tecnicas en bioquimica centrifugacion

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Tema #3 TÉCNICAS EN BIOQUÍMICA
HOMOGENIZACION DE UN TEJIDO
Se refiere a cualquier procedimiento que permita la ruptura de las estructuras que sostienen y unen las células, además de los mismos elemento subcelulares.
FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR
•Es un procedimiento mediante el cual se separan los componentes de una célula a través de métodos físicos.
CENTRIFUGACION
•Es un método por el cual se pueden separar sólidos de líquidos de diferente densidad.
•Se utiliza un centrifugadora, la cual imprime un movimiento rotatorio con una fuerza mayor que la gravedad, provocando la sedimentación de las partículas mas densas.
FUERZA CENTRÍFUGA RELATIVA
•Es la fuerza ejercida sobre las partículas (en Comparación con la fuerza de Gravedad), que hacen que estas se alejen del eje de rotación en forma radial.
•Ejemplo:
Una Centrifuga con un FCR de 500 xg, indica que se aplica una fuerza centrífuga 500 veces mayor a fuerza gravitacional.
COEFICIENTE DE SEDIMENTACIÓN
•Velocidad a la que se desplaza una partícula en el campo centrífugo unidad.
•Se calcula dividiendo su velocidad constante de sedimentación (en m/s) por la aceleración aplicada (en m/s2).
•El resultado tiene dimensiones de tiempo y se expresa habitualmente en svedbergs(S).
•Los valores de coeficientes de sedimentación no son aditivos.
CROMATOGRAFIA EN COLUMNA
•Es un método que aprovecha las diferencias de carga, tamaño, afinidad de unión u otras propiedades.
•Constituida por dos fases: La Estacionariay la Móvil.
•Diferentes tipos de Cromatografía:
–Cromatografía de Intercambio Iónico
–Cromatografía de Exclusión Molecular
–Cromatografía de Afinidad
CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO
•Aprovecha la diferencia de las cargas eléctricas.
•La matriz solida tiene grupos cargados negativamente (fase estacionaria).
•Las Proteínas cargadas positivamente, migraran más lentamente por la interacción con las fase estacionaria.
CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION MOLECULAR
•Separa proteínas según su tamaño.
•La fase estacionaria consiste en pequeñas partículas que tienen un tamaño calibrado.
•Las Proteínas más grandes no pueden atravesar por los poros por lo que toman el camino más corto (y más rápido).
CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD
•Se basa en la unión de Proteínas.
•La Fase Estacionaria son partículas que tienen un grupo químico unido covalentemente.
•Una proteína afín a este grupo químico particular, se unirá a las partículas de la columna, lo que retarda la migración.
ELECTROFORESIS
•Se basa en el desplazamiento de las Proteínas cargadas en un campo eléctrico.
•Es un muy útil método analítico.
•Además permite determinar propiedades cruciales de una proteína como su punto eléctrico o masa molecular aproximada.
•Se lleva a cabo generalmente en geles de Poliacrilamida.
•El desplazamiento de la proteína es en función de su tamaño y su forma
GELES DE AGAROSA
· Separación de Proteínas y ácidos nucleicos.
· Concentración = Tamaño de poros 
· Es Frágil
ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE)
Es un tipo de electroforesis donde las muestras se desnaturalizan en presencia de agentes desnaturalizantes (beta-mercaptoetanol, que destruye los puentes disulfuro, SDS (dodecilsulfato sódico) que desnaturaliza y recubre a la proteína). El SDS altera la conformación nativa de una proteína, por lo que se utiliza para determinar cuántas subunidades conforman las proteínas, su masa molecular y el número de proteínas, ya que se separan como cadenas polipeptídicas aisladas.
ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA (PAGE)
Consiste en separar a las proteínas según su peso molecular. Es el más utilizado, donde la molécula más liviana se desplaza más rápido por el campo eléctrico porque la más pesada necesita mayor fuerza para llegar.
ENFOQUE ISOELECTRICO
•Es un procedimiento usado para determinar el punto isoeléctrico de una Proteína.
•Cuando se aplica una mezcla de Proteínas, cada una de ellas se desplaza hasta que alcanza el pH que iguala su pI.
ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL
•Es la combinación secuencial del enfoque isoeléctrico y la electroforesis en gel con SDS.
ESPECTROFOTOMETRIA
•Es una técnica analítica que permite determinar la concentración de un compuesto en solución.
•Fundamento Teórico:
–Se basa en que muchas moléculas absorben luz a una longitud de onda especifica.
–A su vez la cantidad de luz absorbida, depende de forma lineal de la concentración.
–Para hacer este tipo de medidas se emplea un Espectrofotómetro.
ESPECTOFOTOMETRO
•Es un instrumento en el se puede seleccionar la longitud de onda de luz que pasa por una solución y medir la cantidad absorbida de la misma.
ONDAS ELECTROMAGNETICAS
En la espectrofotometría se emplean:
•Región UV: -longitudes de onda de 195-400 nm.
-Provoca daño a la visión y la piel
-Grupos Aromáticos, dobles, triples enlaces y enlaces Peptídico tienen su máxima aquí.
•Región Visible: -longitudes de onda 400-800 nm.
-Corresponde a las longitudes de onda que se transmiten, mas No se reabsorbe.
Cont. 5 Espectrofotometría
ONDAS ELECTROMAGNETICAS
•Región Visible: Corresponde a las longitudes de onda que se transmiten, mas No que se reabsorbe.
TRANSMITANCIA Y ABSORBANCIA
· Transmitancia: Fracción de potencia de luz que es transmitida por la cubeta una vez que el analito ha experimentado el proceso de absorción. Relación entre la radiación transmitida y la incidente.
· Absorbancia: Cantidad de potencia radiactiva absorbida por el analito presente en la cubeta una vez que ha experimentado el proceso de absorción. Se denomina absorción al proceso por el cual una especie, en un medio transparente, capta selectivamente ciertas frecuencias de la radiación electromagnética. La disminución de la intensidad de la radiación depende de la concentración del absorbente y de la longitud del camino recorrido por el haz.
LEY DE BEER
•Declara que la cantidad de luz absorbida por un cuerpo depende de la concentración en la solución
LEY DE LAMBERT
•Declara que la cantidad de luz absorbida por un cuerpo depende de la distancia recorrida por la luz.
LEY DE LAMBERT-BEER
•Es la combinación de ambas relaciones y expresa la relación entre la absorbanciade luz monocromática y la concentración de un cromóforoen solución.
CURVA DE CALIBRACION
•Es una representación gráfica de la concentración de una sustancia patrón en relación a la densidad óptica.
APLICACIONES
•Determinar la cantidad de concentración en una solución de algún compuesto.
•Para la determinación de estructuras moleculares.
•La identificación de unidades estructurales especificas ya que estas tienen distintos tipos de absorbancia(grupos funcionales o isomerías).
Tema #2 PROTEINAS (segunda parte)
ENLACE PEPTIDICO
•Es el enlace covalente formado por dos aminoácidos con la eliminación de una molécula de agua.
RESIDUOS DE AMINOACIDOS
•Así son llamadas las unidades de aminoácidos que forman un péptido.
NOMENCLATURA
Tetra péptido
Los péptidos se nombran iniciando por el residuo N-terminal, concluyendo con el sufijo “IL” cada residuo, hasta culminar en el residuo C-Terminal con el nombre del aminoácido completo.
•Alanil glutamil glicil - lisina
CLASIFICACIÓN SEGÚN SU COMPOCISIÓN
•Simples: Son aquellas compuestas exclusivamente por Aminoácidos.
•Complejas: Son aquellas compuestas por aminoácidos y poseen otros componentes orgánicos o inorgánicos.
NIVELES ESTRUCTURALES
Plegado Local		Plegado Global
ESTRUCTURA SECUNDARIA
•Conformación local de algunas partes del polipéptido.
•Las estructuras secundarias más habituales son las conformaciones en Hélice alfay Conformación en beta.
HELICE ALFA
•Estabilidad:
–Puentes de H2
•Restricciones:
–Carga Eléctrica
–Volumen
–Pro
–Gly
–Extremos
CONFORMACIÓN BETA
•Es una conformación mas extendida, en la cual el esqueleto de la cadena proteica esta extendido en zigzag.Cont. 9: Estructura Secundaria
GIROS BETA
•Esta estructura forma un giro cerrado de 180°en el que participan 4 aminoácidos.
CLASIFICACIÓN SEGÚN SU FORMA
•Proteínas Fibrosas:
Presentan cadenas polipeptídicas dispuestas en largas hebras. Constan mayoritariamente de un grupoúnico de estructura secundaria.
•Proteínas Globulares:
Presentan cadenas polipeptídicas dispuestas en forma globular o esférica. Contienen a menudo varios tipos de estructura secundaria.
ESTRUCTURAS TERCIARIAS
•Las más representativas tenemos:
–alfa-queratina
–Colágeno
–Fibroína de seda
–Estas proteínas comparten propiedades como fuerza, elasticidad o ambas cosas.
–Todas las proteínas fibrosas son insolubles en agua.
COLÁGENO
•Se encuentra en los tendones, cartílagos, matriz orgánica de los huesos y cornea del ojo.
•La hélice de Colágeno es única, distinta a la alfa-hélice.
•Es Levógira y tiene tres residuos aminoácidos por vuelta.
•Esta formada por tres cadenas polipeptídicas separadas llamadas cadenas alfas, que están superenrolladas una alrededor de la otra.
· La secuencia suele ser el Tripéptido Gly-X-Y
•“X” suele ser Prolina y “Y” suele ser Hidroxiprolina.
OXIGENO
•El Oxigeno no es muy soluble en agua.Ninguno de las cadenas laterales de los aminoácidos esta preparado para su unión.
•Este papel es desempeñado por ciertos metales de transición (hierro y cobre).
•El hierro suele estar unido a un Grupo Prostético llamado Grupo Hemo.
MIOGLOBINA
•Proteína de unión al Oxigeno relativamente simple.
•Costa de un único polipéptido de 153 aminoácidos con un grupo Hemo. Mr 16.700.
•Nivel Estructural Terciario.
•Su principal función es la de Almacén del Oxígeno.
•La unión del Oxígeno y la Mioglobina describe una curva hiperbólica.
· Proteína de unión al Oxigeno un poco mas compleja.
•Es Tetramérica, con dos cadenas alfas (141 aa cada una) y dos cadenas betas (146 aa cada una).
•Nivel Estructural Cuaternario.
•Su principal función es el Transporte del Oxigeno.
COOPERATIVISMO
•La unión del Oxígeno a la Hemoglobina produce un cambio conformacional.
PROPIEDADES ALOSTERICAS
•Una Proteína Alostérica es aquella en la que la unión de un ligando a un sitio, afecta a las propiedades de unión de otro ligando a otro sitio de la misma proteína.
•Efecto Borh:
–CO2
–H+
•2,3-Bifosfoglicerato (BPG)