Técnicas moleculares

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43Capítulo
Jorge E. Zavala Castro
Contenido
Aunque estos métodos son confi ables y ofrecen valores 
adecuados de especifi cidad y sensibilidad, las reacciones cru-
zadas producían errores en los diagnósticos y originaban la 
necesidad de recurrir a varias pruebas para establecer la cau-
sa exacta de la enfermedad en cuestión. Con el surgimiento 
de las técnicas moleculares se alcanzaron nuevas fronteras de 
especifi cidad y se aumentó la sensibilidad de las pruebas has-
ta poder detectar 1/12 000 de parásito, es decir, hasta 0.025 
fentogramos de DNA en muestra de sangre (2.5 10−8 g).
En este capítulo se tratan primero las técnicas molecu-
lares más comunes que se utilizan en la actualidad para las 
pruebas de diagnóstico. Debido a su sensibilidad, especifi ci-
dad o facilidad de administración, estas técnicas demostra-
ron ser muy útiles en la lucha contra diversas enfermedades 
parasitarias, y se aplican de manera rutinaria en varios la-
boratorios a lo largo del país. Por último, se describen bre-
vemente algunas técnicas para estudiar los parásitos, que 
conducen al entendimiento de los procesos básicos que re-
gulan el desarrollo, el ciclo de vida, los mecanismos de inva-
sión y la relación que establecen con sus huéspedes.
Sondas de DNA
Hibridación 
En muchas ocasiones es posible encontrar fragmentos de 
DNA en el genoma de los microorganismos, los cuales pue-
den servir de sondas para identifi car específi camente la pre-
sencia del DNA del parásito en las muestras de los pacientes. 
Introducción
El avance en el conocimiento de los procesos moleculares 
que ocurren en los organismos eucariotas y procariotas 
tuvo gran impulso en los últimos años debido al perfecciona-
miento de innumerables técnicas moleculares. En el campo 
de la parasitología por fi n se pudieron estudiar los procesos 
básicos que ocurren en los parásitos con objeto de desarrollar 
estrategias más efi caces de control, prevención y erradicación 
de enfermedades que afectan a las diferentes poblaciones del 
mundo.
Una de las principales aportaciones de la tecnología 
molecular es la generación de métodos de diagnóstico más 
sensibles y específi cos para identifi car a los patógenos que 
afectan a las diferentes especies de animales y plantas de in-
terés económico, pero sobre todo al ser humano.
Con el fi n de controlar los brotes de enfermedades en-
tre la población humana y en mamíferos de importancia 
económica, se pusieron en marcha sistemas de vigilancia 
epidemiológica a nivel estatal y nacional en México, los cua-
les se benefi ciaron con el perfeccionamiento de las técnicas 
de biología molecular para establecer diagnósticos apropia-
dos y tempranos. Antes de esta etapa, que se podría llamar 
“era molecular”, los métodos de diagnóstico existentes se 
basaban en la observación directa de los microorganismos y 
en la utilización de las reacciones inmunológicas que gene-
raban en el huésped, como las intradermorreacciones, y el 
desarrollo de métodos de detección de anticuerpos (p. ej., 
prueba ELISA), hemaglutinación directa e indirecta (HA) e 
inmunofl uorescencia (IF).
Técnicas moleculares 
para el estudio de parásitos
■ Introducción
■ Sondas de DNA
■ Antígenos específi cos
■ Herramientas moleculares y otras 
técnicas
La detección se logra por hibridación en soportes sólidos 
utilizando papel de nitrocelulosa o de nailon (Southern 
blot), en condiciones de temperatura y salinidad que permi-
tan sólo el emparejamiento de la sonda con la secuencia 
complementaria específi ca.
En este método se requiere identifi car la secuencia es-
pecífi ca en el genoma del parásito, y conservarla y propagar-
la para obtener sufi cientes copias utilizando una molécula 
de DNA llamada plásmido. El plásmido es una molécula de 
DNA circular de doble cadena que se encuentra en forma 
natural en varias especies de bacterias. Son elementos géni-
cos extracromosómicos que poseen la información necesa-
ria para replicarse dentro de las bacterias, y que codifi can 
para enzimas que confi eren alguna ventaja a los microor-
ganismos que los poseen. Entre esas enzimas se pueden en-
contrar genes con resistencia a algún antibiótico, lo cual 
permite seleccionar a las bacterias que los presentan (fi gura 
43-1).
Una vez amplifi cada la secuencia se retira el plásmido 
por medio de enzimas de restricción, las cuales reconocen 
secuencias específi cas que fl anquean a la sonda y la liberan. 
Cuando la sonda es liberada, se separa y purifi ca eliminan-
do el resto del plásmido mediante electroforesis en geles de 
agarosa; por último, se “marca” por diversos métodos (fi -
gura 43-2). La “marca” de la sonda se efectúa utilizando nu-
cleótidos que contienen una molécula, la cual sirve para 
identifi carla más tarde; dicha molécula puede ser un isótopo 
radiactivo, una enzima para una reacción colorimétrica o 
una para luminiscencia química. Por otra parte, el DNA ex-
traído de la muestra es digerido con las enzimas de restric-
ción y se transfi ere a un soporte sólido (que por lo regular es 
un papel de nitrocelulosa o nailon), para que esté inmovili-
Sitio de inserción de la
secuencia de DNA
Genes de resistencia
a antibióticos
Figura 43-1 Esquema de un plásmido.
Figura 43-2 Esquema del marcaje de una sonda molecular con el método de iniciadores al azar (random primer).
Iniciadores
Nucleótidos
Polimerasa
de DNA
Nucleótido
marcado
Fragmentos de DNA marcados
zado y expuesto a la sonda de diagnóstico. La presencia de 
una señal que produce la sonda indica que la reacción es 
positiva (fi guras 43-3 y 43-4).
La técnica permite analizar varias muestras a la vez, lo 
que agiliza el proceso y reduce el costo. Cuando la efectivi-
dad de la sonda es indiscutible se puede utilizar una varian-
te de esta técnica, consistente en usar gotas de los DNA que 
Capítulo 43 Técnicas moleculares para el estudio de parásitos354
serán analizados; las gotas se colocan en los soportes sólidos 
y se someten a evaluación (challenge) con la sonda previa-
mente marcada (fi gura 43-5).
Hibridación in situ
La hibridación in situ es una herramienta utilizada para de-
tectar y localizar secuencias de ácido nucleico en prepara-
ciones de tejido. Se puede utilizar para detectar DNA y 
RNA; además, proporciona información acerca del sitio de 
la expresión de genes, del análisis de la distribución y loca-
lización de microorganismos intracelulares, así como del 
mapeo de cromosomas, entre otros. Es posible aplicar méto-
dos radiactivos, fl uorescentes, directos con oro coloidal o 
colorimétricos, y ya se perfeccionaron métodos para diag-
nóstico en tejidos con parafi na y sin ella.
Al igual que en la hibridación en soportes sólidos, es 
necesario contar con una sonda específi ca para la hibrida-
ción in situ, la cual se marca mediante el mismo método con 
nucleótidos que contienen los isótopos radiactivos, las enzi-
mas o el oro coloidal para poder detectarla después.
Antígenos específi cos
Proteínas recombinantes
Las técnicas actuales de clonación, expresión y purifi cación 
de proteínas in vitro permiten utilizar antígenos específi cos 
para diagnosticar numerosas enfermedades.
Las proteínas específi cas de los parásitos de interés se 
clonan en vectores de DNA que permiten su expresión y 
posterior purifi cación en cantidades propias para ser usadas 
en pruebas de diagnóstico. Se llaman proteínas recombi-
nantes porque el vector contiene la secuencia de una proteí-
na de fusión, parte de la cual se “recombina” con la proteína 
clonada durante su transcripción y expresión. Este frag-
mento permite identifi car la proteína blanco, y en muchas 
ocasiones también facilita la purifi cación (fi gura 43-6).
Los antígenos específi cos obtenidos por este método 
se usan en pruebas de diagnóstico específi cas para las en-
fermedades parasitarias. Los métodos más comunes para 
este fi n son la inmunodetección en soportes sólidos (Wes-
tern blot) y la prueba ELISA (Enzyme Linked Immunosor-
bent Assay).
Inmunodetección
En la inmunodetección se transfi erenlos antígenos específi -
cos a soportes sólidos (papel de nitrocelulosa) y se evalúan 
(challenge) con el suero de los pacientes sospechosos. Luego 
se añaden anticuerpos (anticuerpos secundarios) que con-
tienen alguna enzima (por lo regular, peroxidasa o fosfatasa 
alcalina) y se guían contra las IgG que pudieran haber esta-
do presentes en los sueros de los pacientes que se encuentren 
unidas a las proteínas específi cas. La reacción se revela al 
añadir el sustrato de la enzima utilizada, lo cual genera una 
reacción colorimétrica visible en el papel de nitrocelulosa. 
La aparición de la señal indica las muestras positivas.
Esta técnica es menos sensible que la de hibridación, 
pero tiene la ventaja de ser menos costosa, más sencilla y 
puede aplicarse a varias muestras a la vez porque el papel de 
nitrocelulosa puede ser cortado en tiras de 0.5 a 1 cm de 
ancho y servir cada una de ellas para el diagnóstico de un 
Electroforesis
Transferencia
Revelado
y detección
Hibridación con sonda
Exposición
Figura 43-3 La técnica de hibridación permite detectar la presencia 
de una secuencia específi ca dentro del DNA.
Figura 43-4 Uno de los métodos para detectar DNA de interés es uti-
lizar nucleótidos marcados con isótopos radiactivos. La presencia de 
una señal opaca en una película para rayos X indica una señal positiva.
Figura 43-5 Dot blot con muestras de DNA provenientes de heces de 
triatomídeos infectados con T. cruzi.
Control positivo
Control negativo
Antígenos específi cos 355
paciente (fi gura 43-7). También es importante el hecho de 
que una vez transferida la proteína al papel de nitrocelulosa, 
es posible almacenar éste a –20 °C o –70 °C por largo tiempo.
Prueba ELISA
La prueba ELISA se optimizó con el uso de antígenos específi -
cos para el diagnóstico. La prueba se basa en el reconocimien-
to de los antígenos parasitarios por parte de los anticuerpos 
presentes en los sueros de los pacientes. El reconocimiento 
se logra mediante un anticuerpo secundario utilizando el 
mismo principio del Western blot. Con esta prueba se puede 
determinar cuantitativamente la reacción antígeno-anticuer-
po (fi gura 43-8). La sensibilidad es similar a la de Western 
blot, pero la sencillez de la técnica y la facilidad de aplicarla a 
grandes cantidades de muestras la convierten en la prueba 
de elección para muchas enfermedades, sobre todo cuando 
se utiliza en estudios epidemiológicos extensos.
El punto débil de esta prueba serían las reacciones cru-
zadas que producen falsos positivos, o los falsos negativos 
obtenidos por no existir una respuesta inmunitaria apropia-
da en el huésped. Es muy importante contar con controles 
positivos y negativos que se apliquen en cada prueba practi-
cada. La prueba es muy valiosa si se cuenta con una proteína 
específi ca para el parásito que se desee diagnosticar, pero 
sobre todo que sea una proteína inmunógena que genere 
una adecuada respuesta inmunitaria en el huésped.
Figura 43-6 Esquema de un plásmido de expresión que contiene la 
secuencia clonada de una proteína que sirve para diagnóstico. La pro-
teína se expresa como híbrido (recombinante) que contiene parte de la 
proteína de fusión y la totalidad de la proteína clonada.
Figura 43-7 Estudio Western blot para diagnóstico. Los sueros de los 
pacientes se ponen en contacto con la tira de papel de NC que contie-
ne una proteína recombinante específi ca. El carril 1 es el control nega-
tivo y el carril 2 el control positivo.
Figura 43-8 La prueba ELISA para el diagnóstico de numerosas enfer-
medades causadas por parásitos es el estudio de elección cuando se 
cuenta con un antígeno específi co.
Sitio de inserción de la
secuencia de DNA
Proteína
recombinante
Proteína de
fusión
Radioinmunoensayo
Las proteínas recombinantes se utilizan para generar anti-
cuerpos específi cos que las reconozcan en animales de ex-
perimentación. Los anticuerpos específi cos generados con-
tra las proteínas de diagnóstico se usan para analizar 
muestras de tejidos en busca de parásitos intracelulares y de 
otros microorganismos patógenos. La técnica se basa en la 
permeabilización de las células del tejido por analizar con 
objeto de que los anticuerpos entren al espacio intracelular 
1 2
Capítulo 43 Técnicas moleculares para el estudio de parásitos356
y se unan a las proteínas del parásito que se encuentran en 
la membrana externa de éste. Después se utilizan anticuer-
pos secundarios marcados con enzimas colorimétricas, oro 
coloidal o radiactividad, los cuales sirven para la identifi -
cación.
Reacción en cadena de la polimerasa 
(PCR)
A principios de la década de 1970-1979 fue descubierta una 
polimerasa de DNA que trabaja a elevadas temperaturas, lo 
que permitió elaborar una de las técnicas más difundidas y 
utilizadas para diagnosticar numerosas enfermedades de 
los últimos tiempos. Esta técnica se llama reacción en cade-
na de la polimerasa (PCR, del inglés polimerase chain reac-
tion). La polimerasa de Th ermus aquaticus (polimerasa de 
Taq) tiene su punto óptimo de actividad a 72 °C y resiste 
temperaturas de más de 94 °C, lo que permite obtener tem-
peraturas adecuadas para la desnaturalización del DNA y 
proporciona la oportunidad de alcanzar temperaturas de 
alineamiento elevadas, lo cual ofrece la facultad de diseñar 
iniciadores específi cos para detectar secuencias de DNA de 
los parásitos sujetos a diagnóstico.
La amplifi cación exponencial de las secuencias blanco 
aumenta la sensibilidad del método de manera importante, 
ya que permite detectar hasta más de 1/20 000 de parásito 
por muestra que habrá de ser analizada, que puede ser san-
gre, tejido, orina, líquido cefalorraquídeo, etcétera.
La técnica se basa en la identifi cación de una secuencia 
específi ca en el genoma del microorganismo de interés, y 
que de preferencia se repita muchas veces en su DNA para 
que la técnica sea más sensible. Una vez identifi cada la se-
cuencia, se diseñan iniciadores que la fl anqueen, pero que 
estén dirigidos en sentido contrario entre sí. Se recomienda 
que éstos contengan cantidades similares de G y C, de tal 
manera que la temperatura de alineamiento con la secuencia 
blanco sea similar, ya que a mayor contenido de G y C, ma-
yor la temperatura de alineamiento permitida (fi gura 43-9). 
Las muestras de DNA obtenidas del paciente (DNA del pa-
ciente y DNA del parásito) se someten a varios ciclos de re-
acción en presencia de la polimerasa de Taq, cada uno de los 
cuales consiste en un tiempo de desnaturalización del DNA, 
que puede ser de 15 s a 1 min, tiempo de alineamiento cuya 
temperatura depende del contenido de G y C de los inicia-
dores (a mayor temperatura, mayor especifi cidad), y un 
tiempo de elongación durante el cual se sintetizan las cade-
nas del DNA blanco. La reacción puede ser de 25 a 40 ciclos, 
según la abundancia de la secuencia por diagnosticar.
Otra ventaja que ofrece este método de diagnóstico es 
la pequeña cantidad de DNA necesario para realizarlo, ya 
que la reacción exponencial permite utilizar hasta un mí-
nimo de 10 ng de DNA en la reacción. Las desventajas son 
la necesidad de un equipo especializado y contar con áreas 
absolutamente especiales para el aislamiento y prepara-
ción de las muestras, puesto que un área o un manejo 
inadecuado puede favorecer con mucha facilidad la conta-
minación de las muestras, lo que originaría diagnósticos 
positivos falsos.
Los productos de la amplifi cación se observan en geles 
de agarosa o poliacrilamida, y la presencia de una banda del 
tamaño esperado se interpreta como una reacción positiva 
(fi gura 43-10).
DNA de doble cadena
DNA desnaturalizado
Alineamiento y elongación
Primers
(iniciadores)
Nucleótidos
Polimerasa Taq
32 a 35 ciclos de:
1. Desnaturalización a 94-96 °C
2. Alineamiento de los primers
3. Elongación de la cadena blanco
Figura 43-9 Esquema representativo de una técnica PCR. Esta prueba se basa en la replicación exponencial de una secuencia específi ca para algún 
parásito. Es una prueba muy sensible.Antígenos específi cos 357
países, e impulsarán los programas adecuados de control y 
erradicación de estas enfermedades.
PCR en tiempo real
En 1992, Russell Higuchi y colaboradores describieron una 
modifi cación de la técnica de PCR, permitiendo la detec-
ción simultánea de más de una secuencia específi ca de DNA 
y dando paso al desarrollo de la técnica de PCR en tiempo 
real.
La reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real 
(o PCR cuantitativa) permite amplifi car y cuantifi car en 
forma absoluta varias secuencias específi cas al mismo tiem-
po. El principio de la técnica se basa en la reacción de PCR, 
utilizando DNA como molde, deoxinucleótidos, enzima 
Taq polimerasa (o transcriptasa reversa) y cebadores especí-
fi cos; sin embargo, la diferencia con la PCR convencional es 
que la PCR en tiempo real utiliza fl uorocromos, que son de-
tectados en diferentes longitudes de onda por los sensores 
habilitados en un termociclador de tiempo real.
Cada señal es medida en cada ciclo de amplifi cación, 
lo que le da la característica de ser una medición “en tiempo 
real”, y cada fl uorómetro utilizado representa la amplifi ca-
ción de una secuencia específi ca.
Entre las ventajas que presenta la PCR en tiempo real 
comparado con la PCR convencional pueden mencionarse 
la capacidad de análisis simultáneo de más de una secuen-
cia específi ca, su mayor sensibilidad (que reduce el riesgo de 
falsos negativos), menor tiempo requerido para el resultado 
y menor probabilidad de contaminación, con lo que dismi-
nuye los falsos positivos.
PCR in situ
Una aplicación de la técnica de PCR es su uso en tejidos, y se 
denomina PCR in situ. Esta técnica es muy útil para detec-
tar hasta 10 copias de DNA del parásito por célula en cortes 
de tejidos frescos o en parafi na. Para la técnica se requiere 
fi jar o preparar los tejidos, permeabilizar las membranas ce-
lulares y la detección. Los tejidos que están embebidos en 
parafi na primero deben ser tratados para retirar la parafi na, 
y los tejidos frescos se fi jan con formalina al 10%. La per-
meabilización de las membranas se realiza de manera enzi-
mática, y la reacción de amplifi cación se lleva a cabo según 
la técnica normal de PCR. Aunque la metodología puede 
llegar a detectar hasta una copia de un gen en 1 μg de DNA 
celular, es necesario contar con un equipo especializado 
para efectuar la reacción (fi gura 43-11).
La PCR in situ es una herramienta invaluable para el 
diagnóstico de parásitos intracelulares en situaciones donde 
la infección es tan baja que no puede ser detectada por otros 
medios, sobre todo cuando los parásitos ya no se encuen-
tran circulando en sangre periférica, como ocurre en el caso 
de la enfermedad de Chagas. Sin embargo, el costo del 
equipo para realizarla es un impedimento para utilizar 
esta técnica en países no desarrollados y laboratorios de 
investigación.
Con el avance de las técnicas se han creado paquetes 
comerciales aplicables en casi cualquier laboratorio de diag-
nóstico e investigación, por lo que es fácil comprender que 
cada vez están más al alcance los métodos de vanguardia de 
diagnóstico molecular, que permitirán establecer diagnósti-
cos certeros y oportunos de las enfermedades parasitarias 
que aquejan a América Latina. Junto con los programas de 
salud adecuados, estas herramientas serán útiles para tener 
una panorámica epidemiológica real de los padecimientos 
ocasionados por parásitos que sufren los habitantes de estos 
Figura 43-10 Electroforesis en gel de agarosa de los productos de una 
PCR para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas. En el carril 1 se 
observa el control positivo, y en el carril 2 el control negativo de la 
reacción.
Figura 43-11 Esquema de los pasos que requiere una reacción de PCR in 
situ; esta prueba permite detectar DNA del parásito en tejidos fi jados.
Permeabilización
de la membrana Polimerasa Taq Primers
(iniciadores)
Nucleótidos
PCR in situ
Revelado Ciclos de amplificación
de la secuencia blanco
Capítulo 43 Técnicas moleculares para el estudio de parásitos358
Las aplicaciones de la PCR en tiempo real incluyen la 
determinación de la carga viral (bacteriana o parasitológi-
ca) en una unidad biológica (sangre, líquido cefalorraquí-
deo, etc.), diagnóstico rápido y certero de varias patologías 
en una sola reacción, determinación de la expresión génica, 
detección de polimorfi smos genéticos, medicina forense, 
identifi cación de organismos genéticamente modifi cados, 
entre otras muchas nuevas aplicaciones que cada día se des-
criben en la literatura. 
Herramientas moleculares 
y otras técnicas
Bancos genómicos y de DNA 
complementario (cDNA)
Los bancos genómicos y de cDNA son representaciones del 
material genético de los organismos. Los bancos genómicos 
se generan con el DNA total de las células, y en ellos se en-
cuentra la representación de la totalidad del material genéti-
co. Respecto de los bancos de cDNA, éstos se crean utilizando 
el RNA (total o mensajero) y son bancos de expresión, es de-
cir, contienen las secuencias que se expresan en un momento 
determinado en condiciones específi cas.
En estos bancos se pueden localizar las secuencias que 
codifi can para los genes de interés en cierto estudio me-
diante sondas moleculares e hibridación (ya explicadas) y 
anticuerpos específi cos (fi gura 43-12). La metodología es si-
milar a la descrita para Southern blot y Western blot, res-
pectivamente, en donde primero se obtiene una réplica de 
DNA o de las proteínas expresadas en soportes sólidos, se 
fi ja a la membrana y se evalúan (challenge) con las sondas o 
anticuerpos de elección.
Con estas herramientas es posible efectuar un estudio 
sistemático del contenido del material genético y de las pro-
teínas que se expresan en ciertas condiciones controladas. 
De igual forma, los bancos de cDNA son la fuente ideal para 
la búsqueda de proteínas específi cas que podrían servir 
para la generación de vacunas, fármacos o nuevos métodos 
de diagnóstico.
Análisis de polimorfi smos génicos
En muchas ocasiones es importante determinar las relaciones 
fi logenéticas o taxonómicas que presentan ciertos parásitos. 
El análisis del polimorfi smo génico se basa en la comparación 
de las diferencias que presentan los genomas de los parásitos 
entre sí o entre especies relacionadas.
Entre los métodos más utilizados para este fi n está la 
amplifi cación al azar del DNA polimórfi co (RAPD, del in-
glés random amplifi cation polimorphic DNA), que consiste 
en amplifi car de modo exponencial el DNA genómico utili-
zando la técnica de PCR con hexanucleótidos con secuen-
cias arbitrarias. Estas secuencias servirán de iniciadores en 
la PCR para amplifi car fragmentos de DNA al azar, que lue-
go se comparan en un gel de agarosa (fi gura 43-13).
Otro método es el del polimorfi smo en la longitud de 
los fragmentos de restricción (RFLP, del inglés restriction 
fragment lenght polimorphism). La técnica se basa en la uti-
lización de enzimas de restricción, las cuales reconocen 
secuencias específi cas dentro del DNA. La presencia o au-
sencia de esas secuencias produce fragmentos de diferentes 
tamaños, que después se analizan en geles de agarosa.
Figura 43-12 Autorradiografía de una búsqueda en un banco de cDNA. 
Cada una de las señales oscuras representa una placa lítica que contiene 
la secuencia que hibridó con las sondas moleculares. La fl echa indica la 
placa elegida para el análisis.
Figura 43-13 Análisis de las secuencias amplifi cadas al azar (RAPD) de 
cinco especies de parásitos relacionados entre sí. El análisis de cada una 
de las bandas que aparece en el gel de agarosa teñido con bromuro de 
etilo indica la relación fi logenética que existe entre ellas.
Herramientas moleculares y otras técnicas 359
Los espaciadores del cistrón ribosómico, así como el 
DNA de microsatélites, son otras técnicas utilizadas para 
este tipo de análisis, ya sea a través de hibridaciones con 
sondas específi cas o por medio de PCR.
Secuenciación
La obtenciónde la secuencia de fragmentos de DNA de in-
terés es otro método ampliamente empleado en el estudio 
de parásitos y otros organismos. Este método se basa en el 
uso de geles de poliacrilamidasa de alta resolución que per-
miten separar cadenas sencillas de DNA de entre 300 y 
1 000 bases con diferencias de un nucleótido entre ellas (fi -
gura 43-14). Conocer la secuencia de nucleótidos de un 
fragmento de DNA particular permite, entre otras cosas, 
traducir la secuencia de aminoácidos presentes en la proteí-
na en cuestión, ejecutar comparaciones con otras secuencias 
provenientes de especies relacionadas con el fi n de determi-
nar el sitio adecuado para generar un método de diagnóstico 
específi co, producir las proteínas recombinantes para anali-
zar la función que podrían presentar dentro del parásito en 
estudio, y muchas otras aplicaciones prácticas.
La secuenciación se emplea cuando existe duda acerca 
del origen de una secuencia de DNA en particular, pero no 
es un método diagnóstico, sino principalmente una técnica 
de apoyo.
Transcripción inversa/PCR (RT-PCR)
La transcripción inversa es el proceso mediante el cual se 
genera una molécula de DNA a partir de una de RNA, es 
decir, lo contrario del proceso básico que ocurre normal-
mente. El descubrimiento de la transcriptasa inversa, una 
enzima codifi cada en el genoma de un virus, dio origen a 
este método que permite la generación de los bancos de 
cDNA descritos antes y a otros que se usan en el estudio 
de los procesos moleculares. Entre éstos se encuentra la RT-
PCR. Dicha técnica combina la transcripción inversa con la 
técnica de reacción en cadena de la polimerasa (fi gura 43-15).
Con esta técnica es posible detectar la presencia de 
cantidades muy pequeñas de la secuencia codifi cadora de 
algún gen en particular por medio del empleo de los inicia-
dores adecuados. Por esta particularidad, en algunos casos 
se utiliza como método de diagnóstico de algunas enferme-
dades; sin embargo, por ser el RNA una molécula muy lábil 
que puede degradarse con mucha facilidad, es necesario con-
tar con espacios adecuados para trabajar, sustancias que inhi-
ban la enzima RNasa y muchas otras condiciones que sólo 
permiten la aplicación de la técnica en laboratorios especia-
lizados.
Expresión diferencial
En ciertas condiciones los genes de los parásitos se expresan 
de manera regulada, es decir, pueden presentar una expresión 
diferencial. Los métodos y técnicas moleculares permiten 
controlar y medir esta expresión diferencial en condiciones 
de laboratorio en los parásitos en cultivo, sobre todo cuando 
se cuenta con una proteína clonada en un vehículo de expre-
sión. En este último caso, el comportamiento de la ex-
presión de la proteína se mide de modo directo en el mismo 
Figura 43-14 Imagen de parte de la secuencia de un gen de Trypanoso-
ma cruzi. Cada uno de los carriles contiene la terminación de la secuen-
cia en el nucleótido indicado en la parte superior.
Figura 43-15 Fotografía de un gel de agarosa que contiene el producto 
de una RT-PCR. Las bandas pueden ser clonadas y secuenciadas para 
corroborar el resultado.
 G A T C
Capítulo 43 Técnicas moleculares para el estudio de parásitos360
parásito, o en un huésped indirecto, que puede ser otro pa-
rásito o una bacteria.
Uno de los métodos existentes para realizar este tipo 
de análisis es el de la exposición diferencial (diff erential dis-
play), en donde puede observarse la expresión diferencial de 
ciertos genes en respuesta a condiciones controladas y com-
pararlos con los controles. Esta técnica permite conocer al-
gunos aspectos del comportamiento a nivel molecular que 
presenta el parásito en respuesta a los diferentes estímulos 
externos. La técnica se basa en la amplifi cación exponencial 
de una secuencia o secuencias de DNA obtenido del parási-
to en condiciones controladas, y la utilización de geles de 
secuenciación en donde se observa en forma simultánea el 
aumento o la disminución en la expresión de un gen o genes.
Aunque hasta el momento no se vislumbran límites en 
el desarrollo de nuevas técnicas de biología molecular que 
refuercen el conocimiento de los procesos biológicos de los 
parásitos, su uso y los benefi cios que traen consigo siempre 
estarán sujetos a los costos de aplicación. Sin embargo, es 
innegable el hecho de que han aportado grandes ventajas al 
género humano en su lucha contra los organismos patóge-
nos que lo aquejan.
Deteccion de fl uorescencia
Existen tres métodos principales para el monitoreo por 
fl uorescencia de la amplifi cación de DNA:
 1. Hidrólisis de iniciadores. Permite la liberación y de-
tección de fl uorómetros, los cuales son detectados por 
equipos especiales y se genera lo que se conoce como 
PCR en tiempo real.
Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real. 
El desarrollo de mejores equipos de PCR con la capacidad 
de detectar señales luminiscentes de diversos tipos ha 
dado lugar al desarrollo de una nueva técnica utilizada 
en el diagnóstico y cuantifi cación de diversos organis-
mos: la PCR en tiempo real. Esta técnica, junto con la 
RT-PCR en tiempo real, es de utilidad para el diagnós-
tico y cuantifi cación de virus, bacterias y parásitos de 
importancia médica. La capacidad de detección de este 
método supera incluso a la de una PCR común. La 
cuantifi cación de virus en una carga viral puede ser 
tan exacta como la de un virus/ml de sangre si las con-
diciones se encuentran controladas y estandarizadas. 
Incluso se pueden utilizar varios tipos de fl uorómetros 
a la vez para realizar pruebas “Multiplex”, en donde se 
utilizan iniciadores de diferentes enfermedades, o va-
riantes serológicas de una misma, con marcadores 
fl uorométricos diferentes, y la amplifi cación puede ser 
monitoreada desde el momento en que comience el au-
mento exponencial de la secuencia blanco (fi gura 43-16).
 2. Agentes de unión al DNA. La utilización de agentes 
fl uorométricos que tienen la capacidad de unir DNA es 
otra manera de realizar la PCR en tiempo real. Estos 
agentes emiten una señal fl uorométrica que es detecta-
da por el mismo equipo que se utiliza en la hidrólisis de 
DNA. La desventaja de estos agentes en comparación 
con el que utiliza la hidrólisis es que puede haber una 
luminiscencia inespecífi ca. La ventaja es que no se tie-
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
Ciclos
Figura 43-16 Gráfi ca de una cuantifi cación por PCR de tiempo real del virus del VIH. Cada línea indica la presencia del 
virus en cantidades de 1010 (línea azul) hasta 101 (línea verde).
Herramientas moleculares y otras técnicas 361
nen que diseñar iniciadores especiales, ya que los que 
se utilizan en una reacción normal de PCR pueden 
usarse para una reacción de tiempo real con el agente 
de unión al DNA.
 3. Sondas de hibridación. Las sondas de hibridación son 
secuencia de DNA complementarias a secuencias blan-
co que se deseen utilizar para el diagnóstico de micro-
organismos. Las sondas de hibridación trabajan con 
fl uoróforos que son excitados por las longitudes de 
onda apropiadas, y emiten luminiscencia cuando se 
encuentran hibridadas con las secuencias blanco. Esta 
luminiscencia se incrementa con cada ciclo. 
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Capítulo 43 Técnicas moleculares para el estudio de parásitos362
	Capítulo 43. Técnicas moleculares
para el estudio de parásitos