Métodos de Evidencia diagnóstica

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Evaluación en el laboratorio ( in Vitro ) del sistema inmune
Instituto Superior de Ciencias Médicas.
Departamento de Inmunología
Autores:
Dr. Antonio González Griego, Esp. 2do Grado, Prof. Titular y Principal
Inmunología
Dra. Victoria Ramírez Albajés. Esp. 2do Grado Prof. Instructor Inmunología
Dra. Victoria E. González Ramírez. Esp, 2do Grado Prof. Auxiliar Inmunología
Dr. Josué Acosta Acosta, Esp, 2do Grado Prof. Auxiliar Inmunología.
Lic. Antonio Melchor Rodríguez, Prof. Auxiliar Inmunología.
ATD. Adonay Martínez Perera
INTRODUCCIÓN— la mayoría de las inmunodeficiencias frecuentemente
solicitan atención clínica debido a un aumento en la incidencia o severidad de
enfermedades infecciosas más allá de lo que es considerado "normal." Estas
enfermedades también pueden presentarse clínicamente con síntomas que no
se originan de trastornos de órganos o células directamente relacionados al
sistema inmune. La evaluación del laboratorio de inmunodeficiencia
sospechada es guiada por las circunstancias particulares de la presentación del
paciente, como la edad de ataque de enfermedad, la naturaleza de las
infecciones (viral, bacteriano, micótico) y cualquier síntoma o signo no
inmunológico asociado.
Las pruebas normalmente usadas se revisarán; estas pruebas deben ser
suficientes para la evaluación inicial de la mayoría de casos de deficiencia
inmune que se originan de trastornos linfocitarios [1].
El diagnóstico definitivo frecuentemente requiere métodos moleculares
especializados que no están disponibles generalmente en todos los
laboratorios . Un directorio de genética molecular y otro especializado para
inmunodeficiencias puede encontrarse en el Internet en:
http://bioinf.uta.fi/IDdiagnostics [2].
INMUNIDAD CELULAR—La inmunidad celular específica es mediada por células
T, y los defectos que afectan a estos linfocitos justifican las deficiencias
inmunes más severas. Debido a que la producción de anticuerpos requiere la
función intacta de las células T, la mayoría de las alteraciones de las células T
llevan a inmunodeficiencias combinadas (celular y humoral). Cualquier niño que
presenta enfermedades virales y/o bacterianas recurrentes o severas o las
infecciones oportunistas en el primer año de vida requiere evaluación de
número y función de células T. Consideraciones similares se aplican a los
adultos con estos tipos de infecciones. En el grupo de edad pediátrico, la
mayoría de los casos son debidos a deficiencias inmunes congénitas. Las
causas secundarias mas importantes están relacionadas con trastornos del
metabolismo proteico (no ingestión, trastornos digesto-absortivos, déficit en
síntesis o aumento en pérdidas), otras causas de trastornos secundarios son
infección por VIH y iatrogénicas debido a terapia de enfermedades auto
inmunes, trasplantes y enfermedades malignas.
El hemograma completo con diferencial debe realizarse en todos los casos. Se
establecen bien rangos normales para las poblaciones de células (linfocitos) en
niños y adultos [3,4]. En muchas enfermedades, las poblaciones celulares son
inicialmente normales, disminuyendo posteriormente.
El conteo diferencial de células sanguíneas establece la presencia o ausencia
de linfopenia, lo cuál ayuda grandemente al diagnóstico. Sin embargo, un solo
hallazgo de linfopenia debe interpretarse con cautela, ya que las linfopenias
transitorias frecuentemente se encuentran en una variedad de enfermedades
infecciosas comunes [5].
Por otro lado, no deben ignorarse linfopenias significativas, ya que estas
pueden ser la primera evidencia de síndrome de inmunodeficiencia celular [6].
También es de señalar que el conteo linfocitario normal en infantes es mas alto
que en niños mayores y adultos debido a la migración de linfocitos
inmunocompetentes de los órganos linfoides centrales (médula y timo) a los
órganos linfoides periféricos constitutivos (bazo y ganglios linfáticos) y de ellos
al sistema de piel y asociado a mucosas (respiratorias, digestivas y
genitourinarias).
En un infante con cualquier infección significativa y un conteo total de linfocitos
< 3,000 cel /mm cúbico, está indicada la citometría de flujo. Una linfopenia
persistente requiere investigación extensa de función inmune.
La determinación de subpoblaciones de linfocitos por citometría de flujo—es
apropiada en la evaluación inicial de todos los pacientes con infecciones
oportunistas o linfopenias severas o persistentes [7].
Las infecciones oportunistas no son evidentes tempranamente entre los
pacientes con variantes más ligeras de síndromes de inmunodeficiencias
combinadas. Estos niños frecuentemente tienen infecciones bacterianas
recurrente como sinusitis, neumonías o se presentan como casos severos de
infecciones comunes de la niñez; estas consideraciones se aplican de modo
similar a los adultos. La mayoría de estos pacientes se pueden detectar
inicialmente con un hemograma con diferencial, medida de inmunoglobulinas
de suero y sobre todo con respuestas de anticuerpos específicos a pruebas
cutáneas in vivo. Cuando estas pruebas no son diagnósticas de un síndrome
particular o cuando están presentes marcadas anormalidades, el análisis de
subconjuntos de los linfocitos por citometría de flujo debe emprenderse.
  Método—Para el análisis por citometrìa de flujo, las células de la sangre son
mezcladas con anticuerpos monoclonales marcados con fluorocromos que se
unen como ligandos a receptores de superficie de células que distinguen varias
categorías funcionales de linfocitos. El citómetro de flujo detecta la
fluorescencia y se realiza el conteo porcentual de los distintos tipos de
linfocitos.
Es indispensable que el hemograma y diferencial se realicen en la muestra de
sangre obtenida en el momento del análisis de citometría de flujo, o el propio
citómetro sea usado para determinar el número de los linfocitos. Este análisis
permite el cálculo de los números absolutos de cada subconjunto de linfocitos.
Es posible que el porcentaje de un subconjunto particular sea anormal mientras
el número total de células está dentro del rango normal, y vise-versa. Tabla 1
El análisis de subconjuntos de linfocitos puede ser diagnóstico en muchos
casos de inmunodeficiencias y para varias formas de linfoma. En cabala 2 se
resumen alteraciones en varias poblaciones del linfocitos en varias
enfermedades que ocasionan deficiencia inmune. Tabla 2.
Mientras ciertos defectos inmunes están asociados con modelos
característicos de subconjuntos de linfocitos, las poblaciones de linfocitos
pueden parecer incluso ser completamente normales con evidencia clínica de
trastornos inmunes significativos. Recíprocamente, como con números de
linfocitos totales, los subconjuntos de los linfocitos pueden estar
profundamente alterados por enfermedades infecciosas comunes y otros
factores [5,8]. Así, con propósitos diagnósticos, los datos de citometría de flujo
deben ser considerados junto con las pruebas funcionales del sistema inmune.
Prueba in vivo de respuesta inmune. Esta prueba mide la respuesta al reto
antigénico de una inyección intradérmica de un antígeno al que un individuo ya
ha sido expuesto (respuesta de memoria).
Una respuesta positiva a la inyección del antígeno intradérmica requiere
captación y procesamiento de antígeno por las células presentadoras de
antígeno, su interacción con células T CD4+ colaboradoras, producción del
citoquinas por células T, y el reclutamiento subsiguiente y activación de
monocitos y macrófagos. Así, la prueba cutánea es un indicador sensible de
inmunidad celular intacta, pero los resultados negativos deben interpretarse
con cautela. La respuesta es inestable en niños menores de un año de edad
(incluso con exposición anterior al antígeno), y se suprime a menudo durante
infecciones virales y bacterianas (incluso con organismos atenuados como en
las vacunas combinadas contra sarampión, rubéola y paperas). La reactividad
también se deprime por drogas anti-inflamatorias (corticosteroides) y otros
inmunosupresores (Ej.: ciclosporina).
   Método—Para la valoración de respuestasa las pruebas cutáneas, se puede
usar inyección intradérmica de 0.1ml de toxoide tetánico (fluido, 10 LFU/mL,
Wyeth-Ayerst), antígeno de paperas (Antígeno-MSTA de prueba cutánea de
paperas, Connaught), y antígeno de Cándida (Antígeno de prueba cutánea de
monilia, dilución 1:200, Miles).
La respuesta se mide 48 a 72 horas después de la inyección. Induración de más
de 5 mm es considerada positiva en todos los casos. En niños, induración de
más de 2 el mm se acepta a veces como positiva [7]. Eritema solo no indica una
reacción positiva.
Las ventajas principales de la prueba cutánea son su facilidad y economía; es
una prueba de la gran utilidad en muchos casos de sospecha de
inmunodeficiencia celular. Si una prueba cutánea es negativa debe seguirse al
paciente o repetir la prueba (a menudo siguiendo a una dosis de refuerzo), o
realizar la medición de poblaciones del linfocitos por citometría de flujo,
combinada con ensayo in vitro de función de células T. El ensayo in vitro
(particularmente la estimulación con mitógenos) es menos sensible a
interferencias durante enfermedades intercurrentes o por drogas.
Estudios in vitro de función de células T. —Los estudios in vitro de función de
células T miden la proliferación de células T en sangre periférica en respuesta
a mitógenos (tales como fitohemaglutininas de lectinas de plantas,
concanavalina A, o pokeweed mitogen) o a antígenos específicos (tales como
toxoide tetánico o diftérico o antígenos de C. albicans). También puede medirse
la proliferación en respuesta a linfocitos alogénicos (Ej. Cultivos mixtos de
linfocitos).
En estas pruebas, las células mononucleares de sangre periférica del paciente
(linfocitos y monolitos purificados) se incuban con la sustancia de prueba o
células durante tres a seis días. Durante las últimas 24 horas del cultivo, se
agrega timidina tritiada al medio. Las células en división (células de T)
incorporan la timidita en su ADN. La magnitud de la proliferación es
determinada midiendo la toma de radioactividad por las células. La prueba se
interpreta como negativa, parcial, o normal por comparación con el control
normal de linfocitos ensayado simultáneamente.
Muchos laboratorios también informan los resultados como índice de la
estimulación (IE). Ésta es la proporción de radioactividad (como cuentas por
minuto, o CPM) con estímulo dividido por las CPM sin el estímulo (fondo).
  Respuesta a mitógenos—La Mayoría de los mitógenos requieren células
presentadoras de antígeno funcionales para la estimulación de células T,
aunque los mecanismos de presentación y procesamiento de antígeno son
evitados. Los mitógenos son estimulantes poderosos para las células T, y
pueden evaluarse respuestas en los pacientes de cualquier edad, sin tener en
cuenta el estado de la inmunización.
Dependiendo del mitógeno (fitohemaglutinina o PHA es el mas frecuentemente
usado) y el laboratorio, el rango de CPM informado para controles normales es
aproximadamente 50,000 a 300,000 y el IE entre 10 y 200. Los resultados se
interpretan comparando con los controles dando como normal (>50 por ciento
del control), bajo (25 a 50 por ciento), muy bajo (10 a 25 por ciento), o ausente
(< 10 por ciento). Los resultados expresados como IE varían ampliamente entre
los laboratorios. En general, un IE < 10 por ciento pueden ser considerados
como ninguna respuesta.
Proliferación disminuida o ausente indica una alteración seria de la función de
las células T. Las respuestas a mitógenos están deprimidas severamente en la
inmensa mayoría de los pacientes con inmunodeficiencia combinada severa o
SIDA. En comparación, la repuesta puede ser parcial o normal en los síndromes
más ligeros de inmunodeficiencia combinada, en deficiencia principalmente
humoral, o en pacientes que reciben terapia inmunosupresora.
 Respuesta a antígenos específicos—los tests antígeno específicos son más
sensibles que los ensayos de mitógenos como indicadores de defectos de
función de celúlas T, puesto que los mecanismos de activación son más
complejo que para mitógenos. Estas pruebas requieren procesamiento del
antígeno y células presentadoras de antígeno, pero el reclutamiento de células
T efectoras (como ocurre in vivo con las pruebas cutáneas de respuesta celular)
no es necesario. Al igual que en las pruebas cutáneas de respuesta celular in
vivo, in vitro las pruebas de proliferación de antígeno específicas no son útiles
en infantes o otros pacientes que no han completado una serie primaria de
inmunizaciones con la prueba cutánea.
Los toxoides tetánico y diftérico y monilia (Cándida) son antígenos
frecuentemente usados para este ensayo. Puesto que solo un número
pequeño de células responde, los cultivos deben mantenerse más mucho
tiempo, y la incorporación de radioactividad es más baja que para el estímulo
del mitógeno. Se informan a menudo resultados expresados como CPM de
5,000 a 50,000; los resultados como Índice de estimulación generalmente van
de 4 a 50. Debido a la variación muy grande en la frecuencia de células de T
antígeno-específicas en la sangre de controles sanos, el índice de estimulación
es a menudo muy importante para la interpretación. En general, un índice de
estimulación para un antígeno específico >4 se considera adecuado.
En muchos casos de deficiencia inmune combinada, las respuestas a
antígenos específicos están disminuidas o incluso ausentes mientras que las
respuestas a mitógenos permanecen intactas. En deficiencia inmune
secundaria, las respuestas a antígenos específicos se suprimirán también
generalmente más fácilmente que las respuestas a mitógenos. Como con la
prueba cutánea, una inmunización de refuerzo seguido de un ensayo de
proliferación in vitro, puede detectar una respuesta significativa
INMUNIDAD HUMORAL—Una panhipogammaglobulinemia es un sello de la
mayoría de las formas de deficiencia inmune combinada severa. En otras
deficiencias inmunes combinadas, así como en varias inmunodeficiencias
predominantemente humorales, hay alteraciones características en el perfil de
isotipos de inmunoglobulinas (Ig) que pueden ayudar en el diagnóstico.
Clínicamente, la deficiencia de anticuerpos más frecuentemente resulta en
infecciones seno pulmonares recurrentes y severas con cepas bacterianas
encapsuladas.
Medida de inmunoglobulinas del suero—la medida Rutinaria de IgG, IgA, e IgM
es útil en todos los casos de deficiencias de anticuerpos sospechados, y en
niños mayores de un año de edad, la medición de subclases de IgG puede
considerarse pero puede ser polémico. La medición de IgE también debe
realizarse puesto que los niveles séricos pueden alterarse en modelos
característicos que pueden ayudar en el diagnóstico. La medida en suero de IgD
no es útil para el diagnóstico de deficiencia inmune.
Medida en suero del título de los anticuerpos específicos—La medida en suero
de niveles de anticuerpos específicos (normalmente IgG) en respuesta a la
inmunización intencional o a la infección natural es el mejor acercamiento para
determinar la integridad de la inmunidad humoral por dos razones:
 Clínicamente el deterioro significativo en respuestas de anticuerpos
específicos puede ocurrir con niveles séricos normales de Ig.
 Respuestas normales a la inmunización pueden ocurrir con niveles
subnormales de Igs totales o de sus subclases.
Como con las respuestas in vitro a antígenos por las células T, una exposición
anterior (previa) al inmunógeno es necesaria para la medición en suero de
niveles de anticuerpos específicos útiles. Los antígenos normalmente
empleados son aquéllos usados en la inmunización primaria. Éstos incluyen
toxoides tetánico y la diftérico y el polisacárido capsular del hemófilus
influenzae tipo B (HIB), y los polisacáridos capsulares tipo específicos de
pneumococcus. En casos en los que los resultados son equívocos, una dosis
de inmunización de refuerzo (booster) con medición repetida cuatro semanas
mas tarde, puede ser útil.
Aunque el HIB y los antígenos capsulares del neumococo son polisacáridos, las
vacunas actuales conjugan esta mitad avarias moléculas de proteína como
toxoide diftérico (Hibtiter, Lederle-Praxis; Prohiba, Connaught; Prevnar, Wyeth-
Ayerst) y la proteína de la membrana exterior complejo de meningococo
(Pedvaxhib, Merck). Por consiguiente, la medida de anticuerpos al polisacárido
capsular, o a los subtipos del neumococo contenidos en Prevnar (una vacuna
del pneumococco), evalúa los mismos mecanismos de la respuesta inmune
que ocurren en otras respuestas a antígenos proteicos.
Las interacciones celulares que llevan a la producción de anticuerpos
antipolisacáridos difieren de aquéllas de la respuesta humoral a antígenos
proteicos. Aunque los detalles de estas diferencias no son completamente
entendidos, está claro que la deficiencia selectiva a antígenos carbohidratos
existe. Para la valoración de respuestas a antígenos de polisacáridos, la
medición de títulos de anticuerpos a varios serotipos de neumococo
(Pneumovax 23, Merck; Pnu-imune 23, Lederle) puede ser útil en adultos y niños
de más de dos años (la respuesta no es confiable en niños menores).
Las isohemaglutininas son anticuerpos generados en respuesta a polisacáridos
de la flora intestinal que tiene reacción cruzada con antígenos de los eritrocitos
de los grupos A y B. Ellos generalmente aparecen en la sangre a los seis meses
de edad. La determinación de niveles de isohemaglutininas puede ser útil en
niños mayores que no tienen el tipo de sangre AB [9]. Generalmente se
considera que la respuesta a la vacuna es el indicador más confiable de función
inmune humoral intacta.
Los métodos para determinar niveles séricos de Igs incluyen nefelometría,
turbidimetría, inmunodifusón radial, métodos inmunoenzimáticos y
radioinmunoensayo. El método usado depende del laboratorio y de la clase o
subclase de anticuerpo que se va a medir. Se usan métodos similares para la
medición de títulos de anticuerpos antígeno-específicos. Los laboratorios
pueden determinar sus propios rangos de referencia, o usar datos
proporcionados por fabricantes de reactivos comerciales. Sobre todo con
respecto a niveles séricos de inmunoglobulinas, es crítico que los rangos
normales de referencia usados estén ajustados a la edad.
Tablas 3 y 4 resumen anormalidades de laboratorio de inmunidad específico
celular y humoral en varios desórdenes de inmunodeficiencias humorales y
combinadas severas.
DETECCIÓN de PORTADOR DE ANOMALÍAS GENÉTICAS—Detectar la presencia
de portar anomalías genéticas en los padres de niños inmunodeficientes es
crítico para el consejo exacto con respecto al riesgo de concebir en el futuro
niños afectados. La determinación del estado de portador en padres también
puede ayudar en el diagnóstico de formas particulares de inmunodeficiencia,
particularmente en inmunodeficiencias unidas al cromosoma X, caso en que
aproximadamente la mitad de las madres son portadoras.
Análisis de inactivación del cromosoma X—Temprano en el desarrollo de
embriones hembras, las células al azar inactivan uno de los dos cromosomas
X (materno o paterno), un proceso llamado lionización. Todas las células que
se desarrollan seguidamente retienen el mismo modelo de inactivación. Como
resultado, aproximadamente la mitad de las células de hembras totalmente-
desarrolladas tienen inactivado el cromosoma de X materno, y la mitad del
cromosoma X paterno.
Si uno de los cromosomas X porta un defecto genético que previene el
desarrollo de un tipo particular de célula, entonces todas las células
supervivientes de un linaje particular inactivarán sólo el cromosoma "malo".
Como un ejemplo, los linfocitos B en la agammaglobulinemia unida al X no
pueden desarrollar precursores que inactiven el cromosoma X "bueno". Así, los
portadores de la mutación genética tendrán linfocitos B en que sólo el
cromosoma X "malo" es inactivado. Esto se llama inactivación de cromosoma X
no al azar. Si los dos cromosomas X maternos pueden ser distinguidos por
marcadores genéticos unidos al gen afectado, entonces el modelo de
inactivación del cromosoma de X en varios tipos de células puede estudiarse
[10].
Estos análisis pueden aplicarse a las madres de niños varones afectados para
distinguir casos esporádicos de los casos heredados (donde hay duda), y para
proporcionar consejo genético a las hermanas hembras de madres de niños
afectados y a la descendencia hembra de portadores. Determinando que
forma(s) de marcador (es) están asociadas con el gen defectivo en el portador,
también es posible establecer el origen del cromosoma X en fetos masculinos.
Los análisis similares son útiles con otros desórdenes de inmunodeficiencias
unidas al X como el síndrome de Wiskott-Aldrich, e inmunodeficiencias severas
combinadas unidas al X.
REFERENCIAS
1.  Detrick, B, Hamilton, RG, Rose, NR (Eds). Manual of Clinical Laboratory
Immunology, 6th Edition. ASM Press, Washington, DC 2002.
2.  Samarghitean, C, Valiaho, J, Vihinen, M. Online registry of genetic and clinical
immunodeficiency diagnostic laboratories, IDdiagnostics. J Clin Immunol 2004;
24:53.
3.  Comans-Bitter, WM, de Groot, R, van den Beemd, R, et al.
Immunophenotyping of blood lymphocytes in childhood: reference values for
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4.  Shearer, WT, Rosenblatt, HM, Gelman, RS, Oyomopito, R. Lymphocyte
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AIDS clinical trials group P1009 study. J Allergy Clin Immunol 2003; 112:973.
5.  Laurence, J. T-cell subsets in health, infectious disease, and idiopathic CD4+
T lymphocytopenia. Ann Intern Med 1993; 119:55.
6.  Kalman, L, Lindegren, ML, Kobrynski, L, et al. Mutations in genes required for
T-cell development: IL7R, CD45, IL2RG, JAK3, RAG1, RAG2, ARTEMIS, and ADA
and severe combined immunodeficiency: HuGE review. Genet Med 2004; 6:16.
7.  Bonilla FA. Combined B- and T-cell deficiencies. In: Manual of Clinical
Laboratory Immunology, 6th Edition, Detrick, B, Hamilton, RG, Rose, NR (Eds),
ASM Press, Washington, DC 2002. p.819.
8.  Shearer, WT, Rosenblatt, HM, Gelman, RS, et al. Lymphocyte subsets in
healthy children from birth through 18 years of age: the Pediatric AIDS clinical
trials group P1009 study. J Allergy Clin Immunol 2003; 112:973.
9.  Fong, SW, Qaqundah, BY, Taylor, WF. Developmental patterns of ABO
isoagglutinins in normal children correlated with the effects of age, sex, and
maternal isoagglutinins. Transfusion 1974; 14:551.
10.  Hinds, H, Craig, IW, Chen, ZY, et al. Carrier detection in X-linked
immunodeficiencies. II: An X inactivation assay based on differential
methylation of a line-1 repeat at the DXS255 locus. Immunodeficiency 1993;
4:213.