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Las características de la fase estacionaria varían de acuerdo con
el objetivo perseguido y definen el tipo de cromatografía. Los prin-
cipales son:
— Filtración en gel: La fase estacionaria tiene un tamaño de
poro controlado, de forma que las proteínas se separan for-
mado como base su tamaño molecular por un proceso de fil-
tración molecular. Eluyen primero las más grandes, y se
retrasan las más pequeñas. 
— Intercambio iónico: La fase estacionaria tiene unidos gru-
pos cargados, bien positivos o bien, negativos. Por ello, son
capaces de retener proteínas que tengan carga de signo
opuesto, mientras repelen las del mismo signo, que son rápi-
damente eluídas de la columna. Posteriormente, cambios en
las condiciones iónicas de la fase móvil hacen que las pro-
teínas retenidas se desplacen y eluyan de la columna. Estos
cambios suelen realizarse mediante la aplicación de la fase
móvil con un gradiente de concentración salina o de pH.
— Afinidad: Quizá la más potente por su especificidad, la fase
estacionaria tiene unidos grupos que son reconocidos espe-
cíficamente por la proteína que se pretende purificar. Lo
más utilizado es el reconocimiento de las proteínas con anti-
cuerpos específicos unidos a la fase estacionaria o con lec-
tinas para la unión de glicoproteínas. Cuando eluye la fase
móvil, la proteína que interacciona específicamente con su
anticuerpo es la única que quedará retenida, separándose
del resto de los componentes de la mezcla. Posteriormente
se cambia la fase móvil para que se liberen las proteínas
retenidas.
— Hidrofóbica: La fase estacionaria tiene propiedades hidro-
fóbicas y, por tanto, retiene a las proteínas más afines, como
las de membrana, mientras eluyen las hidrofílicas. Al igual
que el intercambio iónico, cuando se cambia la fase estacio-
naria para disminuir las interacciones hidrofóbicas, se pro-
duce la liberación de las proteínas retenidas. La cromato-
grafía hidrofóbica realizada a alta presión y con fases
estacionarias de condiciones mecánicas y tamaño de partí-
cula muy especiales, se denomina también cromatografía en
fase inversa y es idónea para la separación de proteínas o
péptidos previos a su caracterización por espectrometría de
masas (véase más adelante).
En los casos de aplicación al análisis proteómico, se suele realizar
una cromatografía (bidimensional) o multidimensional. La bidi-
mensional suele consistir en una primera cromatografía de inter-
cambio iónico seguida de una segunda hidrofóbica en fase inversa.
En el caso de las multidimensionales, el fraccionamiento será mejor,
pero también aumentan las pérdidas y la complejidad del proceso y
pueden consistir, por ejemplo, en varios tipos de cromatografía en
HPLC con equipos que permitan controlar el flujo, la presión o la
composición de la fase móvil. 
Las principales ventajas de la cromatografía radican en que
puede detectar proteínas ácidas, básicas, grandes, pequeñas, lipo-
proteínas, etcétera. En algunos casos es más sensible que la 2D-
PAGE, que se comentará posteriormente, y entre sus inconvenientes
se encuentran su menor resolución en el caso de las proteínas ínte-
gras y el hecho de que durante la cromatografía pueden perderse
isoformas de las proteínas.
Aunque se puede intentar la separación directa de proteínas
íntegras, suele ser más eficaz realizar una digestión tríptica previa
con el fin de fraccionar la mezcla de péptidos. Ello permite realizar
la conexión en continuo del eluido del cromatógrafo con el espec-
trómetro, siendo este diseño apropiado para análisis como los cono-
cidos como etiqueta de secuencia (peptide tagging, PT), con equi-
pos ESI-IT-MS/MS (ionización por electrospray, ESI, detección por
trampa de iones (IT) y análisis masas/masas (MS/MS). 
Electroforesis 
Se basa en la exposición de mezclas proteicas a un campo eléctrico,
en un soporte semisólido y poroso. Cada proteína emigra al polo de
carga opuesta, con una movilidad que depende de la relación entre
su carga y su masa. El medio más utilizado es el gel de poliacrila-
mida, controlable en cuanto a condiciones de poros y pH, que posee
la consistencia adecuada para que una vez realizada la separación,
se puedan revelar las proteínas, identificarlas, cuantificarlas y trans-
ferirlas a un segundo soporte, generalmente papel (en la técnica
denominada Western).
La electroforesis se puede utilizar como técnica de estudio de
cualquier molécula cargada, y de hecho es también muy utilizada en
el campo de los ácidos nucleicos. En este caso el gel soporte más
utilizado suele ser agarosa, sobre todo para cadenas grandes, aunque
la poliacrilamida es también de gran utilidad si los fragmentos son
pequeños, como por ejemplo ocurre cuando se trata de secuenciar
ADN. Las cubetas de agarosa y el sentido de la electroforesis suele
ser horizontal, mientras que los geles de poliacrilamida suelen mon-
tarse en vertical. Asimismo, como complemento a las técnicas más
sofisticadas relacionadas con la cuantificación de los ácidos nuclei-
cos, como la RT-PCR, se utilizan algunas versiones sofisticadas de
electroforesis, como la electroforesis capilar.
SDS-PAGE. Volviendo a las proteínas, los geles de poliacrilami-
da como método rutinario de separar y purificar proteínas o, también,
como criterio de pureza y para determinar la masa molecular de estas
moléculas, fueron introducidos por Laemmli hace más de 30 años.
Laemmli también estandarizó las condiciones para separar de forma
sistemática proteínas según su tamaño por SDS-PAGE monodimen-
sional (1-D). El rango de separación es aprox. de 1 hasta 300 kDa. En
esta técnica, las proteínas se desnaturalizan por el calor y se tratan
con agentes disociantes. El SDS ayuda a esta desnaturalización, al
tiempo que las solubiliza en micelas y les confiere a todas carga
negativa para que emigren al ánodo, independientemente de su punto
isoeléctrico (pI). La desagregación de la estructura cuaternaria en
subunidades se completa con la presencia de β-mercaptoetanol, que
rompe puentes disulfuro y asegura la obtención de monómeros, para
su migración en orden inverso a su masa molecular.
2D-PAGE. Los abordajes proteómicos ambiciosos necesitan
tipos de electroforesis más sofisticadas y de mayor poder de resolu-
ción. Entre ellas destaca la electroforesis bidimensional 2D-PAGE,
consistente en dos electroforesis consecutivas. En la 2D-PAGE, la
primera electroforesis que se realiza es en realidad un isoelectroen-
foque, en el que las proteínas sin disociar ni tratadas con detergente
se separan según su pI, mediante la aplicación de la muestra en unas
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