Resumen parcial 2 Biotecnología UTN-FRM

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Contenido
U8: Bioenergética	1
U10: Esterilización	8
U11: Cinética del crecimiento microbiano	15
U12: Intercambio y transferencia de gases	35
U13: Biorreactor	43
U14: Proceso de fermentación	46
U8: Bioenergética
Para vivir y crecer, las células vivas dependen del consumo de alimento, el cual les sirve como fuente de elementos biológicamente esenciales (C, N, S, P, etc.) y como fuente de la cual pueden extraer energía útil. 
El proceso químico a través del cual obtienen energía es el metabolismo. La energía química liberada en las reacciones del catabolismo, es acumulada por las células al formar ATP y; al degradarlo, emplean esta energía para llevar a cabo las reacciones de biosíntesis del anabolismo y de otros procesos o mecanismos celulares que la requieran (movimiento mecánico, bioluminiscencia, electricidad, etc.).
Según la fuente de la que extraigan energía, se clasifican distintos grupos tróficos:
1. Fototrofía: luz solar. Comprende los organismos con clorofila:
a. Fotolitotrofos: organismos capaces de vivir en medios puramente minerales (vegetales y algunas bacterias).
b. Fotoorganotrofos: exigen la presencia de algunos compuestos orgánicos (algunas bacterias).
2. Quimiotrofía: química. 
a. Quimiolitotrofos: utilizan sustancias minerales como substratos energéticos (bacterias autotróficas).
b. Quimioorganotrofos: utilizan compuestos orgánicos como substratos energéticos (organismos heterótrofos: hongos, levaduras, animales y gran parte de las bacterias). 
3. Paratrofía: la energía es suministrada por otro organismo (virus y parásitos como los piojos, garrapatas, etc.).
Sin embargo, cualquiera sea la fuente, los procesos productores de energía son reacciones de oxidación. Hay de 3 tipos:
a) Simple pérdida de electrones
Ejemplo: 
b) Pérdida de protones y electrones: reacciones catalizadas por las deshidrogenasas.
Ejemplo:
c) Ganancia de oxígeno: reacciones catalizadas por las oxidasas.
· Oxígeno proveniente del agua
· Oxígeno proveniente del oxígeno molecular
Las oxigenaciones son procesos exergónicos en las cuales:
Además, toda oxidación exige que los electrones que provienen del substrato energéticos sean aceptados por otra sustancia. Par (donor – aceptor) de electrones. 
· Aerobiosis y anaerobiosis
Según sus relaciones con el oxígeno y de acuerdo al tipo de oxidación, los organismos se dividen en:
a. Aerobios estrictos: viven en presencia de oxígeno libre
b. Anaerobios estrictos: viven en ausencia de oxígeno
c. Anaerobios facultativos: viven tanto en aerobiosis como en anaerobiosis
Diferencias entre aerobiosis y anaerobiosis
Lo que distingue los modos de vida aerobio y anaerobio es la naturaleza final del aceptor de hidrógeno. 
a. En aerobiosis (respiración): los electrones provenientes de las deshidrogenaciones son transportados por las enzimas respiratorias al oxígeno atmosférico que se reduce a .
b. En anaerobiosis (fermentación): el aceptor final de electrones es otra sustancia, generalmente un compuesto intermedio del metabolismo.
· Variación de energía libre y reacciones químicas en los organismos vivientes
El cambio de G, a P y T ctes, nos permite predecir la factibilidad de una reacción y representa, además, la máxima cantidad de energía química potencialmente disponible para realizar un trabajo útil. 
· Reacción endergónica: reacción consumidora de energía, con valor positivo de , termodinámicamente desfavorables.
· Reacción exergónica: reacción liberadora de energía, con valor negativo de , termodinámicamente posibles.
· Reacción en equilibrio: 
El valor del cambio de G, a T y P constantes, para la siguiente reacción:
Está dado por: 
Siendo
· cambio de G en cualquier punto de la transformación
· cambio de G estándar. Es función de la P y la T y está determinada para condiciones arbitrarias que supondremos que corresponde a solutos disueltos a 1M. En el equilibrio,
Para que una reacción endergónica ocurra debe estar acoplada a una reacción exergónica, esto es lo que se conoce como acoplamiento de energía. Para que esto suceda, es necesario que exista un compuesto intermediario común a ambas reacciones. 
En la célula viva, la energía necesaria para la ocurrencia de las reacciones endergónicas procede de las biomoléculas de alta energía que la liberan por hidrólisis. Estos compuestos de potencial energético elevado se caracterizan por poseer ligaduras ricas en energía. 
Los compuestos con ligaduras ricas en energía constituyen la “reserva de energía” de los seres vivos. Los más comunes son los derivados del ácido fosfórico y entre ellos el más importante es el ATP; pero también hay otros que, en vez de contener Ac fosfórico, contienen azufre (acetil – CoA).
El ATP es un compuesto intermediario en el acoplamiento de reacciones muy importante. Prácticamente puede ser formado por todas las reacciones exergónicas y utilizado por todas las endergónicas. Dando como resultado un ciclo de formación y escisión del ATP. 
 
· Distintas fotosíntesis
Fijarse que sólo cambian los extremos:
· Quimiotrofía comparación esquemática de algunos quimiolitotrofos
· Carga de energía
La célula viva es capaz de regular sus procesos químicos en respuesta a los cambios intracelulares en las concentraciones de ATP, ADP y AMP. A esa regulación se le dio el nombre de control de la carga de energía.
· Valor máximo: 1, cuando [ADP] y [AMP] son iguales a cero. En esta condición la célula estaría saturada de energía. 
· Valor mínimo: 0, cuando [ADP] y [ATP] son iguales a cero. En esta condición la célula moriría por falta de energía.
En las células vivas estos dos estados se evitan regulando el metabolismo. El valor de carga debe variar entre 0.8 y 0.9, cuando disminuye se activa la producción de ATP y lo inverso cuando aumenta. 
U10: Esterilización
Definición:
· Profe: operación unitaria que destruye a los MO presentes en filtros, reactores, alimentos, ambientes, etc.
· Apunte: “el proceso validado por medio del cual se obtiene un producto libre de microorganismos viables. El proceso de esterilización debe ser diseñado, validado y llevado a cabo de modo de asegurar que es capaz de eliminar la carga microbiana del producto”.
Sin embargo, no puede asegurarse la esterilidad absoluta, por lo que se busca garantizar valores de contaminación compatibles con los procesos de fermentación que deben llevarse a cabo. Debido a esto se dividen en dos grupos:
· Grupo 1: procesos en los que los MO empleados crecen y efectúan los cambios deseados en medios a veces muy ácidos y crecen rápidamente en condiciones tales que no permiten la implantación de MO extraños. Crean condiciones que no se las banca nadie. 
· Grupo 2: utilizan MO o células que exigen medios muy complejos y a veces aireación intensa y que crecen lentamente y efectúan transformaciones requeridas a pHs cercanos a la neutralidad. Pueden ser fácilmente invadidos por las condiciones de operación tan óptimas, por lo tanto, son más difíciles y caros.
· Sensibilidad de los MO a T cte (función del tiempo)
La velocidad de destrucción de los MO en un proceso de esterilización es directamente proporcional al número de gérmenes presentes al tiempo t, por lo que responde una cinética de primer orden. 
· N: número de MO vivos en el instante t
· k: velocidad específica de destrucción térmica, es función del pH, T, composición del medio y la cepa bacteriana. 
Integrando se llega a:
Siendo No el número inicial de MO para un tiempo inicial to, si to=0:
t es el tiempo que debe mantenerse a T cte para que la población de MO inicial No se reduzca a N gérmenes. 
Si se reducen en un 90%: , por lo tanto:
Si lo expresamos en In y despejamos N, obtenemos:
Graficando se obtiene la curva de destrucción térmica de los MO en función del t y a la temperatura T. Es una función exponencial que se vuelve asintótica en el eje de abscisas, indicando la imposibilidad de llegar a N=0. 
 Otra gráfica útil es la de log N/No vs t, que se conoce como curva de supervivencia:
· Es una recta donde se puede visualizar D. 
· Se grafica en función dealgún organismo indicador (MO termófilo) para asegurarse que no se encuentra presente el Clostridium botulinum. 
Utilizando como temperatura de referencia 250ºF o 121ºC, se han determinado k y D para varias cepas bacterianas esporulantes cuyas esporas son termorresistentes.
*El segundo es un MO indicador, no tiene ningún efecto, pero para asegurarnos de que no esté el clostridium botulinum eliminamos este.
· Sensibilidad de los MO en función de la T
La experiencia demuestra que la disminución del tiempo de reducción decimal D es directamente proporcional a la temperatura.
Integrando:
Si D se reduce en un 90%:
Siendo Z el aumento de temperatura que permite reducir el tiempo de reducción decimal D a 1/10 de su valor. 
Si graficamos D vs T obtenemos la curva de reducción térmica, cuya pendiente es 1/Z.
· Valor de esterilización práctica
Valor, en porcentaje, que se fija según lo que se considere aceptable en esterilización, es decir, la tasa mínima de contaminación residual deseada. Por ejemplo, fijar que sólo 1 de cada 1000 fermentadores o latas de conserva estén contaminados (esterilización del 99.9%).
· Tratamiento térmico de destrucción de MO
Las gráficas experimentales de los tratamientos térmicos se conocen como curvas de destrucción térmica o curvas TDT, y son líneas rectas. 
Un tratamiento térmico se define por dos valores:
1. Duración F en minutos necesaria para obtener a 121ºC el valor de esterilización práctica, es decir, la relación No/N que se haya fijado. F se llama valor esterilizante. 
2. Número Z de grados que debe elevarse la T para reducir en un 90% el tiempo de esterilización 
Conocido el t de esterilización correspondiente a la temperatura T, se puede calcular el valor de esterilización F a 121ºC. 
Interpretación:
Empleo en la práctica:
En el tratamiento térmico de un medio de cultivo o de un alimento hay que tener en cuenta que hay componentes (vitaminas, aminoácidos, etc.) o propiedades (color, transparencia, consistencia, características organolépticas, etc.) que no pueden destruirse. Por lo que se hace un estudio experimental de la destrucción del componente o propiedad que debe mantenerse inalterable (o conservarse en un porcentaje dado) y se superpone esta recta TDT con la de destrucción térmica de las esporas termorresistentes de una bacteria tipo, como por ejemplo las esporas de Bacillus thermoacidurans (todas las bacterias que llamamos “tipo” en este caso tienen esporas más resistentes que las del Clostridium botulinum).
La región denominada Baremos de Esterilización permite realizar la esterilización cumpliendo los objetivos del tratamiento: destrucción de esporas y mantenimiento de propiedades y/o componentes. 
· Factores que influyen en la esterilización
a. Resistencia específica de los MO al calor y estado de los mismos
b. Composición del medio: la variable más importante es el pH. El Clostridium botulinum presenta una resistencia nula a pH inferiores a 4.5. 
¿Por qué es tan importante el pH? Recordemos la gráfica de cómo afecta el pH a las enzimas, los MO necesitan sus enzimas para desarrollarse. 
Según el pH los alimentos se clasifican en 3 grupos:
· Alimentos muy ácidos: basta con un calentamiento a 85ºC
· Alimentos poco ácidos: los tratamientos deben asegurar un gran margen de seguridad frente al Clostridium botulinum. 
· Alimentos ácidos: debe asegurarse que el pH no resulte modificado por el calentamiento, por tratamientos previos o por modificaciones naturales de los productos a conservar. 
· Influencia de la T
La velocidad k específica de destrucción térmica de MO está relacionada con la T por la ecuación de Arrhenius:
Recordando que a T cte: , si los tratamientos son equivalentes N0/N es una constante.
Conocido el Baremo t1, T1 y la energía de activación, se puede calcular el t2, T2.
Ejemplo de aplicación: el autoclave trabaja a 121ºC, pero es para producciones chicas, por lo que tenemos que calcular t y T para un baño maría (producciones grandes). 
· Duración de un tratamiento de esterilización (fermentador)
El tiempo de esterilización es el tiempo en el que debe mantenerse al reactor a una temperatura dada para disminuir el número de MO, sin embargo, es necesario también tener en cuenta los tiempos de calentamiento y enfriamiento, donde ya algunos MO mueren. Esto nos ayuda a reducir el tiempo de esterilización y, por lo tanto, los gastos. 
Procedimiento:
a. Determinación del número de gérmenes con el empleo de una cámara de recuento
b. Trazado de las curvas de calentamiento y enfriamiento y empleo de la curva Ink vs 1/T
c. Construcción del cuadro de calentamiento
· Cuadro con: tiempo (min), T (K), 1/T y k
· Gráfica k vs t
· Cálculo de k medio de calentamiento
d. Construcción del cuadro de enfriamiento
· Same a lo de calentamiento
e. Cálculo del k medio global
f. Cálculo del número de gérmenes destruidos durante el calentamiento y el enfriamiento
g. Determinación del tiempo de esterilización
U11: Cinética del crecimiento microbiano
A las células microbianas “madre” se les dice “viable”, mientras que las “no viables” son las que son incapaces de reproducirse en el medio que se encuentran. Esto puede ocurrir por distintas razones:
a. La célula está muerta.
b. El MA no es propicio por falta de algún nutriente esencial, presencia de sustancias tóxicas.
c. El medio físico no es el adecuado por presencia o ausencia de oxígeno, o valores inapropiados de pH o temperatura. 
Los organismos unicelulares, a diferencia de organismos pluricelulares, presentan un alto grado de adaptabilidad para responder tanto a cambios físicos como químicos. 
El crecimiento de las poblaciones microbianas puede ser en sistema cerrado o abierto. 
· Medición del crecimiento microbiano
La población microbiana resultante puede seguirse o medirse de varias maneras:
· Concentración celular: número de células por unidad de volumen. Se emplea una cámara de recuento y un microscopio. 
· Densidad celular/Biomasa (X): masa celular o biomasa seca por unidad de volumen. Filtración a través de MF (membrana filtrante). 
· Recuento en caja de Petri: permite conocer si hay más de una especie presente en el medio de cultivo.
· Peso húmedo: se centrifuga un determinado volumen. Errores considerables. 
· Medida de la absorbancia
· Sólidos suspendidos volátiles: método para estimar la biomasa. 
Los sólidos suspendidos son los que quedan atrapados en los filtros, y son la suma de los SS Inorgánicos y los volátiles. Los inorgánicos se eliminan al someterlos a una T de 105ºC, mientras que los volátiles son los que se eliminan a una T de 450ºC. 
· Fases del crecimiento microbiano en medio no renovado o crecimiento discontinuo
Curva de crecimiento
Si se introduce un cierto número de microorganismos vivos en un volumen determinado de cierto medio de cultivo contenido en un sistema cerrado, su desarrollo o crecimiento puede ser dividido en cuatro fases características:
a. Fase de latencia: antes que comiencen las divisiones celulares, no aumenta el número de células.
b. Fase exponencial o de crecimiento logarítmico: las células se dividen a velocidad constante y la población aumenta a velocidad máxima duplicándose a intervalos regulares por lo que la concentración de sustrato disminuye en razón inversa mientras se pueden ir o no acumulando los productos finales del metabolismo.
c. Fase estacionaria: cesan las divisiones celulares, no hay crecimiento neto; se produce por agotamiento de un nutriente esencial, por formación de productos tóxicos o cambios físicos.
d. Fase de declinación o autolisis: la velocidad de muerte supera netamente al crecimiento, se produce la “autolisis” de las células.
· Fase de crecimiento exponencial
Es la fase más importante. Se define tiempo de generación como el tiempo transcurrido para que una célula se duplique. 
Siendo n el número de células, no el número de células inicial y z las generaciones. 
t es el tiempo transcurrido para obtener n células a partir de n0 y en z veces el tiempo medio θ de generación:
· Velocidad específica de crecimiento“k” en función de n (número de células)
La pendiente de la recta In n vs t es la velocidad específica de crecimiento. 
Si n=2no, calculamos el tiempo medio de generación ()
· Velocidad específica de crecimiento “” en función de X (densidad celular, g/l)
Velocidad específica de crecimiento de la biomasa.
La curva que se obtiene es igual, pero es la forma de medir es más práctica. 
 cuando el sistema se encuentra se encuentra en estado de equilibrio en un cultivo continuo donde los MO son de la misma talla. 
· Fase de latencia
Tiempo necesario para que los MO se adapten a las condiciones de crecimiento. Es el período en el que los microorganismos individuales están madurando y no tienen aún la posibilidad de dividirse. En este caso, el tiempo t en que la población microbiana pasa de n0 a n representa no sólo el tiempo donde hay división celular sino el tiempo de latencia λ.
La separación entre la fase de latencia y la fase exponencial, por convención, está dado por la intersección de las prolongaciones de ambas rectas.
Si se conoce el número de células n0 y n después de un tiempo t y el tiempo medio de generación θ, es posible saber si existe o no la fase de latencia pues puede escribirse:
· Fase estacionaria - Máximo crecimiento
El número máximo de MO obtenidos en un medio está determinado por varios factores:
a. Agotamiento de un elemento nutritivo esencial (se llama “substrato limitante (S)” a aquel cuyo agotamiento conduce a la detención del desarrollo);
b. Variación del pH a valores extremos;
c. Acumulación de productos de desechos del metabolismo los que pueden ser tóxicos para las células e impedir su crecimiento.
Si los factores b) y c) no son limitantes y si las concentraciones en elementos nutritivos esenciales están en exceso con relación a un nutriente dado, existe una relación lineal entre la máxima población alcanzada en la fase estacionaria (la máxima) y la concentración del nutriente considerado. Esto está representado en la figura que sigue, donde la linealidad termina cuando factores distintos a la concentración en el nutriente considerado limitan el crecimiento.
Se denomina organismo auxótrofo a aquel que necesita del medio de cultivo un compuesto intracelular que es incapaz de sintetizar (compuesto esencial).
· Diauxia
Consiste en curvas de crecimiento que presentan dos fases de crecimiento exponencial separadas por una fase de latencia. Esto tiene lugar cuando hay presentes dos sustratos diferentes que pueden ser utilizados, secuencialmente, como fuente de carbono. El metabolismo del organismo es selectivo para uno de los sustratos (se usa la fuente de carbono que permite un crecimiento más rápido) y cuando la agota, comienza a metabolizar el otro.
· Factores que afectan la velocidad de crecimiento
1. Concentración de substrato
Gráfica de la velocidad específica de crecimiento en función de la concentración inicial del sustrato limitante:
Se observa que a concentraciones muy bajas es directamente proporcional a S pero, a concentraciones mayores, los factores limitantes no influyen sobre la velocidad específica de crecimiento. El sólo depende de la actividad propia de los sistemas biosintéticos del MO. 
Ks es la concentración de sustrato limitante para la cual la velocidad específica de crecimiento es la mitad de la máxima posible. 
Se desarrolló, por analogía con la ecuación de Michaelis – Menten, la ecuación de Monod (ecuación hiperbólica):
Siendo:
· velocidad específica de crecimiento, [1/h]
· máxima
· concentración de substrato limitante
· concentración de substrato para que , constante de saturación. 
Ks expresa la afinidad de una enzima por su sustrato.
Modelo de Monod: supone que tanto la velocidad específica de crecimiento y la velocidad específica de consumo de substrato se realizan según mecanismos michaelianos.
R es el rendimiento másico (g biomasa/g substrato limitante).
Para determinar se aplica la linealización de Lineweaver-Burk:
· Limitación doble de substrato
Cuando hay dos substratos limitantes presentes en tan bajas concentraciones que la velocidad de crecimiento está limitada por ambos y que un aumento de concentración de cualquiera de ellos aumentará .
Esta ecuación puede expandirse a n substratos limitantes. 
· Inhibición por substrato
Por encima de determinados valores de S la velocidad de crecimiento comienza a declinar; este efecto se llama inhibición por substrato.
CHAT GPT: K_i es la constante de inhibición por sustrato, que representa la concentración de sustrato en la cual la velocidad de crecimiento se reduce a la mitad de su valor máximo.
ACA SIGUE, PERO NO ENTIENDO SI ES MÁS DE LO MISMO O QUE
Siendo I la concentración del inhibidor y ki una constante cuyo significado varía según la ecuación empleada. 
· Consumo de nutrientes y formación de producto
Para la biomasa:
Alfa es la velocidad específica de muerte.
Para el consumo de substrato:
a. Reactor alimentado por recargas
Siendo:
· Q: rapidez de alimentación de substrato (l/h)
· S, So: concentraciones de substrato (g/l)
· V: volumen del reactor (l)
· R(X/S)=-dX/dS: rendimiento en células del substrato (g células/g substrato)
· R(P/S)=-dπ/dS: rendimiento del substrato en producto (g producto/g substrato)
· Vp=1/X dπ/dt: velocidad específica de producción del producto (g producción/g biomasa.h)
· π: concentración de producto (g producto/l)
· m: consumo específico de substrato para el mantenimiento (gramos de substrato consumido/gramos de células por hora)
b. Cultivo cerrado o en medio no renovado
Solo se elimina el primer término del segundo miembro que es el que corresponde a la alimentación por recargas.
Recordando que Vs= -1/X dS/dt
Ecuación que relaciona la velocidad específica de consumo de substrato Vs, el crecimiento, el mantenimiento celular y la formación de producto. 
Para la formación de producto:
PIDE ESTOS GRÁFICOS?
La formación de productos puede estar o no relacionada directamente al crecimiento:
· Metabolitos primarios: se forman a partir de las vías catabólicas productoras de energía; están directamente relacionados al crecimiento celular (ejemplos: etanol por levaduras, ácido láctico por bacterias, vitaminas, aminoácidos, etc. y la misma biomasa). 
· Metabolitos secundarios: producción no ligada al crecimiento. Los metabolitos secundarios más famosos son los antibióticos. 
Respecto a los rendimientos, tanto en biomasa o en producto , se dedujo la ecuación de Prit:
Siendo:
· Rm: rendimiento medido (cantidad de biomasa o producto formados a partir de una cantidad de S en un t determinado)
· Rreal: rendimiento real
· m: consumo específico de substrato para el mantenimiento
2. Efecto de la temperatura
El crecimiento microbiano está afectado por la temperatura. El crecimiento, como función de la temperatura, permite clasificar a los microorganismos en tres categorías:
El aumento de la temperatura incrementa el valor de , sin embargo, a una determinada temperatura se produce la desnaturalización térmica de las proteínas, aumentando la rapidez de mortalidad y disminuyendo la de crecimiento. 
3. Efecto del pH
Los microorganismos tienden a crecer en intervalos limitados de pH y cambios en 1 o 1,5 unidades de pH producen a veces cambios irreversibles y letales sobre el metabolismo.
· Cultivo continuo de MO
En un sistema abierto el medio se va añadiendo continuamente al biorreactor y se va eliminando simultáneamente igual volumen de medio fermentado.
Algunas definiciones:
· Productividad (P): cantidad de biomasa producida por unidad de tiempo y de volumen del fermentador, (g/l.h).
· Tasa de dilución (D): cociente entre el caudal de medio fresco que entra al reactor y su volumen útil, (1/h).
· Tiempo de residencia hidráulico (: inversa de D
· Velocidad específica de síntesis del metabolito:
· Reactor continuo monocorriente en una etapa
a. Balance de volumen
b. Balance de biomasa
Ignoraremos la muerte celular. La cantidad total de biomasa en un instante t es XV.
· Si los MO no pueden compensar por su crecimientola dilución del cultivo por el medio nuevo. La población disminuye progresivamente hasta anularse. 
· Si la población permanece en equilibrio mientras D no supere el valor de .
El equivalente práctico de esta situación es el dispositivo Turbidostato. Un fermentador continuo trabajando como Turbidostato comanda, mediante dispositivos, el aporte de medio fresco para mantener la densidad óptica del cultivo en un valor prefijado. 
LA GRÁFICA VA?
· Si la población tiende a aumentar, disminuyendo S. cuando S es inferior a la que asegura la , disminuye y, en consecuencia, S aumenta; aumentando hasta que, en algún momento se llegue al equilibrio:
El sistema se autoestabiliza: si se produce una variación de D, automáticamente aumenta o desciende Un sistema continuo trabajando en estas condiciones se llama Quimiostato; los cuales consisten en una cámara de cultivo a V cte, con una bomba de Q regulable para el aporte de medio de cultivo fresco, dispositivos de inoculación, agitación y aireación.
i. Tasa de dilución crítica: valor de D para el cual S=So
ii. Concentración residual de substrato en el estado de equilibrio 
iii. Productividad óptima
 es siempre menor que 
Y el resto?
c. Balance de substrato
La cantidad total de substrato limitante en un instante t es SV.
d. Balance de producto
ESTA VA?
· Comparación continuo versus discontinuo 
a. Discontinuo
b. Continuo
Ganancia
Se puede observar que G>0, por lo que la productividad en continuo siempre es superior. 
· Sistema de dos etapas monocorriente
Razonamiento válido para 3 o más etapas: X y D van disminuyendo y se va produciendo el agotamiento de S.
Condiciones:
· Q es el mimo em ambos reactores
· Los volúmenes son diferentes
Balances:
a. Primera etapa 
· Balance de biomasa	
En el equilibrio 
· Balance de substrato
En el equilibrio 
b. Segunda etapa
· Balance de biomasa
En el equilibrio 
· Balance de substrato
En el equilibrio 
· Sistemas de dos etapas multicorriente
Si se añade medio fresco en cada reactor, la velocidad de crecimiento puede conseguirse que aumente de una etapa a otra. + medio fresco, + substrato. 
Condiciones
· 
· 
· 
La primera etapa se comporta como un reactor de una etapa en monocorriente:
Segunda etapa
· Balance de MO
· Balance del substrato limitante
En el equilibrio 
Se observa que, al ingresar medio fresco, aumenta la productividad del sistema.
· Determinación del número de etapas
A partir de datos experimentales de un cultivo discontinuo puede determinarse el número de etapas de un cultivo continuo. La única restricción es que todos los reactores deben tener el mismo volumen. 
Se grafica dX/dt:
· Cada línea de pendiente 𝜀 representa el balance de una etapa y su intersección con la curva un punto operativo. 
· Es factible determinar no sólo el número de etapas y la biomasa emergente de cada una de ellas sino, recordando que X = R. (ΔS), los valores de X permiten también estimar los S a la salida de cada etapa. 
· Sistema de una etapa con reciclo de biomasa
El reciclaje de células es un método de inoculación continua del quimiostato para estabilizar el sistema, minimizando las perturbaciones, permitiendo que el reactor opere a tasas de dilución mayores a μm y, obteniendo como resultado, un mayor consumo de substrato.
· γ= Relación de reciclaje.
· C = Factor de concentración de la biomasa.
Al reactor se le pone un sedimentador, de la base se toma parte de esos barros y se logra con este sistema reducir el volumen del sistema ¿ no será que aumenta la dilución?
LA GRAFICA VA?
· Balance de biomasa
En EE:
Como SIEMPRE
· Balance de substrato
En EE:
SIEMPRE X>R(So-S)
Como:
Siempre va a ser menor a 
Siempre mayor que 
ESTOS ULTIMOS DOS TAMBIEN?
U12: Intercambio y transferencia de gases
Un proceso microbiológico puede realizarse en reactores biológicos llamados fermentadores, de diseños diversos, aireados o no, agitados mecánicamente o no, y que permiten el crecimiento de cultivos sumergidos en el medio de cultivo. 
En el caso de las fermentaciones aerobia, la función de los dispositivos de aireación es suministrar el oxígeno necesario para el crecimiento microbiano. Mientras que la agitación asegura la uniformidad de la suspensión celular acelerando los intercambios entre los MO y el medio de cultivo y dividiendo las burbujas de aire para incrementar su superficie y tiempo de contacto.
En las fermentaciones anaerobias, el anhídrido carbónico liberado, a veces es suficiente para asegurar la agitación, sobre todo en fermentadores de gran volumen; en otras ocasiones debe mejorarse esta situación agitando mecánicamente o por medio de otros dispositivos para aumentar la velocidad de los intercambios entre los microorganismos y el medio de cultivo.
La fuente de oxígeno puesta a disposición de los microorganismos es el mismo aire insuflado a una presión ligeramente superior a la atmosférica; el nitrógeno y el oxígeno que no se han disuelto, contribuyen a remover el anhídrido carbónico formado disminuyendo su efecto inhibidor.
· Lagunas facultativas
La zona aeróbica tiene una profundidad de 40 cm aproximadamente, a mayores profundidades el oxígeno se difunde cada vez menos hasta llegar a una zona anaeróbica.
ESTE CUADRO VA?
· Solubilidad del oxígeno
La solubilidad del oxígeno en el agua pura es muy baja: a 37ºC es de 7 ppm; siendo aún menor en industrias bioquímicas debido a los compuestos disueltos. La solubilidad de oxígeno en el agua es inversamente proporcional a la temperatura y entre 5 y 30ºC puede calcularse como:
 Siendo Cs la concentración de saturación del oxígeno en agua pura a 1 atm de presión. Esta concentración solo es función de la presión parcial del oxígeno en fase gaseosa:
· Pg: presión parcial del gas en fase gaseosa
· Xg: fracción molar de equilibrio para el gas disuelto en la fase líquida.
· H: constante de Henry
· Corrección por sólidos disueltos
· Corrección por el efecto de la presión del lugar
Siendo:
· Cs la concentración de saturación del agua pura a la presión p (en mmHg)
· (Cs)760: concentración de saturación en agua pura a 1 atm
Para aguas residuales o medios de cultivo en fermentaciones industriales:
Solamente valida en la superficie del líquido.
· Concentración crítica de oxígeno 
Concentración de oxígeno por debajo de la cual los trastornos metabólicos pueden provocar la muerte de las células aerobias. Son función de la cepa microbiana y las características del medio de cultivo. 
A concentraciones mayores, la respiración y el crecimiento celular se producen a velocidades independientes de esa concentración.
· Demanda de oxígeno
Utilizamos la ecuación de Monod:
Siendo:
· Cl: concentración en mg/l de oxígeno
· Ko: constante de saturación
La C crítica es igual a Cl cuando es función lineal de Cl. 
Siendo:
· Qo2: velocidad específica de consumo de oxígeno, también se conoce como velocidad de respiración 
Siendo:
· Na: demanda de oxígeno, cantidad de oxígeno requerida por unidad de tiempo y volumen
· Yo2: rendimiento celular en oxígeno (g biomasa/g oxígeno)
· Transferencia de oxígeno
El recorrido del oxígeno contenido en una burbuja de aire hasta el sistema enzimático respiratorio de una célula contenida en el medio de cultivo se encuentra con ciertas resistencias:
· R1: resistencia de la película gaseosa en la capa laminar del interior de la burbuja
· R2: resistencia de la interfase aire – líquido 
· R3: resistencia interfase aire – líquido y medio de cultivo
· R4: resistencia del líquido
· R5: resistencia en la película líquida laminar en el exterior de la célula
· R6: resistencia interna de la célula
Siendo R3 el paso más lento o limitante.
Se cree que la transferencia de oxígeno sigue la teoría de la doble capa, la cual consiste en la existencia de dos capas en la interfase gas – líquido. La velocidad de transferencia por unidad de área interfacial “a” está dada por:
Siendo: 
· Kg: coeficiente de transferencia de oxígeno en la película gaseosa
· Kl: coeficiente de transferencia de oxígenoen la película líquida
· pg: presión parcial en la fase gaseosa
· pi: presión parcial en la interfase
· Ci: concentración en la interfase
· Cl: concentración en la fase líquida
Como Ci no se puede medir, se hace uso de la concentración de saturación:
· a: sumatoria del área superficial de todas las burbujas de aire presentes en el volumen del medio de cultivo
· : coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno (1/h). Es un parámetro de diseño, es decir, su valor es función del diseño del reactor (debe estar en las condiciones de referencia). 
Teniendo en cuenta el consumo de oxígeno de los MO:
Para el caso genérico:
· Medición de kLa
1. Método del sulfito
Procedimiento indirecto y fácil. Se basa en que una solución de sulfito de sodio se oxida rápidamente por el OD en presencia de catalizadores metálicos:
· Catalizador: cobalto como cloruro o sulfato.
· Restricción del método: solamente en agua.
· Función: medir la eficiencia del aireador
Procedimiento:
a. Se determina Cl
b. Se calcula la cantidad de Na2SO3 necesario para eliminar el OD del líquido y la de Co+2 como catalizador
c. Agregados Na2SO3 y Co+2, Cl se hace cero
d. En el régimen de aireación a estudiar comienza a airearse
e. Mediante un electrodo de OD o extrayendo muestras se determina Cl vs t
f. Como no hay MO
2. Método dinámico
· Se efectúa en condiciones reales del reactor: durante el crecimiento de un cultivo activo ya sea agua residual o un medio de cultivo complejo.
Consiste en, durante la fermentación, cortar el suministro de aire y registrar la disminución de OD. La pendiente de la recta obtenida es la demanda de oxígeno que nos permite calcular la velocidad de respiración. El flujo de aire se repone antes de que Cl alcance el valor de concentración crítica. 
· Conclusiones
El método del sulfito no requiere aparatos especiales y es fácil de realizar. Las desventajas son que no puede usarse caldo de cultivo ni células y que el método está basado en un modelo químico que no representa adecuadamente la realidad de una fermentación. El método se utiliza sobre todo para comparar equipos y para cuantificar el efecto de cambios en el diseño, más que para obtener valores absolutos de kLa.
El método de medición directa es el mejor, pero se debe disponer de un equipo analítico de alto costo.
Los métodos dinámicos están condicionados a las características de los electrodos de oxígeno, y sobre todo a la velocidad de reacción y respuesta a los cambios.
· Factores físicos que afectan a la transferencia de oxígeno
La viscosidad y la temperatura alteran el valor de kLa. 
· Temperaturas en K
· Aireación en condiciones reales y de referencia 
Los valores de referencia de un equipos e calcula a:
· T=20ºC
· P=760 mmHg
· OD=0 mg/l
· Cs=9.2 mg/l
Definimos CO como capacidad de oxigenación, igual a dCl/dt
Por lo tanto:
· Corrección por temperatura
Siendo 
· kLa aumenta con la T
Por lo tanto:
Alfa es función de:
· T líquido
· Naturaleza de los componentes disueltos
· Turbulencia
· Características del sistema de aireación
· Etc.
· Corrección por sólidos disueltos
· Corrección por presión
· Aireación superficial
· Aireadores por inyección de aire o burbujeo
Se define Cs,m como concentración de saturación de oxígeno en un punto de profundidad m en el tanque.
Siendo Pb la presión en kg/cm2 a la profundidad en la que se introduce el aire
· Aireadores 
Existen 3 categorías:
1. Unidades de difusión de aire
a. Difusor de burbuja fina
Las unidades de difusión de burbuja fina tales como soportes, placas o tubos porosos, se construyen de granos de SiO2 (sílice) u Al2O3 (óxido de aluminio) que se incluyen en una masa porosa con un soporte cerámico. 
Otros modelos (que se usan también para burbujas gruesas) consisten en tubos perforados recubiertos de Nylon, Dacron, Saran, etc. El aire comprimido pasa a través de la cubierta porosa. 
El diámetro de las burbujas es de 2 a 2,5 mm y el caudal de aire por unidad que se utiliza se encuentra entre 7 y 14 m3/h.unidad.
b. Difusor de burbuja grande
Estas unidades emplean grandes orificios o bien equipos de agitación hidráulica. También tubos con perforaciones grandes y recubiertos de Nylon, Dacron o Saram poroso.
Si bien tienen menor rendimiento que los de burbuja fina no requieren filtros de aire, exigen menos gastos de mantenimiento y menor potencia de compresión de aire.
El tamaño de las burbujas llega hasta 25 mm de diámetro y el caudal GS de inyección está entre 7 y 28 𝑚3ℎ 𝑥 𝑢𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑.
2. Unidades de aireación por turbinas
ESTE NO VA?
3. Equipos de aireación superficial
Las unidades de aireación superficial se basan únicamente en el arrastre del oxígeno del aire atmosférico. A diferencia de los aireadores de turbina o difusión, no hay un flujo de aire en estos sistemas.
Principio de funcionamiento de los aireadores superficiales: se succiona el líquido de la parte inferior de la unidad, siendo luego esparcido hacia arriba y el exterior por un rotor ubicado dentro de un cilindro vertical.
La transferencia de oxígeno en los aireadores de superficie se consigue por dos mecanismos:
· Por turbulencia: transferencia en la superficie turbulenta del líquido; 
· Por dispersión: transferencia en las gotas esparcidas por las palas del rotor. 
· Formación de burbujas
Los medios de cultivo pueden clasificarse en dos tipos generales:
· Tipo 1:en ellos las burbujas no presentan tendencia a aglutinarse (líquidos orgánicos o soluciones acuosas de compuestos hidrófilos).
· Tipo 2: los que favorecen la coalescencia, es decir, la tendencia a la reunión de las burbujas pequeñas en elementos voluminosos (soluciones acuosas que constituyen los medios de cultivo más usuales y los líquidos viscosos).
La velocidad terminal varía con el diámetro de las burbujas. Se puede constatar que, en los fermentadores de altura considerable, el diámetro de las burbujas aumenta a medida que disminuye la presión hidrostática y este fenómeno no hace más que aumentar su velocidad ascensorial.
En la práctica el diámetro se encuentra entre 1.5 y 10 mm y la rapidez terminal entre 20 y 30 cm/s.
· Dimensiones de las burbujas de aire 
U13: Biorreactor
· Tipos de reactores
A pesar de que el de turbina es el más usado, el fermentador LE FRANCOIS MARILLER puede suministrar más oxígeno con menos energía.
· Patrones de flujo y vórtices
· Configuración geométrica 
· Configuraciones de impulsores 
· Cambio de escala
Para realizar un cambio de escala se emplea la teoría de los principios de similitud para obtener una evaluación aproximada. Los parámetros empleados para la extrapolación son:
· kLa: permite caracterizar la interacción entre los MO y el diseño del reactor
· Potencia por unidad de volumen: vincula el reactor con su kLa
· Tiempo medio de mezclado: relaciona al reactor con las características del medio de fermentación
El parámetro kLa debe conservarse al hacer el cambio de escala. 
U14: Proceso de fermentación
La producción de metabolitos útiles comprende dos fases distintas:
· La fermentación: se lleva a cabo en fermentadores que deben ser versátiles.
· La recuperación de los metabolitos: es la extracción y purificación de los productos biológicos. Incluye operaciones como: destilación, secado, filtración, cromatografía, electroforesis, etc. 
· Distribución de gas 
Puede hacerse de 4 maneras:
· Por agitación
· Mediante bombas
· Por aire a presión
· Fase gaseosa continua
· Biorreactor con instalaciones para la aireación y para el proceso de control
· Tipos de sistemas aireadores y agitadores
· Funciones de la aireación 
a. Proporcionar oxígeno
b. Eliminar productos metabólicos volátiles e indeseables: para que no actúen como inhibidores
c. Produce un efecto secundario (o primario) de agitación
d. Aumenta la velocidad de transferencia de oxígeno
e. Aumenta la velocidad de transferencia de nutrientes
f. Impide la formación de agregados de células o medio de cultivo: para que no se junten, evitando así que mueran por falta de oxígeno
g. Aumenta la transferencia de productos metabólicos al medio
h. Aumentala eficiencia de transferencia de calor
La agitación mejora la aireación:
a. Dispensa el aire en burbujas pequeñas
b. Aumenta la edad de las burbujas en el reactor
c. Impide la coalescencia de las burbujas: sino cuando suben se juntan
d. Disminuye el espesor de la resistencia de la película de líquido en la interfase gas-líquido (R3)
· Esterilización del aire de fermentación
El único método práctico de esterilización es la filtración. Se emplean filtros de cartuchos de lana de vidrio, los cuales son de pequeño tamaño y se recambian y operan fácilmente. Construidos de ésteres de celulosa, polisulfona o nylon, la estructura membranosa les da características de filtros absolutos. Lamentablemente, no hay filtros absolutos para bacteriófagos. 
Los fermentadores pequeños están equipados con un compresor, un medidor de flujo y un filtro. El medidor se coloca en la zona no estéril para poder extraerlo sin contaminar el sistema y el filtro se encuentra por encima del nivel del líquido para evitar que el mismo ingrese en caso de interrumpirse la corriente de aire. 
· Esterilización de fermentadores 
La esterilización del medio de cultivo y el fermentador se puede hacer por separado o en conjunto. 
Otra práctica es esterilizar, por filtración, el componente glucídico del medio por separado para evitar la reacción de Maillard cuando el pH es bajo y alta la concentración de azúcares reductores.
Los productos son perjudiciales para la fermentación y la causa frecuente de obtener rendimientos reducidos. 
A. Esterilización conjunta
Una vez cargado el fermentador con el medio, se procede a calentar:
· Por inyección de vapor
· Haciendo pasar vapor por el serpentín o camisa
Cuando se alcanzan los 100ºC, se estrangula la válvula de escape de gases para que el aumento de P lleve a la T a 120/130ºC y se mantiene así durante un tiempo. 
B. Esterilización por separado
Ventajas:
· El fermentador vacío se esteriliza eficazmente con relativa rapidez
· Se reduce el tiempo durante el cual el fermentador es improductivo
Hay dos maneras:
a) Esterilizando el medio en un recipiente del mismo tamaño que el fermentador
Se calienta y enfría en un recipiente de esterilización y luego, una vez esterilizada la tubería, se transfiere al fermentador. Para esterilizar la tubería se purga el aire, el condensado y el vapor. 
b) Esterilización en continuo
El medio se prepara en forma no estéril. Una bomba (ubicada del lado no estéril) hace pasar el medio de cultivo preparado a través de un intercambiador de calor que posee una zona de calentamiento (esterilización) y otra de enfriamiento.
· Inoculación de fermentadores
El medio de cultivo se va aumentando de 10 en 10 hasta llegar al reactor para que la densidad celular sea mayor y así el reactor entre en régimen más rápido
· Equipos accesorios
a. Válvula de seguridad: disco de lámina metálica
b. Manómetros
c. Válvulas de control
d. Tuberías: se debe evitar la acumulación de materiales utilizando tuberías perfectamente alineadas y con una inclinación constante en una dirección.
e. Control de temperatura: termómetros de resistencia
f. Control de pH y OD: electrodos
g. Control de la espuma: para evitar la contaminación del medio de fermentación
h. Puntos de muestreo
Durante el proceso, se hace circular vapor con 1 y 3 abiertas y 2 cerrada. Para extraer la muestra, se pone al reactor bajo presión (o no, porque ya opera con presión de cabeza), se cierra 1, se abre 2, una vez que el medio se encuentre a temperatura normal se extrae en 3 la muestra, se cierra 2 e inmediatamente vuelve a abrirse 1 para limpiar y volver a esterilizar el tramo.