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23.3.3 Obtención del ADN recombinante
Como ya se ha dicho, los fragmentos del ADN que se quiere
clonar deben unirse de forma covalente, in vitro, a un vector
mediante una ADN ligasa (Fig. 23-5a). La reacción de unión
es más sencilla si los fragmentos de ADN de diferente origen,
obtenidos por digestión con endonucleasas de restricción apro-
piadas, presentan extremos cohesivos compatibles que formen
apareamientos específicos. La ADN ligasa también es capaz
de unir extremos romos, aunque con menor eficacia.
En determinados casos, pueden transformarse extremos
romos en cohesivos, mediante la adición de colas homopoli-
méricas complementarias en los extremos de los fragmentos a
unir, catalizada por la enzima transferasa terminal (Fig. 23-
5b). También pueden crearse extremos cohesivos ligando, a
fragmentos de extremos romos, pequeños segmentos de ADN
bicatenario (conectores) que posean secuencias de restricción
generadoras de extremos cohesivos, y tratando los productos
obtenidos con la endonucleasa apropiada (Fig. 23-5c).
23.4 VECTORES Y GENOTECAS
23.4.1 Vectores
Para la clonación de un gen en bacterias se utilizan diferen-
tes tipos de vectores, fundamentalmente plásmidos y fagos, o
derivados de éstos, como los cósmidos. Posteriormente se
han desarrollado otros vectores, como los BAC y los YAC
(cromosomas artificiales de bacterias y cromosomas artifi-
ciales de levaduras, respectivamente), adecuados para clonar
fragmentos muy grandes de ADN.
Los plásmidos son moléculas pequeñas de ADN circular
que se replican en las bacterias con independencia del cro-
mosoma bacteriano. Un plásmido sin modificar, o recombi-
nado con pequeños insertos, puede introducirse en una bac-
teria mediante distintas técnicas de transformación, en las
que sólo una pequeña fracción de las bacterias capta el ADN
plasmídico.
Para ser útil como vector, un plásmido debe reunir varias
características, entre las que se incluyen: a) un tamaño ade-
cuado que permita la incorporación del inserto y su entrada
en la célula; b) un origen de replicación reconocido por la
bacteria hospedadora, que permita al plásmido replicarse en
dicha bacteria y transmitirse a su descendencia; c) marcado-
res para la selección de las bacterias que lo capten (como los
genes de resistencia a antibióticos comentados anteriormen-
te), y d) una o varias secuencias diana para endonucleasas de
restricción, que al cortar y linearizar el plásmido generen
extremos para ligar el inserto (Fig. 23-6). 
Actualmente existen diversos plásmidos disponibles, que
permiten la clonación de insertos de hasta 15 kb. Algunos
poseen, además de las características anteriores, señales de
transcripción y traducción que dirigen la expresión de la pro-
teína codificada por el inserto. Se trata entonces de vectores
de expresión. Otros contienen, además del origen de replica-
ción reconocido por la bacteria hospedadora, elementos para
su multiplicación en células de eucariotas, y pueden utilizar-
se indistintamente en bacterias o en eucariotas, o transferirse
de un tipo a otro de huésped.
Para clonar fragmentos mayores (hasta unas 25 kb), se
utilizan vectores derivados del fago λ. El ADN del fago λ se
empaqueta con proteínas virales y forma partículas infec-
ciosas que introducen su ADN en E. coli y se multiplican
dentro de la bacteria. Sólo dos tercios, aproximadamente,
del genoma del fago son esenciales para su multiplicación.
El otro tercio puede eliminarse y reemplazarse por ADN
foráneo, siempre que éste tenga un tamaño que permita al
ADN recombinante empaquetarse in vitro en presencia de
extractos con las proteínas necesarias para generar partícu-
las virales infecciosas. El tratamiento de un césped bacte-
riano, creciendo sobre una placa de agar, con partículas
infecciosas producirá «calvas» formadas por la lisis de las
bacterias infectadas. La selección de las calvas de lisis pro-
cedentes de un determinado fago recombinante puede rea-
lizarse con una sonda adecuada, tal y como ya hemos des-
crito.
Los cósmidos son vectores recombinantes que reúnen
características de plásmidos (origen de replicación, marca-
dores y secuencias de restricción) y del fago λ (secuencia cos
necesaria para el empaquetamiento). Permiten clonar frag-
mentos largos de ADN (hasta 45 kb). El ADN recombinante
puede introducirse de forma eficaz (como un fago) en la
célula bacteriana, y multiplicarse y seleccionarse como un
plásmido.
Algunas aplicaciones específicas cada vez más frecuen-
tes requieren la clonación de fragmentos de ADN mucho
mayores que los compatibles con los vectores tradicionales.
Por ello se han desarrollado dos nuevos tipos de vectores, los
BAC y los YAC. Los YAC son los de mayor capacidad, y
aceptan insertos de más de 1000 kb. Se emplean utilizando
como huésped Saccharomyces cerevisiae, la levadura común
de panadería. Contienen centrómeros y telómeros que les
permiten replicarse en la levadura como un cromosoma nor-
mal.
23.4.2 Insertos y genotecas
Los insertos pueden ser esencialmente de dos tipos: ADNc o
fragmentos de ADN genómico. Los ADNc se obtienen a par-
tir del ARNm mediante un conjunto de enzimas específicas:
transcriptasa inversa, ARNasa H y ADN polimerasa (Fig.
23-7).
Anális is molecular del genoma | 407
23 Capitulo 23 8/4/05 11:42 Página 407
	BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR (...)
	CONTENIDO
	PARTE II: BIOLOGÍA Y PATOLOGÍA MOLECULAR
	SECCIÓN V GENOMA, PATOLOGÍA MOLECULAR Y TERAPIA GÉNICA
	23 ANÁLISIS MOLECULAR DEL GENOMA
	23.3 MANEJO DEL ADN
	23.3.3 Obtención del ADN recombinante
	23.4 VECTORES Y GENOTECAS
	23.4.1 Vectores
	23.4.2 Insertos y genotecas