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Universidad de Carabobo Facultad Experimental de Ciencias y Tecnología Departamento de Química Índice de la actividad de la estearoil coenzima A desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la cohorte CDC de Canarias en Venezuela Autor: TSU. Humberto Martínez Bárbula, Mayo de 2012 Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. ii Universidad de Carabobo Facultad Experimental de Ciencias y Tecnología Departamento de Química Índice de la actividad de la estearoil coenzima A desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la cohorte CDC de Canarias en Venezuela Trabajo Especial de Grado como requisito parcial para optar al titulo de Licenciado en Química Autor: TSU. Humberto Martínez Tutores: Msc. Miguel Viso Dra. Nancy Salinas Bárbula, Abril de 2012 Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. iii DEDICATORIA A mi Dios Altísimo por fortalecerme, guardarme y protegerme cada mañana para lograr alcanzar otra meta para su gloria y su honra. A mis padres Humberto Martínez y Margarita de Martínez que con su apoyo, amor incondicional y constancia; me dieron las fuerzas para culminar una misión más en mi vida, los amo infinitamente. A mis hermanos Margarita, Ysaira, Linda, María, Isamar y José que estuvieron conmigo en todo momento para brindarme aliento y fortaleza para continuar. A todo el resto de mi familia que me dieron su cariño, apoyo y palabras de animo en todo momento. Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. iv AGRADECIMIENTOS A mi familia por ser parte fundamental en mi vida, su cariño, consejo y protección. A mis tutores Dra. Nancy Salinas y Msc. Miguel Viso, por su apoyo, dedicación, cariño y preocupación durante todo el trabajo, aprecio mucho su paciencia. A los profesores de la Facultad por su dedicación en la formación de profesionales excelentes, en especial al profesor Arnaldo Armado por su orientación durante el desarrollo de la investigación. Yelitza, Diosleidis y Cecilia, por su colaboración y compresión durante el desarrollo del trabajo. A los técnicos de laboratorio Beatriz y Lesbia por su apoyo incondicional al realizar las practicas En especial agradecimiento a María Esther, por prestar su colaboración, enseñanza, apoyo y ayuda en el desenvolvimiento y desarrollo de la investigación. Al Sr. José Conrado por sus conocimientos y aportes técnicos en la manipulación del equipo. A Julio Cesar Hernández y su familia, quien con su apoyo y palabras de animo me brindaban fortaleza para seguir adelante en la culminación de la carrera Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. v UNIVERSIDAD DE CARABOBO FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS Y TECNOLOGÍA DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ÍNDICE DE LA ACTIVIDAD DE LA ESTEAROIL COENZIMA A DESATURASA Y SU RELACIÓN CON EL SÍNDROME METABÓLICO Y EL ÍNDICE DE MASA CORPORAL EN ADULTOS PERTENECIENTES A LA COHORTE CDC DE CANARIAS EN VENEZUELA. Autor: TSU. Humberto Martínez. Tutores: Dra. Nancy Salinas. Msc. Miguel Viso La Estearoil CoA Desaturasa (ECD), enzima limitante en la síntesis de los ácidos palmitoleico y oleico, se asocia a obesidad, diabetes y ECV. La obesidad y el síndrome metabólico (SM), productores de diabetes y enfermedad cardiovascular (ECV), son altamente prevalentes en Venezuela y en las Islas Canarias. El objetivo de esta investigación fue comparar los índices de actividad de ECD (C16:1n-7c/C16:0) (IA ECD-16) y C18:1n-9c/C18:0 (IA ECD-18) con SM y el índice de masa corporal (IMC) en 120 adultos, 46 con SM (CSM) y 74 sin el mismo (SSM), de la cohorte CDC de Canarias en Venezuela. Se analizaron los ácidos grasos en suero sanguíneo (AGSS) y en dos fracciones del mismo (ácidos grasos libres o AGL y triacilglicéridos o TAG), por cromatografía de gases. Los sujetos CSM, tuvieron significativamente mayor IA ECD-16 (AGSS, AGL y TAG) así como IA ECD-18 (AGSS y TAG), pero menor IA ECD-18 (AGL). Los individuos con obesidad y sobrepeso CSM, en comparación con aquellos con obesidad y sobrepeso SSM, mostraron respectivamente valores significativamente superiores de IA ECD-16 (AGL y TAG). El análisis de Pearson mostró una correlación directa significativa de IA ECD-16 con edad (AGSS y TAG), IMC (TAG), circunferencia abdominal o CC (AGSS y TAG), presión arterial diastólica o PAD (AGSS, TAG), presión arterial sistólica o PAS (TAG), TAG (AGSS, TAG) y glucosa (AGSS, TAG), igualmente IA ECD-18 se correlacionó directamente con IMC (TAG), CC (AGSS y TAG), PAD y PAS (AGSS), TAG (AGSS, TAG) y glucosa (AGSS, TAG) e inversamente con HDL- colesterol (AGSS). El aumento del C16:1n-7c, producto de la lipogénesis endógena, constituye un factor de riesgo cardiovascular, además, se considera IA ECD-16 como una referencia bioquímica que registra a la población, perteneciente a la cohorte CDC de Canarias en Venezuela, según su condición clínica. Palabras clave: Estearoil CoA desaturasa, síndrome metabólico, obesidad. Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. vi Universidad de Carabobo Facultad Experimental de Ciencias y Tecnología Departamento de Química INDEX OF THE ACTIVITY STEAROYL COENZYME A DESATURASE AND ITS RELATIONSHIP WITH THE METABOLIC SYNDROME AND BODY MASS INDEX IN ADULTS BELONGING TO THE CANARY ISLANDS CDC COHORT IN VENEZUELA. Autor: TSU. Humberto Martínez. Tutores: Msc. Miguel Viso. Dra. Nancy Salinas. ABSTRACT The stearoyl CoA desaturase (ECD), limiting enzyme in the synthesis of palmitoleic and oleic acids, is associated with obesity, diabetes and CVD. Obesity and metabolic syndrome (MS), producers of diabetes and cardiovascular disease (CVD), are highly prevalent in Venezuela and the Canary Islands. The objective of this research was to compare the activity rates of ECD (C16: 1n-7c/C16: 0) (IA ECD-16) and C18: 1n-9c/C18: 0 (IA ECD-18) with MS and body mass index (BMI) in 120 adults, 46 with SM (CSM) and 74 without it (SSM) of the cohort CDC de Canarias in Venezuela. Fatty acids were analyzed in blood serum (AGSS) and two fractions thereof (free fatty acids and triglycerides or GLA or TAG) by gas chromatography. CSM subjects had significantly higher AI ECD-16 (AGSS, FFA and TAG) and IA ECD-18 (AGSS and TAG), but lower IA ECD-18 (AGL). Individuals with obesity and overweight CSM, compared with those with obesity and overweight SSM, respectively showed significantly higher values of AI ECD-16 (AGL and TAG). Pearson analysis showed a significant direct correlation ECD IA-16 with age (AGSS and TAG), BMI (TAG), abdominal circumference or CC (AGSS and TAG), diastolic blood pressure or DBP (AGSS, TAG), blood pressure systolic or PAS (TAG), TAG (AGSS, TAG) and glucose (AGSS, GAD), IA also ECD-18 was directly correlated with BMI (TAG), CC (AGSS and TAG), DAP and PAS (CSSA), TAG (AGSS,TAG) and glucose (AGSS, TAG) and inversely with HDL-cholesterol (CSSA). The increase in C16: 1n-7c, a product of endogenous lipogenesis, is a cardiovascular risk factor, is also considered IA ECD-16 as a biochemical reference population registers belonging to the cohort CDC de Canarias in Venezuela according to their clinical condition. Keywords: stearoyl CoA desaturase, metabolic syndrome, obesity. Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. vii ÍNDICE INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... XIII CAPITULO I ................................................................................................................. 15 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .................................................................... 16 JUSTIFICACIÓN ........................................................................................................ 20 OBJETIVOS ................................................................................................................ 22 OBJETIVO GENERAL .................................................................................................. 22 OBJETIVOS ESPECIFICOS .......................................................................................... 22 CAPITULO II ................................................................................................................. 23 MARCO TEORICO ........................................................................................................ 23 ANTECEDENTES ...................................................................................................... 24 BASES TEÓRICAS .................................................................................................... 33 Lípidos: ........................................................................................................................... 33 Clasificación de los lípidos .................................................................................. 34 ácidos grasos: ....................................................................................................... 36 triacilglicéridos:.................................................................................................... 37 Enzimas ........................................................................................................................... 40 Clasificación de las enzimas ................................................................................ 41 Coenzimas ............................................................................................................ 44 Coenzima A ...................................................................................................... 44 Lipasas ................................................................................................................. 45 Desaturasa ............................................................................................................ 49 Delta-9 desaturasa (estearoil co A desaturasa). ................................................ 52 Índice de actividad de la ECD .......................................................................... 54 Síndrome metabólico ...................................................................................................... 55 Índice de masa corporal (IMC) ....................................................................................... 56 CAPITULO III ................................................................................................................ 59 Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. viii MARCO METODOLÓGICO ......................................................................................... 59 CLASIFICACIÓN DE LA POBLACIÓN .................................................................. 60 Nivel de la investigación ................................................................................................. 60 Población. ........................................................................................................................ 60 Muestra poblacional. ....................................................................................................... 61 DETERMINACIÓN DEL PERFIL DE ÁCIDOS GRASOS ...................................... 63 Preparación de las muestras ............................................................................................ 63 Extracción del perfil lipídico en el suero sanguíneo (A1) .................................... 63 Separación del perfil lipídico por cromatografía de capa fina ............................. 64 Metilación de las fracciones ácidos grasos separados (Puttini y col, 2005) ........ 65 Metilación del perfil lipídico en el suero sanguíneo (Puttini y col, 2005) ........... 65 Estudio cromatográfico ................................................................................................... 66 Identificación y cuantificación de ácidos grasos ............................................................. 67 DETERMINACIÓN DEL ÍNDICE DE ACTIVIDAD ............................................... 68 ANÁLISIS ESTADÍSTICO ........................................................................................ 69 CAPITULO IV ................................................................................................................ 70 Perfil de ácidos grasos en sujetos con y sin síndrome metabólico pertenecientes a la cohorte CDC Canarias de Venezuela ............................................ 71 Índice de la actividad de la estearoil coenzima A desaturasa ...................................... 75 Relación del índice de actividad de la estearoil coenzima A desaturasa con el síndrome metabólico e índice de masa corporal. ..................................................... 80 Comparación del C16:1n-7c y el C18:1n-9c con el índice de actividad de la estearoil coenzima A desaturasa de la población seleccionada ............................... 86 CAPITULO V ................................................................................................................. 94 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES .............................................................. 94 CONCLUSIONES ....................................................................................................... 95 RECOMENDACIONES ............................................................................................. 97 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................ 98 APENDICE ............................................................................................................... 113 Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. ix ÍNDICE DE TABLAS Tabla I. Algunos ácidos grasos de importancia biológica .............................................. 38 Tabla II. Clasificación de las enzimas. ............................................................................ 43 Tabla IV: Puntos de corte propuestos por el comité de expertos de la organización mundial de la salud. ........................................................... 57 Tabla V: Clasificación por la sociedad española para el estudio de la obesidad (SEEDO-2007). ........................................................................ 58 TablaVI: Criterios de diagnostico clínico del síndrome metabólico según ATP III modificado ................................................................................. 62 Tabla VII: condiciones de referencias para los análisis cromatográficos. ...................... 66 Tabla VIII. Clasificación de los ácidos grasos presentes en el suero sanguíneo de los adultos con síndrome metabólico y sin síndrome metabólico pertenecientes a la cohorte CDC de Canarias de Venezuela. ........................................................................... 72 Tabla IX: Perfil de ácidos grasos presentes en los sueros sanguíneos (AGSS) de los adultos con síndrome metabólico y sin síndrome metabólico pertenecientes a la cohorte CDC de Canarias de Venezuela. ........................................................................... 73 Tabla X. Variables clínicas, bioquímicas e IA ECD-18 y IA ECD-16 en los individuos según presencia o ausencia de síndrome metabólico. .............................................................................................. 76 Tabla XI. Relación del IA ECD-18, C18:1n-9c, IA ECD-16 y C16:1n-7c en los individuos según el estado nutricional. ......................................... 80 Tabla XII: Correlaciones de pearson entre c16:1n-7c, c18:1n-9c, ia ecd-16 e ia ecd-18 en las fracciones de los agss, agl y tag de los Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. x individuos csm y ssm pertenecientes a la cohorte cdc canarias en venezuela .............................................................................. 86 Tabla XIII: Correlaciones de pearson entre las variables del SM, IMC y edad con el C16:1n-7, C18:1n-9c, IA ECD e IA ECD-16 en los individuos pertenecientes a la cohorte CDC de Canarias en Venezuela. .......................................................................................... 89 Tabla XV: Ácidos grasos identificados en una muestra de AGSS con sus respectivas áreas. ................................................................................... 117 Tabla XVI: resultados en el proceso de cuantificación de AG en la fracción de los agss. ............................................................................................. 118 Tabla XVII Resultados del IA ECD en la fracción de los AGSS ................................. 118 Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. xi ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1: Estructura general de los lípidos ...................................................................... 33 Figura 2: Ejemplificación de un triacilglicérido ............................................................. 37 Figura 3: Hidrólisis y síntesis de acilglicéridos mediante lipasas. .................................. 46 Figura 4: Reacción para catalizar la formación del enlace tioester en el grupo carboxilo del acido graso...................................................................... 47 Figura 5: Representación de la biosíntesis de ácidos grasos mediante elongasas y desaturasas. ................................................................................. 51 Figura 6: Transferencia de electrones en la desaturación de ácidos grasos en los vertebrados. ............................................................................................... 52 Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. xii ÍNDICE DE APÉNDICE Apéndice A: Criterios propuestos para el diagnóstico clínico del síndrome metabólico. ............................................................................................ 114 Apéndice B: Componentes, tiempo de retención, porcentaje en peso y área del FAME Supelco-18919 AMP ........................................................... 115 Apéndice C: Cromatógrama del patrón Supelco-18919 AMP de 37 componentes esteres metílicos de AG empleado para la determinación de ésteres metílicos en suero sanguíneo, bajos las condiciones de trabajo especificadas. .............................................. 116 Apéndice D: Cuantificación del perfil de ácidos grasos presente en el suero sanguíneo ............................................................................................... 117 TABLA XV: Ácidos grasos identificados en una muestra de agss con sus respectivas áreas. ................................................................................... 117 TABLA XVI: Resultados en el proceso de cuantificación de AG en la fracción de los AGSS. ........................................................................... 118 TABLA XVII Resultados del IA ECD en la fracción de los AGSS ............................. 118 Apéndice E: Perfil de ácidos grasos presentes en los individuos CSM y SSM pertenecientes a la cohorte CDC Canarias en Venezuela. ..................... 119 Apéndice G: Correlaciones de Pearson entre las variables del SM, IMC y edad con el C16:1n-7, C18:1n-9c y IA ECD en los individuos. ............................................................................................. 121 Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. xiii INTRODUCCIÓN La actividad enzimática de tres enzimas particulares, la delta 5 (Δ5), la delta 6 (Δ6) y la delta 9 (Δ9), ha esta última también se le denomina estearoil coenzima A desaturasa (ECD), y se encarga de la formación de dos ácidos grasos monoinsaturados a partir de dos ácidos grasos saturados, es decir, la ECD utiliza dos ácidos grasos como sustratos, el ácido palmítico (C16:0) y el ácido oleico (C18:1n-9c), transformándolos en ácido palmitoleico (C16:1n-7c) y el ácido esteárico (C18:0), respectivamente. Diversas investigaciones han encontrado que el incremento de la actividad ECD a través de la relación producto-precursor de los ácidos grasos mencionados anteriormente, se ha relacionado con la condición crónica compleja caracterizada por la presencia de un exceso de grasa corporal, obesidad y con el conjunto de alteraciones metabólicas constituido por 5 factores clínicos de alto riesgo, SM. Asimismo, la obesidad, el SM y el aumento de la actividad de la ECD se han asociado en la mayoría de los casos con el incremento de la prevalencia de diabetes tipo 2 y de enfermedades cardiovasculares. Igualmente, en estudios recientes se ha relacionado la actividad de la ECD con el SM, en las poblaciones de Suecia, Corea, Mongolia, Japón, España y Venezuela, encontrando un aumento de la morbimortalidad por causa de enfermedades cardiovasculares, diabetes tipo 2, hipertensión arterial, dislipidemia, insuficiencia cardiaca congestiva, accidente cerebro-vascular y otras morbilidades como litiasis vesicular, esteatosis hepática, apnea del sueño, síndrome de ovarios poliquísticos, cáncer (próstata, endometrio, mama y colon) en personas que eran obesas. La obesidad y el SM, así como la actividad enzimática de la ECD se ha venido en aumento por el consumo excesivo de alimentos ricos en carbohidratos y triacilglicéridos, por tal motivo se realizó el Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canariasen Venezuela. xiv estudio para determinar el índice de la actividad de la estearoil coenzima A desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y el índice de masa corporal en una población de adultos pertenecientes a la cohorte CDC de Canarias en Venezuela. CAPITULO I Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. 16 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Los triacilglicéridos están formados por la condensación de una molécula de glicerol con tres de ácidos grasos, cuya presencia en el organismo es dependiente tanto de la ingesta de los alimentos como de su síntesis endógena; en cuyo proceso participan las enzimas desaturasas de ácidos grasos, reductasas que introducen dobles enlaces cis en tres posiciones diferentes de la cadena, sean estas delta-5, delta-6 y delta-9 desaturasas (Lozano, 2000), insaturando algunos ácidos grasos como por ejemplo, el palmítico y esteárico que son de alta importancia en el control del síndrome metabólico. la estearoil coenzima A desaturasa (ECD) o delta-9 desaturasa, presente en varios tejidos, incluyendo el hígado, es necesaria para que los ácidos grasos saturados palmítico y esteárico se transformen en los ácidos grasos monoinsaturados palmitoleico y oleico respectivamente (Cohen y Friedman, 2.004). La obesidad es una condición crónica compleja caracterizada por la presencia de un exceso de grasa corporal que se asocia con aumento en el riesgo de desarrollar diabetes tipo 2, hipertensión arterial, dislipidemia, enfermedad coronaria, insuficiencia cardiaca congestiva, accidente cerebro-vascular y otras morbilidades como litiasis vesicular, esteatosis hepática, apnea del sueño, síndrome de ovarios poliquísticos y cáncer (próstata, endometrio, mama y colon) (Jiménez y col, 2009). Es una enfermedad crónica de prevalencia creciente en los países desarrollados y en aquellos en vías de desarrollo, donde se ha incrementado últimamente tanto en estratos sociales bajos como altos de la población (Zimmeta y col, 2005). Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. 17 Se conoce que en obesos con predominio de grasa visceral, existe una actividad lipídica aumentada que hace que se liberen ácidos grasos libres, esto favorece las alteraciones hormonales y metabólicas posteriores observadas en la obesidad tales como hiperinsulinemia, hipoadiponectinemia e hipertrigliceridemia (García y col, 2006). En adultos obesos, las concentraciones de ácido palmitoleico en el ester de colesterol sérico y en los triacilglicéridos del tejido graso presentan una estrecha correlación positiva con los indicadores de adiposidad (Kunesova y col, 2.002). Además, los niveles del mencionado ácido graso en fosfolípidos del tejido muscular han mostrado una asociación directa con las concentraciones séricas de insulina (Storlien y col, 1.996). Estos hallazgos sugieren que cambios en la composición de los ácidos grasos monoinsaturados, especialmente el palmitoleico, están íntimamente relacionados con la obesidad y con otros componentes del síndrome metabólico (Okada y col, 2.005). En España, la prevalencia de obesidad en adultos, entre 25 y 64 años, según el estudio DORICA (dislipidemia, obesidad y riesgo cardiovascular), se estima en 15,5 por ciento, siendo más elevada en mujeres (17,5%) que en hombres (13,2%), reportándose una mayor proporción de obesos en las regiones del noroeste, Murcia, Canarias y sur. En las Islas Canarias, corresponde a 14,21 por ciento en hombres y 22,22 por ciento en mujeres (Aranceta, 2005). De acuerdo al estudio DRECE (dieta y riesgo de enfermedades cardiovasculares en españa) la prevalencia de la malnutrición por exceso se ha incrementado en 34,5 por ciento en 14 años (1.992-2.006) (Rubio y col, 2006). Las enfermedades cardiovasculares constituyen una de las principales causas de morbimortalidad en adultos y se estima que se producen unos 250 – 450 nuevos eventos coronarios y cerebro-vasculares por cada 100.000 habitantes/año (Suárez y col, 2008). En Venezuela, en cuanto al sobrepeso en niños, el Instituto Nacional de Nutrición (INN) mediante el Sistema de Vigilancia Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. 18 Alimentaría y Nutricional, revela para el año 2.004, una prevalencia de un estado nutricional sobre la norma, según valores de referencia de la Organización Mundial de la Salud (OMS), de 14,24 por ciento en el grupo de 7 a 14 años. En 10 años (1.994-2.004), en este grupo etario, la prevalencia de sobrepeso se incrementó en 13,1 por ciento (INN-SISVAN, 2.004). En el estado Zulia, nor-oeste de Venezuela, se evaluaron 3108 individuos mayores de 19 años (muestra representativa de cada distrito sanitario de esa región), demostrándose una prevalencia de síndrome metabólico (ATP III) correspondiente a 31,2 %, siendo superior en hombres que en mujeres e incrementándose con la edad y con el grado de obesidad, así mismo, 42,9 % de los sujetos mostraron obesidad abdominal (Flores H y col, 2005). La obesidad de distribución central, la elevación de los triacilglicéridos, la disminución de las concentraciones de colesterol unido a la lipoproteína de alta densidad (HDLc), el aumento de la presión arterial y la hiperglicemia forman parte de un conjunto de alteraciones metabólicas que se conocen como SM (Zimmeta y col, 2005). Este síndrome implica un mayor riesgo de padecer diabetes tipo 2 y enfermedad cardiovascular aterosclerótica. Asimismo, en un estudio realizado en Japón se demostró en adolescentes una asociación positiva significativa entre el índice de actividad de la ECD (ácido palmitoleico/ácido palmítico) y la obesidad central determinada por la relación cintura/cadera (Okada y col, 2.005). Dicha actividad de la ECD puede ser estimada por medio de la relación producto/precursor de los ácidos grasos involucrados (C16:1n-7/C16:0, C18:1n-9/C18:0) (Warensjö y col, 2.006). Debido a la importante función que la delta-9 desaturasa desempeña en el metabolismo celular, se sugiere la necesidad de realizar estudios sobre la expresión génica de ECD que podrían proporcionen nuevas perspectivas sobre el papel de los ácidos grasos en la regulación celular, el metabolismo y la expresión genética en condiciones normales y de enfermedad (Ntambi, 2003). Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. 19 Actualmente se considera al SM como uno de los principales problemas de salud pública de siglo XXI, tanto en sociedades avanzadas como en aquellas en desarrollo, debido a su alarmante incidencia no sólo entre adultos de ambos sexos, sino también entre la población joven y los niños (Zimmeta y col, 2005). El proyecto cáncer, diabetes y corazón (CDC) de Canarias en Venezuela, producto de un convenio entre la Universidad de La Laguna (Canarias, España) y la Universidad de Carabobo, es un estudio epidemiológico prospectivo que evalúa factores asociados con cáncer, diabetes y enfermedad cardiovascular en la comunidad Canaria residente en Venezuela. Las posibles contradicciones entre la población actual de Las Islas Canarias y la comunidad de origen canario residente en Venezuela en cáncer, diabetes y cardiopatía isquémica podrían atribuirse a diversosfactores (dietéticos, ambientales, familiares, laborales, culturales, socioeconómicos, estilo de vida, genéticos o de organización de los servicios sanitarios) en donde un estudio podría ser capaz prevenir el riesgo de padecer enfermedades crónicas no transmisibles del adulto. En base a lo anteriormente expuesto, en este trabajo de investigación se determinó el índice de la actividad de la estearoil coenzima A desaturasa, a través del perfil de ácidos grasos presentes en suero sanguíneo, y se estableció una relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la cohorte CDC de Canarias en Venezuela. Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. 20 JUSTIFICACIÓN Se decidió de llevar a cabo una evaluación del índice de la actividad de la estearoil Co A desaturasa a través de la relación producto- precursor de dos de sus sustratos (ácido palmítico, ácido esteárico) en individuos pertenecientes a la cohorte CDC de Canarias en Venezuela dada la alta prevalencia de síndrome metabólico tanto en Venezuela como en Canarias, y la estrecha relación reportada entre la actividad de desaturasas y los diversos componentes del SM, aunado al escaso conocimiento sobre el tema y a que en ambos países las tres enfermedades de mayor importancia en cuanto a morbimortalidad son las enfermedades cardiovasculares, el cáncer y la diabetes mellitus, las cuales han ido en aumento jugando un papel central en la morbimortalidad en las Islas Canarias y en Venezuela (Flores H y col, 2005), además un 20% de la población venezolana esta representada por una población de inmigrantes canarios. Es importante destacar que en Canarias, tanto hombres como mujeres, encabezan la mortalidad del país para las enfermedades cardiovasculares y la diabetes, ocupando además las mujeres el primer lugar de España en mortalidad. Obviamente, la diabetes es responsable de una parte importante de la mortalidad circulatoria, lo cual la hace más grave en Canarias dada su mayor prevalencia. Puesto que resultados preliminares del CDC Canarias realizados en 6.729 personas, con edades comprendidas entre 18 y 75 años de las siete islas Canarias (España), entre los años 2.000 y 2.005, reveló una prevalencia de obesidad cercana al 30% sin diferencia entre sexos, el sobrepeso afecta más a los varones (45% vs 33%) quienes presentan también mayor prevalencia de diabetes tipo 2 (12% vs 10%) e hipertensión arterial (43% vs 33%). Pero si se suma sobrepeso y Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. 21 obesidad, aproximadamente el 70% de los adultos de Canarias padecen de malnutrición por exceso (Cabrera col, 2008). Asimismo, la presente investigación se enmarcó dentro de las líneas de investigación del perfil de ácidos grasos presentes en el suero sanguíneo, propuestos por la Facultad de Ciencias y Tecnología de la Universidad de Carabobo y la Facultad de Ciencias de la Salud, al asociarse a las 10 primeras causas de morbimortalidad en Venezuela. La realización de esta investigación se justificó por el impacto que podría tener sus resultados en Venezuela, debido a que se ha aumentado la tasa de morbimortalidad por enfermedades cardiovasculares y diabetes tipo 2; para el desarrollo de este trabajo de investigación se unió conocimientos y esfuerzos de dos importantes facultades de la máxima casa de estudios del Estado Carabobo (Universidad de Carabobo), como la Facultad de Ciencias de la Salud, a través del Centro de Investigaciones Medicas y Biotecnológicas de la Universidad de Carabobo (CIMBUC), donde se ejecutó el convenio del proyecto CDC de Canarias en Venezuela y en el cual se tomaron las muestras de suero sanguíneo, y la Facultad de Ciencias y Tecnología (FACYT), específicamente en el Laboratorio de Alimentos del Departamento de Química, donde se realizo el análisis del perfil ácidos grasos en el suero sanguíneo. Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. 22 OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL Determinar índice de la actividad de la estearoil coenzima A desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la cohorte CDC de Canarias en Venezuela. OBJETIVOS ESPECIFICOS • Analizar el perfil de ácidos grasos presentes en el suero sanguíneo de la población seleccionada, obtenidos por cromatografía de gases • Determinar índice de la actividad de la estearoil coenzima A desaturasa a través de la relación ácido palmitoleico / ácido palmítico y ácido oleico / ácido esteárico en ácidos grasos del suero sanguíneo total, en las fracciones de ácidos grasos libres y triacilglicéridos de la población seleccionada. • Relacionar el índice de actividad de la estearoil coenzima A desaturasa con el síndrome metabólico e índice de masa corporal de la población seleccionada. • Comparar el ácido palmitoleico y el ácido oleico con el índice de actividad de la estearoil coenzima A desaturasa de la población seleccionada. Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. 23 CAPITULO II MARCO TEORICO Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. 24 ANTECEDENTES A continuación se hace referencia a una serie de investigaciones relacionadas con la actividad de la ECD, así como del SM el cual se ha convertido en uno de los principales problemas de salud pública del siglo XXI debido al incremento de la obesidad, especialmente la central, que ha conllevado a una epidemia tanto de diabetes tipo 2 como de enfermedad cardiovascular aterosclerótica (Zimmeta y col, 2005). Shiwaku y col, (2004) demostraron que en adultos la hipertriacilgliceridemia (HTAG) se asocia independientemente con un casual aumento de las enfermedades cardiovasculares (ECV), de igual manera indicaron que el índice de la actividad de la estearoil coenzima A desaturasa (ECD) se asocia con una alta ingesta de carbohidratos ya que incrementan los niveles de triacilglicéridos en el plasma. También relacionaron los niveles de triacilglicéridos con el porcentaje de acido Oleico (C18:1) y acido esteárico (C18:0) en el plasma, el cual fue un marcador del índice de actividad de la ECD, y los ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) en adultos de 3 grupo asiáticos, 411 mongoles (99 hombres y 152 mujeres), 749 japoneses (386 hombres y 363 mujeres) y 418 koreanos (240 hombres y 178 mujeres), de edades comprendidas entre 30 a 60 años. los japoneses y los koreanos tuvieron altos valores (ß = –0.132 y –0.560, respectivamente) de triacilglicéridos que sus homólogos mongoles (ß = –0.005), a pesar de tener valores bajos de índice de masa corporal; este grupo comía con mayor frecuencia pescado, por lo que tuvieron altos valores remarcados de ácidos grasos poliinsaturados que los mongoles (P < 0.001). Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canariasen Venezuela. 25 Un análisis de regresión múltiple mostró que los niveles de triacilglicéridos tuvieron una gran correlación con el incremento de la relación C18:1/C18:0 en los japoneses (0.027) y mongoles (0.293), y los AGPI fueron significativos en la población de los mongoles (2.89–7.90%). La HTAG se asoció al grupo étnico seleccionado con un aumento en la relación de C18:1/C18:0 y una disminución de los AGPI en el plasma. Warensjö y col, (2005). El tipo de grasa presente en la dieta se relaciona con los elementos del síndrome metabólico. La composición de los ácidos grasos séricos refleja tanto la ingesta de grasa dietaría como también la síntesis endógena de ácidos grasos catalizada por las desaturasas. En un estudio prospectivo, durante 20 años, realizado en 1558 hombres, se determinó la composición de los ácidos grasos en ésteres de colesterol séricos y se estimaron las actividades de las desaturasas: ECD, Delta 6 y Delta 5 Desaturasas, a nivel basal, con el objeto de evaluar si las alteraciones en la composición de los ácidos grasos o de las de las desaturasas predicen síndrome metabólico. Una alta actividad ECD y delta 6 desaturasa, así como una baja actividad delta 5 desaturasa predijeron el desarrollo de síndrome metabólico (ATP III). El valor predictivo de la actividad delta 5 desaturasa fue independiente de factores relacionados con el estilo de vida (tabaquismo, índice de masa corporal y actividad física), mientras el riesgo asociado con una alta ECD y delta 6 desaturasa fue principalmente explicado por la obesidad. Entre aquellos que presentaron síndrome metabólico durante el seguimiento, las proporciones de los ácidos grasos C14:0, C16:0, C16:1n-7, C18:1n-9, C18:3n-6 y C20:3n-6 estuvieron incrementadas a nivel basal, mientras C18:2n-6 estuvo disminuida. Al concluir, se señala que la composición de los ácidos grasos predice a largo plazo el desarrollo del síndrome metabólico y la actividad de la delta 5 desaturasa puede ser particularmente importante en este proceso. Okada y col, (2005), realizaron un estudio en 59 niños obesos (20 hembras y 39 varones; 11,8 ± 3,8 años) y 53 eutróficos como grupo control (25 hembras y 28 varones; 12,5 ± 0,5 años) con el objeto de investigar la Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. 26 relación entre la obesidad, especialmente abdominal, la leptina sérica y el perfil de ácidos grasos monoinsaturados (AGMI) en niños con mal nutrición por exceso. En los individuos obesos se observaron niveles séricos significativamente superiores de los ácidos grasos palmitoleico (C16:1n-7), oleico (C18:1n-9) y ácido eicosenoico (C20:1n-9) en comparación con los niños eutróficos, igualmente, una mayor actividad de la ECD (relación acido palmitoleico / acido palmítico) se demostró en los obesos que en los controles. En el análisis de regresión múltiple la relación cintura/cadera (RCC), el porcentaje de grasa corporal y la relación cintura/talla fueron determinantes significativos del contenido de ácido palmitoleico. La actividad ECD tuvo una correlación positiva significativa con leptina. En el análisis de regresión múltiple que incluyó el porcentaje de grasa corporal, la RCC y la leptina como variables independientes, la relación cintura/cadera (obesidad abdominal) resultó ser el único determinante significativo de la actividad ECD. Los autores consideran que el contenido de ácido palmitoleico muestra una relación significativa con la obesidad abdominal en los niños obesos. Este cambio en el perfil de AGMI puede ser causado por activación de ECD la cual no es suprimida suficientemente por la leptina. La lipogénesis endógena puede ser un importante factor en la patogénesis de la obesidad en niños. Warensjö y col, (2006). La composición de los ácidos grasos en los ésteres de colesterol séricos es un reflejo no solo de las grasas que se consumen en la dieta, sino también de la síntesis endógena de ácidos grasos, donde las desaturasas juegan un papel importante. Las actividades de las desaturasas (delta 9, delta 6 y delta 5) puede ser determinada por una relación producto / precursor de ácidos grasos. Es conocido que la actividad delta 9 está incrementada en la diabetes, aterosclerosis y obesidad. En una población sueca constituida por 554 hombres y 295 mujeres, se realizó una investigación con el objeto de relacionar las proporciones de ácidos grasos en los ésteres de colesterol séricos así como las actividades de las desaturasas con indicadores de obesidad y con factores asociados con el estilo de vida (tabaquismo, actividad física y grasa dietaría), así mismo, se Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. 27 estudiaron las diferencias entre los géneros. Los resultados demostraron correlaciones positivas y significativas entre los indicadores de obesidad y las proporciones ácidos grasos C16:0, C16:1n-7, C18:0, C18:3n-6, C20:3n-6, C20:4n-6, C20:5n-3, actividades delta 9 y delta 6 desaturasas. estas relaciones fueron independientes de la edad y la actividad física, y en algunos casos del índice de masa corporal. Por cada aumento de la desviación estándar de las actividades de la delta 9 y delta 6 desaturasa, el riesgo de tener sobrepeso se incrementó alrededor de un 60%, mientras se redujo cerca de un 30% por cada agregado de la desviación estándar de la actividad delta 5 desaturasa. las mujeres tuvieron significativamente mayores valores de delta 9 desaturasa y menores de delta 6 que los hombres. La relación delta 9-16 desaturasa (acido palmitoleico/ ácido palmítico) mostró una asociación positiva con indicadores de obesidad, en cambio la actividad delta 9- 18 (acido oleico/ acido esteárico) no se asoció con sobrepeso. Este estudio demuestra que el cambio del perfil de los ácidos grasos presente en los ésteres de colesterol sérico y de las actividades de desaturasas están asociados con la obesidad y con factores relacionados con el estilo de vida tanto en hombres como en mujeres. Paillard y col, (2008). Paillard realizó una investigación en 134 hombres sanos (28-70 años) con el objeto de evaluar la relación entre el contenido de ácido palmitoleico, un indicador indirecto de la actividad de la ECD, y la concentración plasmática de triglicéridos y obesidad abdominal. Los individuos con hipertriacilgliceridemia mostraron significativamente un mayor contenido de ácido palmitoleico en comparación con aquellos con valores normales de triglicéridos. El análisis de correlación de Spearman reveló una fuerte correlación entre triacilgliceridemia y ácido palmitoleico. El promedio de la triacilgliceridemia fue 114% superior en el cuarto cuartil que en el primer cuartil de ácido palmitoleico. En el análisis de regresión logística, el ácido palmitoleico constituyó ser el parámetro más fuerte e independientemente asociado con triacilgliceridemia, y también con la circunferencia de la cintura cuando los triglicéridos no se incluyeron en el análisis. Los resultados permiten concluir que el contenido de ácido palmitoleico, un producto Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. 28 de la actividad de la ECD, es un indicador independiente de triacilgliceridemia y obesidad abdominal en hombres. La ECD puede representar un blanco para la prevención y tratamiento de trastornos metabólicos, especialmente en aquellos sujetos con riesgo de desarrollar síndromemetabólico. Petersson y col, (2008). La composición de los ácidos grasos está relacionada con la resistencia a la insulina y con la enfermedad cardiovascular, un posible mediador puede ser la inflamación. En un estudio longitudinal a largo plazo (20 años) se investigó la asociación entre la composición de los ácidos grasos y las concentraciones de la proteína C reactiva (PCR) en una cohorte de 767 hombres suecos. La asociación entre la composición de los ácidos grasos en los ésteres de colesterol séricos a la edad de 50 años y la concentraciones de PCR a los 70 años fueron estudiadas utilizando regresión lineal. Adicionalmente, se determinaron las actividades de las desaturasas: ECD, delta 5 desaturasa y delta 6 desaturasa, mediante la relación producto / precursor de ácidos grasos. Después de ajustar variables (tabaquismo, actividad física, ingesta de alcohol, obesidad y velocidad de sedimentación globular), las concentraciones de PCR se asociaron inversamente con la proporción de 18:2n-6, y positivamente con 16:1n-7, 18: 1n-9, 20:5n-3 y con las actividades ECD y delta 6 desaturasa; esta correlación permaneció significativa aun después de incluir la resistencia a la insulina al modelo. Los autores concluyen señalando que en una población sueca de hombres de mediana edad, una alta actividad de la ECD se asocia con concentraciones elevadas de PCR 20 años después. Warensjö y col, (2009). La composición de los ácidos grasos séricos y los triacilglicéridos del tejido adiposo se reflejan parcialmente en la ingesta de ácidos grasos. La composición de los AG es, además de la dieta, influida también por las enzimas desaturasas que pueden ser estimadas usando la relación producto - precursor de los ácidos grasos. La interrelación que existe entre el índice de Desaturasa deducido de las diferentes fracciones del suero lipídico y del tejido adiposo están sin estudio, al igual que sus asociaciones con la obesidad y la Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. 29 resistencia a la insulina. Se realizó un estudio de corte transversal para investigar la correlación entre el índice de desaturasa medido en las fracciones del suero lipídico (fosfolípidos (fl), y ácidos grasos libres (AGL)) y en los triacilglicéridos del tejido adiposo (TAG-TA). Para lo cual, a una muestra poblacional basada de 301 hombres saludables de 60 años se les evaluaron varios índices de actividad: (C16:1n-7 / C16:0; ECD-16 and C18:1n-9 / C18:0; ECD-18, respectivamente), delta 6 desaturasa (C20:3n-6 / C18:2n-6; D6D) y delta 5 desaturasa (C20:4n-6 / C20:3n-6; D5D). Además, se correlacionó el IMC y la resistencia a la insulina. La ECD-16 y la D5D fueron significativamente relacionadas con las fracciones séricas y los tejidos ( r > 0,30), mientras que ECD-18 y D5D no se relacionaron, los índices de desaturasas en AGL en suero y TAG-TA fueron significativamente relacionadas; ECD-16 (r= 0,63), ECD-18 (r=0,37), y D5D (r=0,43), en fosfolípidos, la ECD-16 fue relacionada positivamente con el IMC (r=0,15) mientras que la D5D relacionada negativamente para el IMC (r=0,30) la resistencia a la insulina (r=0,31) y la D6D tanto en fosfolípidos como en TAG-TA fue relacionada positivamente con resistencia a la inulina y el IMC. En resumen, los índices de la ECD-1 y la D5D mostraron una fuerte correlación entre pool lípidos y los tejidos, su hipótesis se basó en que el índice ECD- 16 en AGL con una gran parte reflejada en la actividad de la enzima ECD en tejido adiposo, mientras que el índice de ECD en TAG y esteres de colesterol se reflejo principalmente la actividad de la enzima ECD en el hígado, esta información es provechosa para cuando estudien los índices de desaturasas en estudios epidemiológicos, la ECD-16 en el tejido adiposo fue relacionado con el IMC pero no con la resistencia a la insulina. La D5D en fosfolípidos fue inversamente relacionada con ambos factores y los índices D6D mostraron asociaciones positivas. Brown y col, (2010) la ECD es un regulador considerable del metabolismo y la inflamación, en estudios anteriores se publicó que una baja actividad de la ECD en ratones hiperlipidemicos que fueron alimentados con una dieta enriquecida con ácidos grasos saturados (AGS) previno el desarrollo del síndrome metabólico, pero paradójicamente promovió una aterosclerosis grave. En Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. 30 esta investigación se probó que una dieta a base de aceite de pescado logró prevenir el incremento de la aterosclerosis causada por la baja actividad de la ECD, en 100 roedores que fueron tratados con un repelente oligonucleótido para inhibir la actividad de ECD mientras consumían una dieta enriquecida con 0,1 % de colesterol y 12 % de AGS aceite de palma o enriquecidos con ácidos grasos omega 3 (ω -AGPI) (aceite de pescado) durante 20 semanas. Se demostró que la ECD tratada con repelente oligonucleótido se protege del desarrollo de síndrome metabólico, pero promueve la ateroesclerosis en roedores que consumieron alimentos enriquecidos con AGMI y AGS. Por su parte, esta misma asociación con el consumo de (ω -AGPI) aceite de pescado, previno por completo la aterosclerosis, al igual que los efectos pro- inflamatorios causados por mera la asociación, además esta combinación previno el desarrollo de la obesidad, resistencia a la insulina, la hiperlipidemia, la esteatosis hepática y la ateroesclerosis en los roedores en estudios. García-Serrano y col, (2011). En Málaga (España), en 40 pacientes obesos mórbidos y 11 controles con sobrepeso, se estudió la estearoil CoA desaturasa 1 (ECD1) en el tejido adiposo visceral (VAT) y subcutáneo (SAT) y su asociación con resistencia a la insulina, SREBP-1 y ATPasa p97 (proteínas involucradas en la síntesis y degradación de ECD1). El índice de actividad de ECD1 (18:1/18:0) en los lípidos totales de VAT y SAT del grupo de casos fue significativamente superior que en los controles, sin embargo, la determinación del índice de ECD1 (C16:1n-7/16:0) no reveló diferencias entre los dos grupos. En VAT y SAT la expresión del ARNm de ECD1 en los obesos mórbidos fue significativamente menor que en los controles, mientras que la concentración de la proteína ECD1fue significativamente superior. En los obesos mórbidos, los niveles de la proteína ECD1en VAT estuvieron disminuidos en aquellos sujetos con mayor resistencia a la insulina (HOMA≥4,7), al contrario, en SAT las concentraciones proteicas de ECD1mostraron ser superiores en los individuos con alta insulinorresistencia. El análisis de regresión lineal múltiple, en los obesos mórbidos, demostró que la variable asociada con la proteína ECD1 en VAT fue la resistencia a Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. 31 la insulina, en cambio, en SAT correspondió al índice de masa corporal y ATPasa p97. Los resultados permiten concluir que existe una discrepancia entre la expresión ECD1 ARNm y el nivel de la proteína ECD1 en VAT y SAT. Las concentraciones proteicas de la enzima ECD1, en el tejido adiposo visceral como subcutáneo, están claramente elevadas en los pacientes obesos mórbidos, asimismo, estos niveles están asociados con el índice de actividad (C18:1n-9/18:0) que es el sustrato preferido de ECD1 en humanos. La proteína ECD1 muestra diferente regulación en los dos tejidos adiposos, así como una estrecha relación con el gradode resistencia a la insulina. Kröger y col (2011). Kröger realizó una investigación prospectiva (promedio: 7 años) en 2724 individuos, incluyendo 673 casos incidentes de diabetes, pertenecientes al proyecto EPIC (Investigación Europea Prospectiva en Cáncer y Nutrición) con el objeto de investigar ácidos grasos en fosfolípidos de la membrana eritrocitaria, actividad de desaturasas (D5D, D6D y D9D) e ingesta dietaria de ácidos grasos en relación con la incidencia de diabetes tipo 2. Una alta proporción del ácido palmitoleico predijo significativamente un incremento en el riesgo de diabetes tipo 2. La actividad D6D y D9D se relacionó directamente con el riesgo de diabetes, mientras que D5D se asoció inversamente. Las proporciones de los ácidos grasos dietarios mostraron solamente una modesta a baja correlación con los ácidos grasos eritrocitarios y no se asociaron significativamente con el riesgo. Los resultados permiten considerar que el perfil de ácidos grasos de la membrana eritrocitaria y la actividad de las desaturasas (D6D, D5D y estearoil CoA desaturasa) están altamente relacionadas con la incidencia de diabetes tipo 2. Saito Emiko y col, (2011). En la obesidad, los niveles del ácido docosahexaenoico (DHA) suelen estar reducidos. Saito realizó una investigación en 32 niños obesos japoneses (27 varones y 5 hembras) (edad: 12,0 ± 2,6 años) con el objeto de evaluar, en los fosfolípidos del plasma, las relaciones entre el contenido de DHA, los índices de desaturasas (D5D, D6D y D9D) y los componentes del síndrome metabólico. El contenido de DHA mostró una asociación Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. 32 inversa con el índice de masa corporal (IMC) (r= - 0,337, p=0,0592), igualmente, se correlacionó inversamente pero significativamente con VLDL-triglicéridos. Adicionalmente, DHA manifestó relaciones negativas significativas con los índices D9D (16:1/16:0 y 18:1/18:0) los cuales se correlacionaron positivamente con IMC, pero no hubo asociación con D5D o D6D. La circunferencia de cintura también se asoció positivamente con D9D-16, pero no con D9D-18, D6D o D5D. Asimismo D9D-16 se asoció positivamente con triglicéridos y con los niveles séricos de glucosa e insulina, pero no con HDL-colesterol ni con la presión arterial. D9D-18 también se asoció con triglicéridos. D5D se correlacionó positivamente con HDL-colesterol y negativamente con triglicéridos. Los resultados permiten concluir que en niños obesos el contenido de DHA es independiente de la desaturación del ácido α - linolénico. El contenido reducido de DHA se asocia con un incremento en la actividad de la estearoil CoA desaturasa y puede contribuir al desarrollo del síndrome metabólico. El manejo de los ácidos grasos en la dieta es sugerido para el mejor tratamiento y prevención de la obesidad. . Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. 33 BASES TEÓRICAS A continuación se presenta una serie de conceptos básicos que apoyan la mejor comprensión de esta investigación. Lípidos: Los lípidos biológicos constituyen un grupo químicamente diverso de compuesto cuya característica común y definitoria es su insolubilidad en agua (ver Figura 1). (Mathews y col, 2003) Figura 1: Estructura General de los Lípidos Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. 34 Clasificación de los Lípidos Lípidos se clasificaron de acuerdo a las presencia de los ácidos grasos en el tejido biológico • Ácidos Grasos Lipídicos • Saturados • Insaturados • Complejos • Derivados de Ácidos Grasos Lipídicos • Hidrocarburos • Alcoholes Grasos • Aldehídos Grasos • Esfingosinas • Eicosanoides Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. 35 • (Prostaglandinas, Prostaciclinas, Tromboxanos y Leucotrienos) • Lípidos que contienen Ácidos Grasos • Ceras • Acilgliceroles o grasas neutras • Glicoglicerolípidos • Glicerofosfolípidos • Esfingofosfolípidos • Esfingoglicolípidos • Esteres de Colesterol • Lípidos no relacionados con los Ácidos Grasos • Terpenoides y Carotenoides • Esteroides • Lípidos pirrólicos (porfirinas) (Lozano y col, 2000) Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. 36 Ácidos Grasos: Son ácidos monocarboxílicos, que constan de una cadena de carbonos con un extremo carboxilo de la forma R-COOH y se encuentran formando parte de las grasas combinados con el glicerol, y no como ácidos grasos libres. La longitud de la cadena carbonada varía en un número entre 4 y 24 moléculas de carbono, y puede estar saturada o insaturada (Fox y Cameron, 2006). Según la longitud de su cadena carbonada, los ácidos grasos presentes en lo lípidos de los alimentos pueden agruparse bajo tres denominaciones: Cadena corta: menos de 6 carbonos. Cadena media: entre 6 y 10 carbonos. Cadena larga: más de 12 carbonos (Gutiérrez, 2000). A su vez, el ácido graso de acuerdo al tipo de enlace simple o doble que presente, se puede clasificar también en tres tipos. Ácidos grasos saturados, en los que los átomos de carbono se mantienen juntos por enlaces simples; De este modo, la cadena de carbono consiste en agrupamientos metilenos (CH2) repetidos: -CH2-CH2-, ya sea bajo una forma lineal, ramificada o cíclica. Ácidos grasos monoinsaturados, en los cuales hay un doble enlace en la cadena de carbono, donde la cadena contiene dos átomos de carbono insaturados, -CH=CH-. Ácidos grasos poliinsaturados, en los cuales hay dos o más dobles enlaces en la cadena de carbono: -CH=CH-CH2-CH=CH- (Fox y Cameron, 2006). Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. 37 Triacilglicéridos: Son esteres de glicerol con ácidos grasos, constituyen la principal molécula de reserva energética, con un poder calórico de 38 kJ/g. además, los triacilglicéridos o triglicéridos constituyen el 98 – 99% de las grasas de los alimentos y sus propiedades dependen de los ácidos grasos que predominan en su composición (Vázquez y col, 2005). Desde el punto de vista estructural, un triacilglicérido puede considerarse formado por la condensación de una molécula de glicerol con tres de ácidos grasos, para dar tres moléculas de agua y una de un triacilglicérido, como se puede observar en la Figura 2 (Stryer y col, 2004). (Stryer y col, 2004) Figura 2: Ejemplificación de un triacilglicérido Si los tres ácidos grasos son idénticos, se obtiene un triacilglicérido simple y si son diferentes uno mixto. Cuando un triacilglicérido Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. 38 mixto contiene tres radicalesácidos diferentes, presenta tres formas isoméricas posibles, según sea el radical ácido que ocupe la posición central (β) de la molécula y los que ocupen las dos posiciones extremas (α y α’). Así mismo, cuando tiene solamente dos radicales ácidos diferentes tendrán, de forma análoga, dos isómeros posibles (Lehninger y col, 2000). Los principales ácidos grasos se pueden encontrar en la Tabla I. Tabla I. Algunos ácidos grasos de importancia biológica Nombre común Nombre sistemático Abrev. Estructura PF (ºC) Saturados Caprico n-Decanoico 10:0 CH3(CH2)8COOH 31.6 Laurico n-Dodecanoico 12:0 CH3(CH2)10COOH 44.2 Mirístico n-Tetradecanoico 14:0 CH3(CH2)12COOH 53.9 Palmítico n-Hexadecanoico 16:0 CH3(CH2)14COOH 63.1 Esteárico n-Octadecanoico 18:0 CH3(CH2)16COOH 69.6 Araquídico n-Eicosanoico 20:0 CH3(CH2)18COOH 76.5 Behenico n-Docosanoico 22:0 CH3(CH2)20COOH 81.5 Lignocérico n-Tetracosanoico 24:0 CH3(CH2)22COOH 86.0 Cerótico n-Hexacosanoico 26:0 CH3(CH2)24COOH 88.5 Insaturados Palmitoleico Cis-9-Hexadecanoico 16:1n-7c CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7COOH 0 Oleico Cis-9-Octadecanoico 18:1n-9c CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH 16 Linoleico Cis,Cis-9,12-Octadecanoico 18:2n-6c CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7 COOH 5 α-Linolenico cis-9,12,15-Octadecatrietanoico 18:3n-3c CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH (CH2)7COOH -11 Araquidónico cis-5,8,11,14-Eicosatetradecanoico 20:4n-6c CH3(CH2)CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=C H(CH2)3COOH -50 Ramificados y Cíclicos Tuberculoesteárico l-D-10-Metilooctadecanoico ------- CH3 CH3(CH2)7 CH (CH2)8COOH 13.2 Lactobacílico Ω-(-2-n-Octilciclopropil) octadecanoico ------- CH3(CH2)5 CH.3CH(CH2)9COOH 29 Fuente: Mathews y col, 2003. Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. 39 Las células del cuerpo humano pueden obtener ácidos grasos a partir de tres fuentes diferentes: grasas consumidas en la dieta, grasas almacenadas en las células en forma de gotículas de lípidos y grasas sintetizadas principalmente en el hígado a partir del exceso de carbohidratos y proteínas de la dieta, las cuales son exportadas al tejido adiposo en las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) (Lehninger, 2008). El metabolismo de lipidos de la dieta se podría constituir en dos ciclos, el primer ciclo abierto y exógeno, ya que se inicia con la digestión de los alimentos y absorción de los lípidos de la dieta a través del intestino delgado, donde se sintetizan quilomicrones en las células de la mucosa intestinal, contienen Apo B-48, Apo A-I, A-II, A-III y colesterol libre, éstos son enviadas a los capilares linfáticos del plexo mesentérico, pasan a los vasos linfáticos y de allí al torrente circulatorio donde se enriquecen de Apo C y E, que les permiten realizar dos pasos fundamentales, la transformación en partículas residuales o remanentes y el reconocimiento de estos por los receptores hepáticos (Herrera, 1994). El segundo ciclo se podría denominar endógeno en donde parte del colesterol proveniente del quilomicrón es utilizado en el hígado para que junto con los triacilglicéridos y fosfolípidos se canalicen a través del retículo endoplasmático liso hasta llegar a fusionarse con las apoliproteínas, principalmente la Apo B-100, para dar inicio a la síntesis de la VLDL, las cuales son convertidas en IDL por acción de las LPL, en un proceso que permite, al igual que antes, descargar los productos de la hidrólisis de los triacilglicéridos que transportan a los tejidos subyacentes. Las IDL son de menor tamaño y enriquecidos proporcionalmente de colesterol y apo E, estas son reconocidas por los receptores hepáticos de la apo E o por los B/E para ser internados en los hepatocitos, mientras que otra proporción es transformada en LDL mediante un proceso dependiente de la actividad de la triacilglicérido lipasa hepática, este proceso enriquece proporcionalmente a la LDL en esteres de colesterol y pierde los triacilglicéridos y la apo E, presentes en la IDL. La Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. 40 LDL posee una única apoliproteína (la apo B-100) y un alto contenido de esteres de colesterol, las cuales al ser reconocidas por receptores hepáticos y extrahepáticos, descargan el colesterol que transportan en los diferentes tejidos correspondientes, mientras que las HDL realizan el proceso de transporte inverso del colesterol, en donde intervienen la LTP, y la LCAT, las cuales permiten la salida del colesterol de los tejidos extrahepáticos para ser transportado al hígado (Herrera, 1994). Por lo tanto, los seres humanos obtienen grasas de la dieta, movilizando grasas almacenadas en tejidos especializados, tejido adiposo e hígado, este ultimo convierte en grasas los glúcidos que se encuentran en exceso en la dieta para exportarlos al tejido adiposo (Mathews y col, 2003; Lehninger, 2008). Además, los triacilglicéridos de la dieta suministran 40 % ó más del total de energía requerida diariamente por los humanos en países industrializados, además cubren más de la mitad de las necesidades energéticas de algunos órganos, como el hígado, corazón y músculo esquelético en reposo. (Mathews y col, 2003; Lehninger, 2008). Enzimas Las enzimas son sustancias de naturaleza proteica, en general, cuya función es la de catalizar o acelerar la velocidad de las reacciones químicas (metabolismo) que tienen lugar en el organismo, siempre que sea termodinámicamente posible (Stryer y col, 2004). Son grandes proteínas en cuya estructura globular se entrelazan y se pliegan una o más cadenas polipeptídicas, que aportan un Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. 41 pequeño grupo de aminoácidos para formar el sitio activo o lugar donde se adhiere el sustrato y donde se realiza la reacción. Como todos los catalizadores, las enzimas funcionan disminuyendo la energía de activación (∆G‡) para una reacción, así se acelera sustancialmente la velocidad de la reacción (Koolman y col, 2004). Además, Las enzimas no alteran el balance energético de las reacciones en que intervienen, ni modifican, por lo tanto, el equilibrio de la reacción, pero consiguen acelerar el proceso incluso millones de veces (Koolman y col, 2004). Su importancia radica en que si una enzima del organismo esta ausente, a consecuencia de algún defecto hereditario, queda bloqueada la transformación química que debería regular. En consecuencia, hay productos celulares que dejan de sintetizarse o catabolizarse, de modo que se acumula una cantidad excesiva de otro producto metabólico que lesiona los tejidos, o impide que ciertos materiales intracelulares atraviesen la membrana celular (Stryer y col, 2004) Clasificación de las Enzimas A cada órgano le corresponde, según su función, una distinta dotación enzimática de sus células; incluso células análogas de animales diversos poseen enzimas diferentes. Algunas enzimas son proteínas conjugadas, es decir, unidas a un grupo prostético, actuando sólo cuando mantienen la íntima unión con el mismo, existen otras que precisan para su acción sustancias de naturaleza orgánica, denominadas coenzimas, que están unidas lábilmente a la enzima o que se unen a ella sólo en el momento en que ésta efectúa su acción sobre el sustrato. las Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndromemetabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. 42 holoenzimas son las que efectúan su acción sin la colaboración de ninguna sustancia, mientras que las demás se denominan apoenzimas, Otros grupos de enzimas denominadas iones activadores sólo actúan en presencia de determinados iones, con los que no se encuentran unidas de modo suficientemente fijo (pueden separarse mediante diálisis), por lo que no se las considera grupos prostéticos. También pueden constituirse en forma de proenzimas (enzimas inactivas) y ser activadas por determinadas circunstancias o sustancias (enzimas digestivas y de la coagulación). Para dar consistencia a la clasificación de las enzimas en 1964 la IUB (International Union of Biochemistry) estableció una Comisión Internacional de Enzimas con el fin de establecer una nomenclatura para su clasificación en base al tipo de reacción que catalizan (Stryer y col, 2004). Las enzimas se clasificaron en seis grupos principales, correspondientes por sus términos a las reacciones que cada una de ellas ejerce sobre el sustrato. Estos grupos se subdividen, según el tipo de sustrato y los átomos concretos que son sensibles a sus acciones. Estos seis grupos se muestran en la Tabla II. Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. 43 Tabla II. Clasificación de las enzimas. Grupo Acción Oxidoreductasas Tienen relación con las oxidaciones y las reducciones biológicas que intervienen de modo fundamental en los procesos de respiración y fermentación. Extraen dos átomos de hidrógeno. Catalizan las oxidaciones de muchas moléculas orgánicas presentes en el protoplasma. Transferasas Transfieren grupos activos (obtenidos de la ruptura de ciertas moléculas) a otras sustancias receptoras. Suelen actuar en procesos de interconversiones de azucares, de aminoácidos, etc. Hidrolasas Verifican reacciones de hidrólisis con la consiguiente obtención de monómeros a partir de polímeros. Suele ser de tipo digestivo, por lo que normalmente actúan en primer lugar. Esta clase de enzimas actúan normalmente sobre las grandes moléculas del protoplasma, como son la de glicógeno, las grasas y las proteínas. La acción catalítica se expresa en la escisión de los enlaces entre átomos de carbono y nitrógeno (C-Ni) o carbono oxigeno (C-O); Simultáneamente se obtiene la hidrólisis Isomerías Actúan sobre determinadas moléculas obteniendo de ellas sus isómeros de función o de posición. Suelen actuar en procesos de interconversión Liasas Realizan la degradación o síntesis (entonces se llaman sintetasas) de los enlaces denominados fuertes sin ir acoplados a sustancias de alto valor energético. Ligasas Realizan la degradación o síntesis de los enlaces fuertes mediante el acoplamiento a sustancias ricas en energía como los nucleótidos del ATP Fuente: (Stryer y col, 2004) Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. 44 Coenzimas Actualmente se utiliza el término coenzima únicamente para designar aquellos grupos prostéticos que, por estar débilmente unido a una enzima, puede separarse fácilmente de él. El grupo prostético (Coenzima) recibe también el nombre de cofactor, pues sin él la enzima no puede desempeñar su función, puede estar constituido por un solo ion metálico o por una determinada molécula orgánica de estructura macromolecular; la naturaleza del cofactor determina la especificidad de la enzima respecto a la reacción química en la que interviene (Jaramillo, 2004). Un gran numero de sustancias, de composición muy variada, actúan como coenzimas, entre las que se destacan por reacciones metabólicas en las que intervienen: • La Nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) • Los derivados de la Profirina ferruginada. • Adenosin Trifosfato (ATP) • Coenzima A Coenzima A Esta constituida por un nucleótido que esta unido a una vitamina de complejo B, posee la capacidad de poder desprenderse del grupo Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. 45 sulfihídrilo (-SH) que posee con liberación de mucha cantidad d energía, desempeñando un papel similar al ATP. Interviene en las reacciones catabólicas de los lípidos y en el proceso de respiración (Jaramillo, 2004). Lipasas Son enzimas lipolíticas que pertenecen al grupo de las hidrolasas y actúan en los enlaces tipo éster carboxilo presentes en el triacilglicérido (Figura 4), liberando ácidos grasos y glicerol. Las lipasas son enzimas versátiles que catalizan la hidrólisis de los enlaces éster principalmente, además de ser altamente estero-selectivas, ya que algunas sólo reconocen la configuración R o S del centro quiral del sustrato (Min y col, 2002). “Lipasa” o “enzima lipolítica” son términos genéricos que incluyen dos grupos: (1) carboxilesterasas (EC 3.1.1.1) y (2) lipasas “auténticas” o “Triacilglicéridos éster hidrolasas” (EC 3.1.1.3), aunque a veces también se incluyen otras enzimas que actúan sobre acilglicéroles y otros lípidos similares como las cutinasas, las fosfolipasas y las lipoproteína lipasas. El único criterio aceptado por el momento para diferenciar a las carboxilesterasas de las lipasas “auténticas” corresponde a la especificidad de sustrato. Las lipasas “auténticas” son específicas para acilglicéroles y otros ésteres con ácidos grasos de cadena larga (≥ 10 átomos de carbono), siendo la trioleína su sustrato de referencia, mientras que las carboxilesterasas actúan específicamente sobre acilglicéroles de cadena corta (< 10 átomos de carbono) y otros ésteres simples, siendo la tributirina su sustrato estándar (Sánchez, 1998) Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. 46 (Ludeña, 2004) Figura 3: Hidrólisis y síntesis de acilglicéridos mediante lipasas. Las lipasas se pueden clasificar en tres grupos de acuerdo a su especificidad por el sustrato: el primer grupo no muestra especificidad con respecto a la estructura química del ácido graso ni especificidad posicional, el segundo grupo muestra preferencia por la estructura de los ácidos grasos y el tercer grupo hidroliza los enlaces tipo éster primario (Ludeña, 2004). Los enzimas de la oxidación de los ácidos grasos en las células animales se localizan mayormente en la matriz mitocondrial y en el retículo endoplasmático, en la matriz mitocondrial se lleva a cabo un sistemas de oxidación para introducir dobles enlaces cis significativamente diferente al utilizado en el retículo endoplasmático, en donde el sistema del retículo endoplasmático a veces se ha sido denominado oxidasas de función mixta, ya que los enzimas oxidan dos sustratos simultáneamente (Lehninger, 2000). Determinación del índice de la actividad de la Estearoil Coenzima a Desaturasa y su relación con el síndrome metabólico y con el índice de masa corporal en adultos pertenecientes a la Cohorte CDC de Canarias en Venezuela. 47 La reacción de para activar el acido graso se realiza catalizando la formación de un enlace tioéster entre el grupo carboxilo del ácidos graso y el grupo tiol de la coenzima A para generar el acil-graso-CoA (Figura 5) (Lehninger, 2000). Á𝐜𝐢𝐝𝐨 𝐠𝐫𝐚𝐬𝐨 + 𝐂𝐨𝐀
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