasos poliinsaturados
(esenciales), comparados con las de origen animal, como se demuestra en la siguiente tabla:
Oleico Linoleico Linolénico Palmítico Esteárico
Manteca de Cerdo 43.9% ----- 2.1% 21% 13.8%
Aceite de Semilla de
algodón
33.0% 43.5% ----- 21% 2.0 %
Aceite de oliva 83.0% 7.0% ----- 6.0% 4.0%
Aceite de linaza (Lino) 5.0% 61.5% 25.0% 5.0% 3.5%
La naturaleza de los ácidos grasos presentes en las grasas neutras puede conocerse también a
través de los índices. El Índice de Saponificación se define como los miligramos de KOH
necesarios para saponificar un gramo de grasa; mientras que el índice de yodo se define
como los gramos de yodo absorbidos por 100 gramos de grasa.
En la siguiente tabla se muestran los índices de Yodo para algunas muestras:
Índice de lodo Índice de Saponificación
Aceite de semilla de algodón
Aceite de oliva
Aceite de linaza
103-111
79-88
192-195
185 – 196
185 – 195
190 - 195
Algunas investigaciones han indicado que los ácidos grasos poliinsaturados de la dieta tienen
valor como factor preventivo de la aterosclerosis. Por esta razón se aconseja el consumo de
aceites más ricos en ellos, en vez de grasas de origen animal. Se ha encontrado cierta
correlación entre incidencia de aterosclerosis y consumo de grasas animales en la
alimentación.
EXPERIMENTO 1.
SAPONIFICACIÓN DE LA GRASA
Objetivos
- Hidrólisis de los triglicéridos y obtención de los jabones de potasio
- Obtención de jabones de calcio (insolubles)
- Regeneración de los ácidos grasos a partir de la solución de hidrólisis.
Procedimiento
a) Colocar en un Erlenmeyer de 125 ml aproximadamente 5 gr de manteca de cerdo y
agregar 15 ml de solución alcohólica de KOH
b) Calentar en baño maría hasta que, al colocar una gota de la solución alcohólica en un
tubo con agua, la gota se disuelva
c) Agregar 25 ml de agua destilada y mezclar. Observar lo que ocurre y anotar
d) Tomar 5 tubos de prueba y colocar en cada uno de ellos 5 ml de la solución de la
etapa anterior y proceder de la manera siguiente:
- Al tubo 1 dejarlo en reposo
- Al tubo 2 añadir 1 ml de CaCl2 al 10 %
- Al tubo 3 añadir de 10 a 15 gotas de HCl concentrado hasta obtener un aspecto
lechoso.
Resultados:
1. Complete la siguiente Tabla:
El tubo 1 contiene Jabón de potasio
El aspecto del tubo 2 corresponde a Jabón de calcio insoluble
El aspecto lechoso del tubo 3 se debe a Reconstitución de los ácidos grasos
EXPERIMENTO 2
ADICIÓN DE YODO
Objetivo
- Demostrar por comparación el grado de instauración de los ácidos grasos presentes en
aceites de diferente origen
Procedimiento:
a) Colocar en cada uno dé 3 tubos de ensayo 1ml de los siguientes aceites: aceite de
oliva, de algodón y de linaza (de este último preparar dos tubos ).
b) Diluir añadiendo a cada tubo 2 ml de cloroformo y añadir 2 gotas de solución de iodo
al 1% en cloroformo, observar el color que da iodo.
c) Dejar en reposo y observar cada dos minutos el descoloramiento. De acuerdo al
tiempo de descoloramiento clasifique a los aceites ensayados según su contenido en
ácidos grasos insaturados
Resultados:
Escriba sus resultados en el siguiente cuadro:
Tubo Aceite Tiempo de decoloración Ácidos grasos insaturados
1 Linaza 18 min Más
2 Algodón 53 min Intermedio
3 Olivo 1h 15 min Menos
EXPERIMENTO 3.
DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DEL COLESTEROL. (Método de Zlatkis)
Objetivo
- Determinar cuantitativamente la concentración de colesterol en una muestra biológica
( suero sanguíneo).
Procedimiento
a) En un tubo de prueba se coloca 0.2 ml de suero sanguíneo, se añade 0.2 ml de agua
destilada. De esta muestra se mide 0.1 ml y se coloca en otro tubo al que se añade 2.9
ml de ácido acético y 2.0 ml de reactivo de color (FeCl2 y H2SO4) se mezcla bien y
luego que haya. enfriado se lee al fotocolorímetro con filtro verde.
b) La solución Estándar tiene una concentración de 100 mg %.
c) Mezclar bien, dejar en reposo 2 minutos. Leer con. filtro verde.
Determinación del factor de calibración:(Joaquin)
Tubo Estándar
100 mg%
(ml)
Ácido
acético
Reactivo de
color
Abs. Bruta Abs. Neta Concentración
(mg)
Fc
C/Abs. Neta
1 0.1 2.9 2.0 ml 0.60 0.53 0.1 0.1887
2 0.2 2.8 2.0 ml 1.18 1.11 0.2 0.1809
3 0.3 2.7 2.0 ml 1.81 1.74 0.3 0.1734
Blanco ---- 3.0 2.0 ml 0.07 ---- ---- ----
Muestra
(1:2)
---- 2.9 mL 3.0 mL 0.85 0.78 2.8236 0.362
Calcule en el espacio el Factor de calibración (Fc):
Calcular el Fc % :
Calcular la concentración de colesterol de la muestra problema.
EXPERIMENTO Nº 4.
DETERMINACIÓN DEL ÍNDICE DE SAPONIFICACIÓN
El índice de saponificación depende del tamaño de las moléculas de los ácidos grasos que
constituyen la grasa en estudio. Las relaciones son inversas. Desde que las grasas son mezclas
de acilglicéridos, la mayoría de tipo mixto, el índice de saponificación da un promedio de
tamaño molecular de los ácidos grasos presentes en los acilglicéridos constituyentes de dichas
grasas.
Objetivos:
- Determinar el índice de saponificación de una muestra de aceite o mantequilla.
Procedimiento:
a) Marcar dos Erlenmeyers con X y Bl
b) Colocar en el Erlenmeyer X un gramo de mantequilla o de aceite de algodón.
c) Añadir 10 ml de solución alcohólica de KOH 0.5 N tanto al Erlenmeyer X, así como
al marcado con Bl.
d) Colocar los dos Erlenmeyers en un sistema de reflujo (o baño de agua hirviente),
durante 50 minutos. Agitar continuamente.
e) Transcurrido el tiempo indicado, se deja enfriar espontáneamente y se añade luego 0.5
ml de fenolftaleína a cada uno de los Erlenmeyers.
f) Titular el contenido de cada uno de los frascos con una solución de HCl 0.5 N
g) Anotar los mililitros de ácido gastados.
Cálculos
A los mL. de HCl gastados para titular el blanco restar los mL. de HCl gastados para titular el
frasco X. Esta diferencia expresa los ml de KOH 0.5 N que se habrán utilizado para
saponificar los ácidos grasos presentes en la muestra de grasa empleada. Con estosdatos se
puede calcular los mg de KOH necesarios para saponificar 1 g de grasa (Índice de
Saponificación)
Expresión de Resultados
- Se gastaron 7.3 ml de HCl 0.5 N para titular el blanco.
- Se gastaron 0.47 ml de HCl 0.5 N para titular el frasco X.
- Los ml. de KOH 0.5 N que se usaron para saponificar la grasa fueron:
7. 3𝑚𝐿 − 0. 47𝑚𝐿 = 6. 83 𝑚𝐿
6. 83 𝑚𝐿 𝑥 0. 5𝑚𝐸𝑞/𝑚𝐿 = 3. 42 𝑚𝐸𝑞/𝑚𝐿
3. 42 𝑚𝐸𝑞/𝑚𝐿 = 3. 42𝑚𝐸𝑞 𝐾𝑂𝐻
- Por lo tanto, el Índice de Saponificación fue:
1 𝑚𝐸𝑞 −− 56. 1 𝑚𝑔 
3. 42 𝑚𝐸𝑞 −− 𝑥
𝑥 = 191. 86 𝑚𝑔
Concluimos así que se necesitaron 191.86 mg de KOH para la saponificación de la muestra.
INTERROGANTES:
1. ¿Cuál es el objeto de añadir KOH y HC1 en el experimento 1?
El objetivo de añadir KOH es saponificar una grasa (en el caso del experimento 1,
manteca de cerdo) formando glicerol y sales de ácidos grasos (jabones). Asimismo, la
finalidad de agregar HCl es reconstituir los ácidos grasos libres, a través de la
sustitución de Potasio (K) por el ion de del HCl, restableciendo el grupo𝐻+
carboxílico de la grasa.
2. Explique mediante una ecuación química la reacción que se efectúa en el tubo 3:
𝐻
3
𝐶 − 𝐶𝐻
2( )𝑛 − 𝐶𝑂𝑂𝐾 + 𝐻𝐶𝑙 → 𝐻3𝐶 − 𝐶𝐻2( )𝑛 − 𝐶𝑂𝑂𝐻 + 𝐾𝐶𝑙
3. ¿Qué es lo que permite la adición de iodo a los ácidos grasos?
La adición del yodo en los ácidos grasos es posible gracias a la presencia de dobles
enlaces en los aceites y ácidos grasos, esto permite que el yodo pueda identificar la
cantidad de dobles enlaces al momento de reaccionar con ellos.
4. ¿Si se añade iodo a una solución alcohólica de lecitina podría adicionarla? ¿Por
qué?
No podría ser adicionado por el medio en el que se encuentra la lecitina, el alcohol va
a reaccionar con los dobles enlaces y a crear un grupo hidroxi, impidiendo que el
yodo pueda ser adicionado en esta solución.
5. ¿Qué funciones metabólicas cumple el colesterol?
● Una de sus principales funciones es componer una estructura de la membrana
celular regulando su fluidez y controlando el transporte
● Es precursor de la vitamina D , a partir de una molécula de colesterol que
circula debajo de la dermis, al interactuar con la luz solar se altera formando
otra molécula la colecalciferol o vitamina D3.
● Precursor de las sales biliares , estas sales representan la vía principal para la
excreción del colesterol y para la absorción de nutrientes grasos.
● Componente de la capa externa de las lipoproteínas plasmáticas.
6. Teniendo en cuenta que la saponificación completa de un mol de TG ocasiona un
gasto de 3 equivalentes gramo de KOH. Estimar el PM del TG considerando que
su índice de saponificación es de 210 (PM del KOH = 56)
1𝑔 𝑇𝐺 −− 3000𝑚𝐸𝑞 𝐾𝑂𝐻
3000 𝑥 56. 1 = 168 000 𝑚𝑔 𝐾𝑂𝐻
1𝑔 𝑔𝑟𝑎𝑠𝑎 −− 𝐼𝑛𝑑. 𝑆𝑎𝑝𝑜𝑛𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑐𝑖ó𝑛 (210 𝑚𝑔)
𝑥 −− 16 8300 𝑚𝑔
𝑥 = 801. 43𝑔 𝑔𝑟𝑎𝑠𝑎
MÉTODO DE EXTRACCIÓN LIPÍDICA TOTAL (Método Bligh & Dyer):
Es un método muy útil para la evaluación de Lípidos de diferentes muestras.
Pasos
● Las muestras deben estar particularizadas para maximizar la extracción
● Para cada 1 ml de muestra, añadir 3,75 ml 1:2 (v/v) de CHCl3: Metanol
● Agitar bien
● Agregue 1,25 mL de CHCl3 (Cloroformo) y agitar bien
● Agregue 1,25 mL de H2O destilada y agite bien
● Separación
- Centrifugar a 1000 RPM en una centrífuga durante 5 min a temperatura
ambiente para obtener un sistema de dos fases (parte superior acuosa, fondo
orgánico)
- Dejar toda la noche para alcanzar la separación de fases
● Recupere la fase inferior con una pipeta Pasteur a través de la fase superior.
● Cuando la punta de la pipeta esté en la parte inferior del tubo, aspire con cuidado la
fase inferior, asegurándose absorber la fase superior (sólo debe intentar recuperar
aprox. 90% de la fase inferior, no toda)
● Transferir la fase inferior a un recipiente pesado
● Volver a realizar la extracción como descrito en los primeros
● Mezclar las dos fases inferiores en un recipiente pesado
● Permitir la evaporación de los solventes en la campana de extracción
● Al terminar la evaporación pesar los recipientes
● Restar el peso de recipiente para obtener el peso de la extracción
Interrogante
Investiga y describa otros métodos utilizados para la extracción de lípidos
Existe una gran variedad de métodos de extracción de lípidos, como vendrian a los que
utilizan solventes y los que utilizan instrumentos:
● Con solventes:
○ Soxhlet: Este método es uno de los más ampliamente utilizados, este usa una
extracción sólida-líquida, mantiene un flujo constante de un solvente orgánico,
por lo general éter de petróleo, éter etílico o hexano-diclorometano. Este
solvente es calentado hasta ebullir, luego condensado y dispuesto en el tubo
Soxhlet, en el cual extrae el aceite contenido en la biomasa hasta que el tubo
se llena, cuando el tubo está lleno de solvente, este es sifonado hasta el balón
que contiene el resto de solvente y se repite el proceso.
○ Folch: Este método se considera uno de los más fiables para la recuperación
de los lípidos totales, en la extracción de los compuestos el perfil de los ácidos
grasos permanece estable, aunque en algunas investigaciones este método
presentó un rendimiento más bajo al de Soxhlet.
○ Schmid-Bondzynski-Ratzlaff: Es un método muy empleado para determinar
los lípidos en queso y en leche en polvo. Económico, extrae lípidos totales y
las muestras pueden ser analizadas sin secado previo, sin embargo los lípidos
no pueden ser usados para determinaciones posteriores.
● Con Instrumentos:
○ Extracción asistida por Microondas: Consiste en el calentamiento de un
solvente en contacto con la muestra. El proceso implica la perturbación de los
enlaces por puente de hidrógeno, como resultado de la rotación de dipolos por
la radiación en las moléculas y la migración de iones; con la consiguiente
penetración del solvente en la matriz, y transporte al seno del líquido de los
componentes.
○ Espectroscopia de infrarrojo cercano (NIR): Con esta técnica se generan
modelos matemáticos que relacionan la composición química con cambios de
energía en la región correspondiente al rango infrarrojo cercano. Este método
no es destructivo, requiere un mínimo o nulo tratamiento de la muestra,
minimiza el daño ambiental y es una técnica multianalítica de alta precisión
que permite predecir varios factores simultáneamente.
○ Autoclavado: El principio de extracción mediante Autoclavado es similar a la
extracción mediante agua subcrítica. Una ventaja de esta técnica para ser
utilizada en la extracción de lípidos, es que se puede trabajar con la biomasa
húmeda, lo cual evade la etapa de secado de la biomasa, durante la cual se
pueden degradar los lípidos presentes y aumenta los costos globales de
proceso.
Referencias
● Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. 2017. “Bligh and Dyer”
and Folch methods for solid–liquid–liquid extraction of lipids from microorganisms.
Comprehension of solvatation mechanisms and towards substitution with alternative
solvents. International journal of molecular sciences, 18, 708-729.
● Nurra, C., Torras, C., Clavero, E., Ríos, S., Rey, M., Lorente, E., Farriol, X., Salvadó,
J. 2014. Biorefinery concept in a microalgae pilot plant. Culturing, dynamic filtration
and steam explosion fractionation. Bioresource technology, 163, 136-142.
● Shiva, S., Enninful, R., Roth, M.R., Tamura, P., Jagadish, K., Welti, R. 2018. An
efficient modified method for plant leaf lipid extraction results in improved recovery
of phosphatidic acid. Plant Methods, 14, 1-8.
Experimento casero
● Pesar muestra (35 g)
- Quinua blanca
- Soya
● Pesar 75 g acetona (Limpiador de uñas)
● Adicionar el solvente sobre la muestra
Quinua Blanca Soya
● Agitar cada hora la mezcla
● Dejar en contacto el solvente con la muestra (toda la noche)
● Al día siguiente: Filtrar las muestras con gasa, permitiendo que el solvente se separe
en un recipiente seco y previamente pesado
- Recipiente de Quinua (93 g)- Recipiente de Soya (87 g)
● Permitir que el solvente se evapore en un ambiente abierto, incluido las muestras
sólidas (24 horas)
● Pesar los frascos:
- Recipiente de Quinua (96 g)
- Recipiente de Soya (108 g)
● Lípidos
- Quinua (96−93=3 g)
- Soya (108-87=21 g)
Quinua Blanca Soya