Lab_de_Bioquimica_Informe_Practica_No_8

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Universidad Industrial de Santander 
Escuela de Química 
Laboratorio de Bioquímica, código 24726 
 
Universidad Industrial de Santander, Facultad de Ciencias Escuela de Química, Enero [2021] | 1 
Práctica No. 8. Determinación del Contenido de Glucógeno en 
Cianobacterias 
 
Juan José Almeida Calderón, 2170147; Maria Fernanda Suarez Castillo, 2132505 
Fecha de la elaboración de la práctica: 2020-12-17 
Fecha de presentación del informe: 2021-01-14 
 
Resumen 
La mayor cantidad de carbono contenido en las cianobacterias se presenta en forma de glucógeno acumulado 
durante la fotosíntesis debido a que, dicha molécula es una fuente vital de energía para el organismo. Estudios 
recientes han mostrado una fuerte correlación del metabolismo de glucógeno con mecanismos biológicos 
complejos. Dado que dichos mecanismos forman residuos complejos irreducibles se han propuesto ciertos 
procesos para redireccionar el carbono de los glucógenos contenidos en cianobacterias usando ingeniería genética. 
En el presente informe se analiza el artículo “Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria” [1], en 
el cual se muestra un modelo eficiente para la determinación del contenido de glucógeno en cianobacterias el cual 
puede ser realizado sin problemas en laboratorios especializados en ciencias biológicas. 
 
 
1. Introducción 
 
La fotosíntesis es el proceso en el cual, las 
cianobacterias, almacenan glucógeno en base al CO2 
suspendido en el ambiente (en presencia de luz). En 
ausencia de luz, el glucógeno se rompe por medio de 
la glucógeno fosforilasa, una enzima encargada de 
fragmentar el glucógeno en glucosa fosforilada y 
glucosa libre. 
 
Recientemente, el metabolismo de glucógeno en 
cianobacterias ha ganado cierto impulso, luego de 
mostrar una alternativa eficaz para obtener ciertos 
químicos y combustibles (de manera microscópica). 
Al modificar dicho metabolismo, es posible 
incrementar el rango de productos debido a que el 
glucógeno es parte esencial de las cianobacterias. 
 
Con el pasar de los años se han descubierto cierto 
tipo de procesos especiales en el metabolismo de 
glucógeno en las cianobacterias. Un ejemplo de ello es 
la aplicación de la cinética en el ciclo diel. También se 
ha descubierto cierto tipo de modificaciones 
producidas por genes específicos para la acumulación 
de glucógeno en las bacterias mencionadas. El ejemplo 
que más nos compete para esta práctica es el 
descubrimiento de la histidina quinasa PmgA y el 
ARN no codificante PmgR1 para el control de 
mutaciones. 
 
En esta práctica se describe un protocolo para el 
ensayo basado en enzimas en la cuantificación de la 
cantidad de glucógeno en dos especies de 
cianobacterias Synechocystis sp. PCC 6803 y 
Synechococcus sp. PCC 7002. 
 
2. Metodología 
 
1. Preparación 
 
1.1. Cultivos de cianobacterias 
 
1. Cultive la Synechocystis sp. PCC 6803 a 
30 °C en medio líquido BG11, con flujo 
constante de aire al 1% (v/v) de CO2. 
Ilumine el cultivo constantemente con luz 
a una densidad de fotones fotosintéticos 
de 50 µmol fotón/m2/s. 
 
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2. Cultive la Synechococcus sp. PCC 7002 
en un medio líquido A+ (también se puede 
utilizar el medio BG11), con flujo 
constante de aire al 1% de CO2. La 
temperatura debe estar configurada a 37 
°C. Iluminar el cultivo constantemente 
con luz a una densidad de fotones 
fotosintéticos de 150 µmol fotón/m2/s. 
3. Mida la densidad óptica (OD) del cultivo 
a 730 nm usando un cuenco con un paso 
óptico de 1 cm. Si los valores de OD son 
mayores a 0.8, asegúrese de diluir 
correctamente para obtener los valores 
apropiados de OD los cuales son 
proporcionales a la concentración celular. 
Nota: Los procedimientos descritos son 
adecuados para cultivos líquidos, con una 
densidad celular correspondiente a 2 o 
más de OD a 730 nm. Cuando el cultivo 
esté en la fase de crecimiento, en la cual 
se presenta un valor de 1 o menos a 730 
nm, concentre la densidad celular por 
centrifugación y resuspenda en un buffer 
o cualquier medio para llegar a un valor de 
2 o superior. 
1.2. Buffers y reactivos. 
 
1. Prepare 50 mM de buffer Tris-HCl a un 
pH de 8. 
2. Prepare 50 mM de buffer de acetato de 
sodio a un pH de 5. 
3. Prepare una solución de reserva de 8 
U/mL de amiloglucosidasa en un buffer de 
acetato de sodio a 50 mM con un pH de 5. 
4. Prepare una solución de reserva de 2 
U/mL de alfa-amilasa en un buffer de 
acetato de sodio a 50 mM con un pH de 5. 
5. Usando agua destilada, prepare una 
solución patrón de glucosa en un rango de 
0 a 100 µg/mL. 
6. Prepare el reactivo (GOD-POD) de un kit 
de ensayo D-glucosa (Formato 
GODPOD), siguiendo las instrucciones 
del producto. 
 
2. Determinación del peso celular seco 
(opcional). 
 
1. Transfiera 2 mL de un cultivo o una 
resuspensión celular (paso 1.1) a un tubo 
de 2.0 mL y centrifugue a 6000 x g a una 
temperatura de 4 °C por 5 minutos. 
Descarte el sobrenadante. 
2. Resuspenda el precipitado en 1 mL de 
agua y centrifugue a 6000 x g a una 
temperatura de 4 °C por 5 minutos. 
Descarte el sobrenadante y resuspenda el 
precipitado en 0.5 mL de agua. 
3. Transfiera la suspensión a una bandeja de 
aluminio pesada previamente. Transfiera 
la bandeja a un horno de secado a 105 °C 
durante toda la noche. Nota: Es 
importante que la bandeja sea manejada 
con los materiales de seguridad 
necesarios. Seque una bandeja de 
aluminio prepesada sin material para 
determinar el peso perdido. 
4. Después del secado remueva la bandeja 
desde el horno y permita el equilibrio con 
el ambiente por 5 minutos después del 
pesado con una precisión de 0.0001 g. 
Nota: El valor puede ser usado para 
normalizar el contenido de glucógeno en 
una base de peso seco celular. 
 
3. Lisis de células cianobacterianas. 
 
1. Transfiera 1 mL de cultivo o resuspensión 
celular (paso 1.1) a un tubo y centrifugue 
a 6000 x g a una temperatura de 4 °C por 
10 minutos. Descarte el sobrenadante. 
2. Resuspenda el precipitado en 1 mL de 50 
mM Tris-HCl a un pH de 8, centrifugue a 
6000 x g y a una temperatura de 4 °C por 
10 minutos. Descarte el sobrenadante y 
resuspenda el precipitado celular en 1 mL 
de buffer Tris-HCl. Repita el proceso. 
3. Profundamente, resuspenda el precipitado 
en 500 µL de buffer a 50 mM de Tris-HCl 
a un pH de 8. Nota: Resuspenda el 
precipitado para asegurar una lisis eficaz. 
Mantenga la resuspensión en hielo. 
4. Lise las células resuspendidas a 4 °C 
mediada por 30 ciclos de ultrasonicación, 
cada ciclo consistente por 30 segundos a 
una frecuencia de 20 kHz con la amplitud 
máxima, seguida por 90 segundos de 
descanso. 
Nota: Este método puede lisar 
eficientemente la Synechococcus sp. PCC 
7002. 
Alternativamente, transfiera la suspensión 
celular a un tubo con tapón de rosca y 
añada láminas óxido de zirconio. Coloque 
 
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el tubo en un homogeneizador de tejidos y 
lise las células a 4 °C configurado a 2 
ciclos, cada ciclo consiste en 5 minutos a 
una frecuencia sincronizada de 5. 
5. Centrifugue el tubo que contiene la lisis 
por 10 minutos a 6000 x g a una 
temperatura de 4 °C. Nota: El 
centrifugado debe consistirse 
principalmente de restos celulares de gran 
tamaño. Si hay un número significante de 
células sin romper, repita el proceso 3.4. 
Mantenga el sobrenadante en hielo. 
6. Determine la concentración de proteína 
usando un kit de ensayo comercial de 
proteína BCA. Nota: El valor puede ser 
usado para normalizar el contenido de 
glucógeno en una base de proteína. 
 
4. Precipitación de glucógeno. 
 
1. Remueva clorofila a de la lisis celular 
mezclando 900 µL de 96 % (v/v) etanol y 
100 µL del sobrenadante partiendo del 
paso 3.5 en un tubo con tapón de rosca de 
1.5mL. Después de tapar el tubo, caliente 
el tubo a 90 °C por 10 minutos usando una 
plancha de calentamiento regular. 
2. Incube el tubo en hielo por 30 minutos. 
3. Centrifugue el tubo a 20000 x g a una 
temperatura de 4 °C por 30 minutos y 
cuidadosamente remueva el sobrenadante, 
el precipitado contiene el glucógeno. 
Seque el centrifugado en presencia de luz 
en aire para eliminar el exceso de etanol. 
Nota: El secado excesivo del precipitado 
debe ser evitado, de otra forma, sería 
complicado la disolución en el paso 5.1. 
4. Opcional: Mida la absorbancia del 
sobrenadante obtenido en el paso 4.3 a 
664 nm para determinar la clorofila a 
contenida. Use un coeficiente de 
absorción de 84.6 L/g/cm. Nota: El valor 
puede ser usado para normalizar el 
contenido de glucógeno. 
 
5. Hidrólisis enzimática y determinación 
enzimática. 
 
1. Solubilice el precipitado obtenido en el 
paso 4.3 en 100 µL de buffer 50 mM de 
acetato de sodio a un pH de 5, y agregue 
50 µL de 8 U/mL de amiloglucosidasa y 
50 µL de 2 U/mL de alfa-amilasa. Mezcle 
estos materiales en un vórtex. Nota: 
Mezclar por pipeteo no es recomendable 
debido a que el glucógeno precipitado es 
viscoso. 
2. Incube la mezcla a 60 °C en una plancha 
de calentamiento por 2 horas para facilitar 
la digestión del glucógeno en las 
moléculas de glucosa. 
3. Centrifugue la muestra a 10000 x g por 5 
minutos y transfiera el sobrenadante a un 
tubo nuevo de 1.5 mL. 
 
6. Determinación del contenido total de glucosa 
usando reactivo GOD-POD. 
 
1. Mida la concentración de glucosa en el 
sobrenadante obtenido en el paso 5.3 
usando el reactivo GOD-POD. Transfiera 
100 µL del sobrenadante resultante del 
paso 5.3 a un compartimiento de una placa 
de 96 pozos. Como un control negativo, 
use 100 µL de buffer acetato de sodio a 50 
mM a pH 5. Para generar una curva de 
calibración, también mida las soluciones 
estándar de glucosa. 
2. Agregue 150 µL de reactivo GOD-POD a 
cada muestra y mezcle rápidamente por 
pipeteo. 
3. Incube la placa estáticamente a 25 °C por 
30 minutos. Tome el valor de absorbancia 
a 510 nm usando un lector de placa. 
4. Calcule la concentración de glucosa 
usando una curva de calibración obtenida 
de los patrones de glucosa. Nota: La 
concentración de glucógeno en el lisado 
celular es expresado como la 
concentración de glucosa 
5. (µg/mL). 
 
3. Resultados y discusión 
 
Siguiendo el protocolo descrito anteriormente, se llevó 
a cabo el análisis del contenido de glucógeno a una 
OD730 nm, el contenido relacionado con la proteína 
contenida y el glucógeno relativo a la clorofila a. No 
se realizó la medición del peso seco de la célula, esto 
debido al poco material disponible. Pero, gracias a 
estudios previos similares, se estima que el contenido 
de proteína en cianobacterias cultivadas es el 50% del 
peso seco de la célula y el contenido de glucógeno es 
el 12%. 
 
Se observó una correlación lineal existente en la 
 
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medición de los límites de detección del ensayo GOD-
POD, entre la concentración de glucosa (entre 10 y 100 
µg/mL) y la absorbancia a 510 nm, dando valores 
correspondientes de absorbancia de 0.08 y 0.7; 
infiriendo que probablemente el límite mínimo 
corresponda al límite de detección del instrumento y 
teniendo en cuenta que al superar el rango de 
concentración mencionado, ocurre una formación de 
precipitado de color verdoso lo cual obstaculiza una 
óptima lectura de absorbancia. En la obtención de 
glucógeno reproducible contenido se debe tener en 
cuenta el valor de OD730nm de la resuspensión celular 
antes de llevar a cabo la lisis celular, ya que, en valores 
muy altos, daban señales muy variables por su cercanía 
al límite mínimo de detección y en valores muy altos 
no era adecuado puesto que no se completaba la lisis 
celular requiriendo procesos adicionales. 
 
En la Figura 1 se exhiben los resultados 
representativos del contenido de glucógeno medido en 
Synechocystis sp. PCC 6803, en una cepa tipo salvaje 
y en dos cepas mutantes (ΔpmgA y ΔpmgR1), 
normalizando el contenido de glucógeno por el 
contenido total de proteínas. Observando que las 
células mutantes poseen aproximadamente el doble del 
contenido de glucógeno que se presenta en la cepa de 
tipo salvaje. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1. El contenido de glucógeno medido en 
diferentes cepas de Synechocystis sp. PCC 6803. 
WT corresponde al contenido de glucógeno en el tipo 
salvaje, ΔpmgA y ΔpmgR1 al contenido en las cepas 
mutantes. 
 
 
Posteriormente, se llevó a cabo otro estudio bacteriano 
en donde se analizó el contenido de glucógeno en 
cepas de Synechococcus sp. PCC 7002 las cuales se 
caracterizan por su diseño específico para producir 
manitol. Este análisis se realizó mediante medición de 
contenido de glucógeno y manitol en las cepas; Glg+, 
contiene los genes glgA1 y glgA2 de tipo salvaje que 
tienen la capacidad de codificar sintasas funcionales de 
glucógeno; y Glg-, la cual no posee copias funcionales 
de estos genes. Lo anterior ocasiona que los 
carbohidratos sintetizados por la fotosíntesis en la cepa 
mutante que no está capacitada para sintetizar 
glucógeno sean redirigidos a manitol, evidenciándose 
en la Figura 2, en donde comparando los resultados 
dados por cada cepa se observa que Glg- carece de una 
cantidad detectable de glucógeno, mientras que la 
cantidad de manitol producida duplicó a la detectada 
en la cepa Glg+. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2. Producción de glucógeno y manitol en 
diferentes cepas de Synechococcus sp. PCC7002 
manipuladas genéticamente. Glg+, que sintetiza 
glucógeno y manitol, y Glg-, la cual sintetiza 
únicamente manitol. 
 
 
Para que el procedimiento llevado a cabo sea óptimo y 
eficiente, es de suma importancia la correcta 
aplicación del protocolo descrito en puntos críticos 
como la precipitación y resuspensión de glucógeno. El 
glucógeno producto en la centrifugación que se da 
después de la precipitación con etanol puede formar un 
sedimento translúcido que puede adherirse a los tubos 
de microcentrífuga, lo cual dificulta la labor de 
eliminar el sobrenadante, esto se debe realizar con 
mucha precaución para no llegar a eliminar al 
sedimento. Este sedimento se caracteriza por ser 
pegajoso y poco soluble, el no realizar una 
solubilización completa del glucógeno conllevará a 
una digestión enzimática ineficiente, lo cual no 
permitirá realizar replicas técnicas, ya que habrá una 
gran variación entre un resultado y el otro. Una 
solución viable a este problema sería la aplicación de 
ultrasonido antes de llevar a cabo la solubilización por 
agitación, descrita en el protocolo. 
 
Es importante resaltar que el contenido total de 
biomasa del material seco se encuentra entre un rango 
de 40-50% y es posible obtener una referencia 
alternativa, si se tiene conocimiento del contenido de 
 
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proteína total, no obstante, esto depende de las 
condiciones previamente aplicadas al tratamiento. Por 
otro lado, se determina que el conocimiento del 
contenido de la clorofila a es de suma importancia, ya 
que con este se puede intuir la cantidad de células 
presentes en la muestra. Sin embargo, se debe tener en 
cuenta que la cantidad de clorofila a varía por célula, 
especialmente en respuesta a las concentraciones 
cambiantes de nutrientes y a las intensidades de luz 
absorbidas, esto se calcula por medio de la conocida 
Ley de Beer-Lambert. 
 
Esta técnica se caracteriza por ser altamente selectiva 
y porque sus métodos son relativamente simples de 
ejecutar, lo que la hace sobresalir positivamente al 
compararla con técnicas similares. La técnica detecta 
glucosa en glucógeno, y gracias a su selectividad, 
discrimina variantes de glucosa en celulosa u otras 
fuentes, dado esto por la no hidrolización dela α-
amilasa y la α-amiloglucosidasa de los enlaces 
glucosilo ligados a los enlaces β presentes en las 
fuentes. En estudios anteriores se demostró que la 
hidrólisis enzimática del glucógeno solo es realizada 
por la α-amiloglucosidasa, al igual, se demostró que si 
esta es de acción endo y se le incluye posteriormente 
α-amilasa de acción exo, se puede garantizar que la 
hidrólisis del glucógeno será altamente eficiente, 
haciendo a este proceso aplicable en procesos tales 
como los tratamientos de la biomasa vegetal en donde 
si se combinan ambas enzimas, se pueden hidrolizar 
almidones sin llegar a afectar a otros polisacáridos que 
pueden contener glucosa o celulosa en su estructura. 
 
4. Conclusiones 
 
Se demostraron las diferencias significativas que se 
presentan en el análisis del contenido y procesamiento 
de glucógeno en dos diferentes especies de 
cianobacterias en elementos reguladores y genes 
biosintéticos. No obstante, se concluye que una gran 
limitante de la técnica aplicada es su bajo rendimiento, 
ya que las muestras deben ser procesadas por separado, 
lo que puede llevar a que el glucógeno precipite, 
siendo esto un gran impedimento para la optimización 
del análisis. 
 
5. Bibliografía 
 
1. De Porcellinis, A., Frigaard, N.U., Sakuragi, Y. 
Determination of the Glycogen Content in 
Cyanobacteria. J. Vis. Exp. (125), e56068, 
doi:10.3791/56068 (2017).