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un método rápido y muy eficaz, pero con limitaciones. El conjun- to de fragmentos peptídicos que resultan de la proteína tras pro- teólisis generalmente tríptica y que se comparan con los fragmen- tos teóricos de proteínas en las bases de datos (NCBI; Celera), mediante varios algoritmos desarrollados a tal efecto. Tiene poco rendimiento cuando se parte de poca cantidad de proteínas o de mezclas complejas. Incluso para las proteínas mayoritarias, la ionización de los péptidos es selectiva y no es cuantitativa. • PT (peptide tagging): Identificación mediante etiqueta de secuen- cia. Se realiza por secuenciación total o parcial, normalmente con ESI- MS/MS. Los espectrómetros con posibilidad de MS/MS per- miten secuenciar fragmentos peptídicos, puesto que analizando par- tes del fragmento en cuestión se tiene capacidad de llegar hasta aminoácidos libres y realizar una secuenciación. Esta técnica se ini- ció en espectrómetros con trampas de iones, que como su nombre indica permiten atrapar un determinado ion peptídico, pero, poste- riormente, también se ha conseguido llevar a cabo en espectróme- tros con triple cuadrupolo con cámara CID (disociación inducida por colisión), en híbridos cuádrupolo-TOF (Q-TOF) e, incluso, en espectrómetros MALDI-TOF-TOF, mediante distintos diseños de ingeniería desarrollados debido a la competencia de tecnología y patentes entre los fabricantes de espectrómetros de masas. Bioinformática La búsqueda de péptidos trípticos en bases de datos públicas (como NCBI) se realiza mediante diversos programas de búsqueda y acce- so, como el Mascott o el Spectrum Mill. En mezclas complejas, lo normal es que las proteínas más abundantes enmascaren las otras y hay que eliminarlas si se quiere caracterizar las minoritarias. El caso más desarrollado es el suero humano, donde existen una decena de proteínas que suponen más del 90% del total, mientras que unas 25 suman el 99% del contenido proteico total, quedando el 1% restan- te para unas 200 proteínas. Cuando se quiere analizar una de esas minoritarias, algunas casas comerciales han desarrollado columnas de cromatografía que absorben y eliminan las proteínas mayorita- rias, facilitando todo el estudio posterior y la identificación de esas proteínas minoritarias. 750 | Apéndice IV Figura anexo IV-4. Secuenciación de un péptido por fragmentación:Los iones troncales del péptido se localizan por su relación de masa/carga, y las series Y o B se identifican por las diferencias de masa, que debe corresponder a la masa del aminoácido perdido menos 18 unidades. El inicio de la serie B se localiza por la diferencia con el ion troncal de mayor tamaño, puesto que corresponde a la masa molecular del aminoácido C-terminal menos 18 unidades (H y OH) debido a su pérdida por ruptura del enlace peptídico. En este caso, la diferencia entre el troncal +1 y B7 corresponde a la K (indistinguible de la Q, puesto que ambos tienen 146 de masa). La serie Y se construye análogamente, pero a partir del extremo N-terminal. Obsérvese que no todos los representantes de la serie dan señal, lo que dificulta la interpretación del espectrograma. 200 300 400 500 600 700 B2 201.0 B3 287.8 B4 401.5 B5 489.0 B6 585.5 B7 642.8 Y3 301.5 Y4 389.0 Troncal (+2) 394.5 Y5 501.5 Y6 588.5 Y7 701.5 S(L/I)S(L/I)SPG(K/Q)Espectro de masas del péptido: 800 Troncal (+1) 789 43 Apéndice IV 8/4/05 13:18 Página 750
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