metodologia de extraccion peroxidasa

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INSTITUTO TECNOLÓGICO SUPERIOR
De Ciudad Hidalgo
PRACTICA DE CONTEO DE PROTEÍNAS DE LA PEROXIDASA (HORSERADISH PEROXIDASE, HRP)
MATERIA: BIOCATÁLISIS
	DOCENTE: 	M.C. YOHANA L. LEÓN MÁRQUEZ 
PRESENTAN:
DULCE MARÍA GUZMÁN BUCIO 
SOFÍA NAVA CORONEL 
CRISTIAN SALAS TORRES 
CARRERA:
INGENIERÍA EN NANOTECNOLOGÍA 
GRUPO: 
NANO 9
Ciudad Hidalgo Michoacán a 11 de octubre de 2018
Índice
4.- Metodología	2
4.1.- Preparación del extracto crudo	3
4.2.- Cuantificación de proteína previo a la purificación	4
4.3.- Precipitación con sulfato de amonio	5
4.4.- Protocolo de ensayo de actividad peroxidasa	7
4.5.- Efecto del pH sobre la actividad peroxidasa	7
4.6.- Efecto de temperatura sobre la actividad peroxidasa	8
Conclusión	9
Referencias	10
4.- Metodología 
Reactivos
Agua destilada
Buffer fosfato pH 7.4 
Rábanos frescos 
Solución estándar de albúmina de huevo 
Reactivo de Bradford
Materiales
Cuchillo 
Charola de pesaje 
Probeta graduada de 100 mL 
Tela de manta 
Vasos de precipitado 
Tubos falcon
Aceite 
Cubetas de plástico
Micropipeta de 200 μL 
Pipeta de 5 mL 
Equipos
Licuadora 
Balanza analítica 
Centrífuga 
Termoagitador 
Espectrofotómetro
4.1.- Preparación del extracto crudo
1. Los rábanos se lavaron y se les retiró la pata. Fueron cortados en rodajas para pesar una cantidad de 100 gramos en la balanza. 
2. Se homogeneizaron con buffer fosfato de pH 7.4 en una licuadora.
3. La mezcla se filtró mediante tela de manta y el filtrado se colocó en tubos falcon. 
4. El filtrado se sometió a 8000 rpm durante 10 minutos, luego de lo cual se observó un precipitado verde-oscuro en el fondo de los tubos, mismo que se desechó. 
5. El sobrenadante se dividió en dos partes que se colocaron en vasos de precipitado para su calentamiento a 65ºC por 3 minutos, en baño de aceite. Este paso se realizó para eliminar los posibles residuos presentes de catalasa. 
6. El extracto crudo así obtenido se guardó para la determinación de proteína mediante el método de Bradford. 
Figura 5.- Extracto filtrado
Figura 5.- Extracto de rábano y bufer7.4
Figura 6.- Extractos centrifugados a 8000 rpm durante 10 minutos
Figura 7.- Calentado del extracto a 65°C para eliminación de los residuos de catalasa
4.2.- Cuantificación de proteína previo a la purificación 
La cuantificación de proteínas se llevó a cabo antes de la purificación para hacer una comparación entre la cantidad de proteínas presentes en el extracto crudo y el extracto purificado. Se utilizó el método de Bradford, con el reactivo preparado anteriormente. Se Preparó la curva patrón de albúmina bovina en un rango desde 0 hasta 60 µg; de tal manera que el volumen final en cada tubo fue de 300 µl. Se mezcló para ello el volumen adecuado de la disolución stock de albúmina bovina de un 1 mg/ml y el correspondiente volumen necesario de agua, de acuerdo con la siguiente tabla:
	Proteína (mg)
	0
	0.1
	0.2
	0.3
	0.4
	0.5
	0.6
	Albúmina (mL)
	0
	0.1
	0.2
	0.3
	0.4
	0.5
	0.6
	Agua (mL)
	3.0
	2.9
	2.8
	2.7
	2.6
	2.5
	2.4
	Vol total (mL)
	3.0
	3.0
	3.0
	3.0
	3.0
	3.0
	3.0
Se prepararon de tres disoluciones de la muestra problema con tres triplicados cada una, de acuerdo a la siguiente tabla:
	Extracto crudo diluido (mL)
	A
	B
	C
	 Volumen de Extracto crudo diluido (mL)
	0.3
	0.4
	0.5
	Agua (mL)
	2.7
	2.6
	2.5
	Vol total (mL)
	3.0
	3.0
	3.0
Finalmente se añadió 3 ml del reactivo de Bradford a todos los tubos; tanto a las diluciones que contienen la albúmina como a las que contienen el extracto crudo diluido. Se agitaron los tubos y a continuación se procedió a la lectura de la absorbancia a 595 nm en el espectrofotómetro.
Proceso de cuantificación de proteínas totales 
Figura 12.- Preparación de muestras para su análisis en el espectrofotómetro
4.3.- Precipitación con sulfato de amonio
Primero se realiza una adición de sulfato de amonio para lograr una saturación del 30%, a la cual precipitan enzimas como la polifenoloxidasa (PFO). La peroxidasa HRP precipita a concentraciones mayores de dicha sal. La cantidad de POD que precipita incrementa desde una saturación con sulfato de amonio del 30% hasta el 80%. Siendo mayor la precipitación de POD de entre 60-80 % de sal. 
El extracto crudo se mezcla con una cierta cantidad de sulfato de amonio para dar una solución saturada al 30% (consultar Anexo 1). La sal se agrega lentamente bajo agitación vigorosa y una vez disuelta, la mezcla resultante se deja en agitación por una hora. Luego, se centrifuga a 8000 rpm durante 10 minutos. El precipitado se descarta y el sobrenadante se conserva para el siguiente paso. 
El sobrenadante se mezcla con otra cantidad de sulfato de amonio para dar una solución saturada al 65%. Se procede de manera similar que en la precipitación anterior, aunque la mezcla se agita por 60 minutos una vez disuelta toda la sal. El preparado se centrifuga a 8000 rpm por 10 minutos. El precipitado y el sobrenadante se separan y se guardan para la cuantificación de POD. La parte con mayor contenido proteico se utiliza para los ensayos de actividad enzimática. 
 
Figura 8. Adición de sulfato de amonio Figura 9.- Agitación durante 1 h de la solución
 
 
Figura 10.- Término de la agitación Figura 11.- Solución después de centrifugar
4.4.- Protocolo de ensayo de actividad peroxidasa
Se agregan diferentes alícuotas del extracto enzimático (10, 20, 30, 40, 50 uL) a 2.9 mL de solución de buffer de pH 7 con peróxido de hidrógeno en concentraciones de 0.3 mM y sustrato guayacol a 0.5 mM, estabilizados a temperatura ambiente. La actividad enzimática se mide espectrofotométricamente a 470 nm cada 3 minutos al término de los que se añade ácido tricloro acético para detener la reacción, longitud de onda del sustrato oxidado tetraguayacol. La solución blanco no contiene extracto enzimático. 
La unidad de actividad peroxidasa se define como el cambio en 0.001 unidad de abosrbancia por minuto por miligramo de tejido seco. 
Experimentos 
	Sustrato 
	Concentración
	H2O2 (mM) a 0.5 mM de guayacol
	0.1
	0.3
	0.5
	0.7
	1
	Guayacol (mM) a 0.3 mM de H2O2
	0.1
	0.3
	0.5
	0.7
	1
4.5.- Efecto del pH sobre la actividad peroxidasa
Para determinar el efecto del pH en la actividad peroxidasa, se prepararon soluciones buffer en diferentes rangos de pH. 
Buffer de ácido cítrico al 0.2 M (pH= 5)
Buffer de fosfato al 0.2 M (pH= 6, 7) 
Buffer de ácido bórico al 0.2 M (pH= 8) 
Se usó NaOH al 1 N o HCl para ajustar el pH. Se realizarán los correspondientes ensayor enzimáticos, manteniendo los demás factores constantes. A cada pH le corresponde un control (sin enzima). El pH donde la enzima mostró mayor actividad fue usado para los ensayos con variación de temperatura. 
4.6.- Efecto de temperatura sobre la actividad peroxidasa
Las condiciones más favorables para la actividad peroxidasa fueron utilizadas para estudiar el efecto de la temperatura sobre la enzima y sí determinar la temperatura óptima. Los ensayos enzimáticos fueron realizados a 25 ºC, 35 ºC, 45 ºC, y 60ºC, con el respectivo control (sin enzima). 
Conclusión
La extracción de enzimas involucra procesos que pueden ser fáciles o complejos, pero desde su descubrimiento han sido objeto de una infinidad de investigaciones gracias a sus características y prometedoras aplicaciones. El interés científico por explotar todas sus propiedades ha llevado a implementar nuevos métodos para su extracción y su estudio.
En el trabajo que se ha realizado con la enzima peroxidasa a partir de rábano involucra la realización de un extracto crudo del cual se ha podido determinar la concentración de enzimas a partir de la coloración llevada a cabo por el método de Bradford, del cuál anteriormente hemos utilizado y las soluciones que se han realizado a comparación con este trabajo ha tenido un cambio muy notorio de coloración. En las muestras con albúmina la coloración es azul con un tono muy ligero, y al momento que hemos hecho esto con el extracto crudo del rábano la coloraciónha sido de un tono morado, cabe mencionar que este extracto aún no se había sometido a precipitación para eliminar algunas sustancias que no son necesarias para nosotros, y esta coloración indica la presencia tanto de la enzima peroxidasa como de algunas otras presentes. Este mismo proceso será realizado nuevamente cuando se haya realizado la precipitación con la sal de sulfato de amonio.
Posterior a esto se realizó una cuantificación en el espectrómetro para la cuantificación de proteínas, para lo que los valores que han resultado al analizarlos nos indican una gran cantidad de enzimas presentes en la solución.
El siguiente paso es realizar las pruebas en el espectrofotómetro a la solución a la que se le ha realizado la precipitación y de la misma manera hacer una curva de calibración para su cuantificación.
Referencias
[1] 	Á. C. PEINADO, «PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE UNA PEROXIDASA DE ZANAHORIA,» UNIVERSIDAD DE JAÉN, FACULTAD DE CIENCIAS EXPERIMENTALES, ESPAÑA, 2006.
[2] 	P. M. G. SALAZAR, «ESTUDIO DE LA POLIMERIZACIÓN DE FENOLES UTILIZANDO PEROXIDASAS PRESENTES EN RÁBANO COMÚN (Raphanus sativus var sativus), CON APLICACIÓN EN LA BIORREMEDIACIÓN DE AGUAS RESIDUALES DE UNA EMPRESA TEXTILERA,» ESCUELA POLITÉCNICA DEL EJÉRCITO, DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA , SANGOLQUÍ, 2011.
[3] 	F. Bjorksteb, H. Yliopiston y B. Laitos, «A kinetic Study of the Horse-Radish Peroxidase-Catalyzed Oxidation of Iodide,» 1968.
[4] 	F. J. R. Dueñas, «CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE UN NUEVO TIPO DE PEROXIDASA LIGNINOLÍTICA,» Universidad Complutense de Madrid, Facultad de Ciencias Biológicas, Madrid, España, 1998.
[5] 	S. Rathnamsamy, R. Singh, R. Auxilia y B. N. Vedhahari, «Extraction of peroxidase from various plant sources and its biodegradation studies on phenolic compounds,» BioTechnology: An Indian Journal, 2014. 
[6] 	E. M. B.Sc, «Stability Characteristics and Applications of Native and Chemically-Modified Horseradish Peroxidases,» pp. 8-11, 1996. 
[7] 	P. M. GUTIÉRREZ SALAZAR, «ESTUDIO DE LA POLIMERIZACIÓN DE FENOLES UTILIZANDO PEROXIDASAS PRESENTES EN RÁBANO COMÚN (Raphanus sativus var sativus), CON APLICACIÓN EN LA BIORREMEDIACIÓN DE AGUAS RESIDUALES DE UNA EMPRESA TEXTILERA,» DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA, 2011. 
[8] 	F. W. Krainer y A. Glieder, «An updated view on horseradish peroxidases: recombinant production and biotechnological applications,» springer, vol. 99, p. 1611–1625, 2015.