sitios de union peroxidasa

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INSTITUTO TECNOLÓGICO SUPERIOR
De Ciudad Hidalgo
PRACTICA DE CONTEO DE PROTEÍNAS DE LA PEROXIDASA (HORSERADISH PEROXIDASE, HRP)
MATERIA: BIOCATÁLISIS
	DOCENTE: 	M.C. YOHANA L. LEÓN MÁRQUEZ 
PRESENTAN:
DULCE MARÍA GUZMÁN BUCIO 
SOFÍA NAVA CORONEL 
CRISTIAN SALAS TORRES 
CARRERA:
INGENIERÍA EN NANOTECNOLOGÍA 
GRUPO: 
NANO 9
Ciudad Hidalgo Michoacán a 11 de octubre de 2018
Índice
2.4.- Sitios de unión a sustratos	2
2.5.-Estabilidad de la peroxidasa	3
2.6.- Aplicaciones	4
2.6.1.- HRP como una enzima reportera	4
2.6.2.- La HPR en biocatálisis	5
2.6.3.- HRP en sistemas de biorremediación.	6
2.6.4.- Terapia contra el cáncer.	6
3.- Modelado de la proteína peroxidasa (horseradish peroxidase, EC. 1. 11. 1. 7)	6
Referencias	12
2.4.- Sitios de unión a sustratos
Las peroxidasas catalizan la oxidación de una gran variedad de sustratos. Estos van desde metaloproteinas (como el citocromo c) o polímeros de gran tamaño (como la lignina) hasta pequeñas moléculas aromáticas (sustrato de peroxidasas de plantas y hongos) o iones inorgánicos (como el Mn2+ sustrato de peroxidasas producidas por los hongos ligninolfticos).
La especificidad de estas enzimas frente a los diferentes sustratos depende de dos factores.
• Potencial de reducción de las diferentes formas activas de la enzima (Compuestos I y II) con respecto al potencial de reducción de los sustratos: esta propiedad está determinada por la capacidad de la enzima para estabilizar los elevados estados de oxidación del hierro durante el ciclo catalítico, que se debe tanto al fuerte carácter aniónico del quinto ligando — del hierro (histidina proximal) como a la naturaleza hidrofílica de los residuos del lado distal del hemo y a las interacciones electrostáticas en el interior de la molécula.
• Propiedades estructurales de la proteína, que determinan los sitios de unión a los sustratos: esta especificidad está probablemente modulada por algunos cambios en la superficie de las peroxidasas y por sustituciones en un pequeño número de aminoácidos, sin llegar a provocar un cambio u significativo a nivel de la estructura secundaria y del plegamiento global de la proteína.
En el caso de la u HRP se ha observado la existencia de un bolsillo hidrofóbico que rodea el anillo aromático del sustrato en el canal del hemo. En lo que se refiere a la unión de las peroxidasas a otros sustratos u aromáticos, la falta de datos estructurales imposibilita la identificación de los sitios de unión, aunque se han realizado diversas aproximaciones. Así, para la LiP se han construido modelos en los que se reflejan posibles sitios de unión para el alcohol veratrílico (3,4-dimetoxibencílico), que es a un sustrato tipo de esta enzima y actúa como mediador en la degradación del polímero de lignina. También se han determinado posibles sitios de unión, que incluyen residuos de fenilalanina, en base a estudios de H-NMR. Incluso se han realizado estudios de mutagénesis dirigida con la 11RP analizando posteriormente la proteína recombinante por H-NMR [1].
2.5.-Estabilidad de la peroxidasa
En la reacción de tetrametilbenzidina y peróxido de hidrógeno, la temperatura óptima, donde la enzima mostró actividad máxima es de alrededor de 60-65 ºC, luego de lo cual la actividad enzimática comienza a disminuir. Y a 80 ºC la enzima sufre una drástica pérdida de actividad, posiblemente debido a su desnaturalización. 
Por otra parte, la peroxidasa es estable sobre un amplio rango de pH de entre 4-9, pero tiene mayor estabilidad en ambientes ácidos que en básicos. El pH óptimo es de alrededor de 6-6.5 y el valor de la actividad enzimática disminuye a pH menores y mayores de este rango [2]. 
El HRP nativo muestra características similares a las de una enzima ideal. Su actividad catalítica se mantiene durante largos períodos de tiempo a temperatura ambiente. Se ha demostrado que la peroxidasa puede funcionar cuando se suspende en solventes orgánicos miscibles con agua, incluso con un mínimo de agua unida a la superficie de la proteína, mientras que las enzimas pueden funcionar en solventes orgánicos anhidros como el hexano o el tolueno, los solventes miscibles en agua, a menudo conduce a la inactivación de proteínas. Por otro lado, los bajos volúmenes de disolventes orgánicos miscibles con agua, como el dioxano o el acetonitrilo, parecen causar una desnaturalización parcial en la HRP. El calcio es un componente vital de la molécula de peroxidasa y tiene un papel en el mantenimiento de la estabilidad estructural. A pesar del hecho de que el calcio no participa en la reacción catalítica de la peroxidasa, se ha informado que la estabilidad térmica de la enzima disminuye significativamente cuando se expone al clorhidrato de guanidina en EDTA [3]. 
Aparte se sabe que el manganeso, los fenoles y el peróxido de hidrógeno afectan la estabilidad de la peroxidasa. Las concentraciones bajas de peróxido de hidrógeno dan como resultado una actividad disminuida de la HRP, mientras que una concentración demasiado alta es inhibitoria. El cianuro y el sulfuro inhiben reversiblemente la HRP, pero el monóxido de carbono no lo hace. La enzima es bastante sensible a las bacterias, agentes bacteriostáticos y otros químicos que se encuentran en el agua del grifo [3].
2.6.- Aplicaciones 
Las peroxidasas son utilizadas en laboratorios clínicos y en la industria. Así, los ensayos para la determinación y cuantificación de metabolitos. Las enzimas peroxidásicas se emplean como biocatalizadores para la generación de productos de interés biotecnológico e industrial. La Comisión Científica de la Unión Europea ha definido a las peroxidasas como una de las proteínas con mayor interés biotecnológico para el siglo XXI, por su aplicación en la conservación del ambiente. En esta línea estas enzimas pueden sustituir a algunos reactivos y catalizadores químicos usados hoy en día en cierto tipo de industrias, además facilitan la remoción de compuestos orgánicos contaminantes [4].
2.6.1.- HRP como una enzima reportera
Tradicionalmente, la HRP se ha utilizado exhaustivamente como una enzima informadora, por ejemplo, en tinciones histoquímicas y ensayos de diagnóstico. Por ejemplo, se utilizaron anticuerpos secundarios conjugados con HRP para detectar los péptidos de la envoltura del VIH-1 expresados ​​en cultivo celular mediante un ELISA basado en células. La actividad de HRP puede detectarse mediante la formación de un producto cromogénico o fluorogénico, o mediante una señal electroquímica debido a la naturaleza redox de la catálisis con HRP. La mayoría de los estudios sobre HRP en sistemas de biosensores se centra en la detección de H2O2. Sin embargo, en los últimos años, un número considerable de estudios también se ocuparon de la detección de otras moléculas, como la glucosa, etanol, ADN y ARN, l- fenilalanina, citrinina pirogalol e hidroquinona, fenoles, el alérgeno lácteo β-lactoglobulin, títulos de rotavirus, y marcadores tumorales a través de H2O2 . En particular, los estudios sobre aplicaciones de HRP de relevancia médica actualmente son particularmente prevalentes. Por ejemplo, la actividad del reportero HRP se usó recientemente para la cuantificación de la actividad de la proteína quinasa, lo cual es importante en casos de descubrimiento de fármacos relacionados con la quinasa, terapia y diagnóstico clínico. En otro estudio, se utilizaron conjugados HRP para la detección del ADN del patógeno humano Mycobacterium tuberculosis. Una calidad de enzima consistente es de particular relevancia en el diagnóstico médico. Hasta la fecha, HRP es también un componente importante de ensayos de alto rendimiento en la ingeniería de enzima, la detección de H2O2 como un producto secundario de biooxidantes. 
2.6.2.- La HPR en biocatálisis.
Las aplicaciones de HRP en síntesis orgánica tratan predominantemente con reacciones de polimerización. Por ejemplo, la formación de poli (metacrilato de metilo), un componente de las fibras ópticas catalizadas por HRP, podría realizarse a temperatura ambiente. Además, las reacciones de polimerización para formarpoliestireno a partir de estireno y sus derivados se realizaron con éxito con HRP. Además, se utilizó HRP para formar hidrogeles, utilizando derivados fenólicos de quitosano y alcohol polivinílico. Al elegir la proporción adecuada de las dos moléculas de partida, la adhesión de células fibroblásticas o el crecimiento de E. coli fue permitido o inhibido, respectivamente. Recientemente, el polímero poli (3,4-etilendioxitiofeno) intrínsecamente conductor se sintetizó en un proceso de dos pasos que involucra HRP. Sin embargo, la inactivación de la enzima por los radicales fenoxilo describe una limitación importante en las reacciones de polimerización oxidativa. 
2.6.3.- HRP en sistemas de biorremediación.
Además del desarrollo de nuevos sistemas de biosensores electroquímicos, las publicaciones más recientes sobre HRP aplicado tratan con sistemas de biorremediación para degradar los tintes sintéticos y para eliminar los contaminantes fenólicos de las aguas residuales. También en estas aplicaciones, la estabilidad de la enzima es un factor crucial. Al modificar la HRP con diferentes polisacáridos, recientemente se encontró que una enzima conjugada con almidón muestra más de seis veces una estabilidad mejorada en comparación con la HRP no conjugada. La actividad enzimática de HRP conjugada con almidón se encontró intacta cuando se aplicó para la decoloración del azul de bromofenol, lo que demuestra su aplicabilidad para el tratamiento de aguas residuales. La inmovilización de HRP en una superficie portadora adecuada facilita la reutilización, se sabe que afecta la actividad y la estabilidad de las enzimas, y su optimización será sin duda el tema de futuros estudios.
2.6.4.- Terapia contra el cáncer. 
Una combinación de HRP y el indol-3- acético o sus derivados están siendo evaluados como agentes para su uso en terapias contra el cáncer. El estudio del fármaco está relacionado con la inducción de ciertas células a apoptosis.
3.- Modelado de la proteína peroxidasa (horseradish peroxidase, EC. 1. 11. 1. 7)
Se realizó el modelado de la proteína mediante el software Swiss Model. Primeramente, se extrajo la secuencia de aa en formato FASTA, de la plataforma de NCBI. Se ejecutó la búsqueda de templados y en base al QMQE, la identidad y cobertura fue elegido el templado a usar. Se eligió uno correspondiente a una peroxidasa. Se analizó el alineamiento del templado con la secuencia. Así mismo se visualizó la estructura cuaternaria y se analizó el gráfico de Ramanchandran correspondiente al modelo obtenido.
Es posible apreciar que el templado elegido tiene una similitud de la identidad del 100% cubriendo toda la secuencia de aa. El valor de QMQE es mayor a 0.9 por lo que puede considerarse que el modelo tiene alta confiabilidad. Mientras que QMEAN posee un valor mayor a -0.75, indicando que el modelo es de calidad aceptable. Los valores de la estimación de calidad global son todos negativos y relativamente cercanos a cero.
Del gráfico de estimación local es posible ver que la mayoría de los residuos de aa poseen puntajes iguales o mayores a 0.8, lo cual indica que poseen alta similitud con el templado usado. Y el puntaje del modelo se encuentra en la zona de la desviación estándar menor a 1. 
 
Como se mencionó anteriormente, en el gráfico general de Ramachandran, se puede ver que la mayoría de los residuos de aa se encuentran agrupados en la zona de láminas beta y hélices alfa, y en menor medida en la zona de loops. Son pocos los residuos de aa localizados fuera de estas tres regiones. El modelo está favorecido en un 97.04% y aunque existen ángulos no permitidos, es posible visualizar el modelo 3D de la proteína. 
Se pueden apreciar cuales son los residuos de aa que tienen ángulos de giro no permitidos o enlaces no tan favorables. 
Considerando que se obtuvo un modelo aceptable de la proteína, se descargó el archivo .pdb, el cual se visualizó en ArgusLab de la siguiente manera.
Referencias
[1] 	Á. C. PEINADO, «PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE UNA PEROXIDASA DE ZANAHORIA,» UNIVERSIDAD DE JAÉN, FACULTAD DE CIENCIAS EXPERIMENTALES, ESPAÑA, 2006.
[2] 	P. M. G. SALAZAR, «ESTUDIO DE LA POLIMERIZACIÓN DE FENOLES UTILIZANDO PEROXIDASAS PRESENTES EN RÁBANO COMÚN (Raphanus sativus var sativus), CON APLICACIÓN EN LA BIORREMEDIACIÓN DE AGUAS RESIDUALES DE UNA EMPRESA TEXTILERA,» ESCUELA POLITÉCNICA DEL EJÉRCITO, DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA , SANGOLQUÍ, 2011.
[3] 	F. Bjorksteb, H. Yliopiston y B. Laitos, «A kinetic Study of the Horse-Radish Peroxidase-Catalyzed Oxidation of Iodide,» 1968.
[4] 	F. J. R. Dueñas, «CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE UN NUEVO TIPO DE PEROXIDASA LIGNINOLÍTICA,» Universidad Complutense de Madrid, Facultad de Ciencias Biológicas, Madrid, España, 1998.
[5] 	S. Rathnamsamy, R. Singh, R. Auxilia y B. N. Vedhahari, «Extraction of peroxidase from various plant sources and its biodegradation studies on phenolic compounds,» BioTechnology: An Indian Journal, 2014. 
[6] 	E. M. B.Sc, «Stability Characteristics and Applications of Native and Chemically-Modified Horseradish Peroxidases,» pp. 8-11, 1996. 
[7] 	P. M. GUTIÉRREZ SALAZAR, «ESTUDIO DE LA POLIMERIZACIÓN DE FENOLES UTILIZANDO PEROXIDASAS PRESENTES EN RÁBANO COMÚN (Raphanus sativus var sativus), CON APLICACIÓN EN LA BIORREMEDIACIÓN DE AGUAS RESIDUALES DE UNA EMPRESA TEXTILERA,» DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA, 2011. 
[8] 	F. W. Krainer y A. Glieder, «An updated view on horseradish peroxidases: recombinant production and biotechnological applications,» springer, vol. 99, p. 1611–1625, 2015.