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426 | Genoma, patología molecular y terapia génica
Recuadro 24-1.
ESTUDIO DE LAS
INTERACCIONES ENTRE LAS
PROTEÍNAS MEDIANTE LA
TÉCNICA DEL DOBLE HÍBRIDO
DE LEVADURAS
El conocimiento del genoma de la leva-
dura Saccharomyces cerevisiae y la
metodología disponible para el estudio
molecular de este organismo ha permiti-
do el desarrollo de métodos como el del
doble híbrido, que posibilita definir
diferentes aspectos de la interacción
proteína-proteína como: a) el estudio de
las interacciones entre un par de proteí-
nas que se sospecha que pueden interac-
cionar; b) establecer qué proteína entre
las de un conjunto de proteínas Y (o
«presas») interacciona con una proteína
específica de interés (denominada
«cebo»), y c) determinar cuáles son los
dominios responsables para la interac-
ción entre dos proteínas que se sabe que
interaccionan.
El método se basa en las propieda-
des de un activador transcripcional, la
proteína Gal4, formada por dos domi-
nios fundamentales independientes: el
dominio de unión a promotores o
secuencias de ADN específicas (domi-
nio de unión a ADN o DUA) y el domi-
nio de activación (DA). Las secuencias
génicas codificantes de ambos dominios
se pueden separar y unirse a las secuen-
cias de los genes X e Y, cuyas proteínas
se quiere determinar si interaccionan.
Se construyen, pues, dos tipos de plás-
midos codificantes de proteínas: uno,
que codifica el dominio DUA fusionado
al gen de la proteína X («cebo») que al
expresarse dará lugar a una proteína
híbrida DUA-X, mientras que el otro
contiene la secuencia codificante del
dominio DA fusionado al gen de la(s)
proteína(s) Yx («presas»), que dará
lugar a proteínas recombinantes híbri-
das DA-Y (en este grupo habrá tantos
plásmidos recombinantes como «pre-
sas» a analizar). Un plásmido de cada
tipo se introduce en el interior de la
levadura que contiene la secuencia de
unión a Gal4 asociada a un gen «dela-
tor», cuya expresión es capaz de de-
sarrollar una actividad enzimática que
puede determinarse fácilmente median-
te el desarrollo de un color. La activa-
ción del gen delator se producirá cuan-
do las dos proteínas híbridas sean
capaces de interaccionar, ya que enton-
ces es cuando se reconstituye la proteí-
na Gal4 funcional.
En la Figura 24-4 a se muestra la acti-
vación del gen delator (p. ej., β-galactosi-
dasa) cuando la proteína Gal4 se une a
la secuencia específica del ADN. En la
Figura 24-4b se esquematiza que de
entre tres proteínas híbridas tipo presa
(Y1, Y2, Y3) sólo en el caso de Y2 se pro-
duce la activación del gen delator, debi-
do a la interacción entre la proteína
«cebo» X y su «presa» correspondiente
Y2.
Figura 24-4. Determinación de interacciones entre proteínas mediante el método
de doble híbrido de levadura. a) Un factor de transcripción formado por dos domi-
nios (DUA: dominio de unión a ADN; DA: dominio de activación) se une a su pro-
motor y estimula la transcripción de un gen fácilmente identificable (gen delator).
b) Se forman construcciones del DUA con la proteína cebo y de DA con el conjun-
to de proteínas (presas) que pueden interaccionar con el cebo. La interacción
correcta (X-Y2) genera un factor de transcripción híbrido capaz de activar el gen
delator. La conclusión es que X interacciona con Y2, pero no con Y1 ni con Y3.
a)
b)
ARNm
Gen delator
Secuencia de
unión al ADN
ARNm
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