PRACTICA N 10 - BIOQUIMICA I

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PRACTICA Nº 10: EXTRACCIÓN DE ADN E IDENTIFICACIÓN DE SUS
COMPONENTES
RELACIÓN DE EXPERIMENTOS
1. Extracción y purificación del DNA de un tejido animal
2. Identificación de desoxirribosa: Reacción de Dishe
3. Desnaturalización del DNA: Efecto hipercrómico
INTRODUCCIÓN
Los ácidos nucleicos son polímeros lineales de una unidad repetitiva llamada nucleótido, el
cual está constituido por:
a. - Una pentosa : ribosa o desoxirribosa
b. - Una base nitrogenada : púrica o pirimidínica
c. - Ácido fosfórico (Ácido ortofosfórico)
La unión de las bases nitrogenadas con la pentosa constituye un nucleósido. Finalmente, la
unión éster de un nucleósido con ácido fosfórico se conoce como nucleótido.
El DNA es el responsable de la transmisión de los caracteres hereditarios. El DNA está
formado por dos cadenas polinucleotídicas, enrolladas en espiral a lo largo de un eje común.
Las dos cadenas de la doble hélice corren en direcciones opuestas. El esqueleto de azúcar
fosfato de cada una de las cadenas se encuentra hacia el exterior de la doble hélice y las bases
nitrogenadas están en el interior. Las dos cadenas están unidas por puentes de hidrógeno
establecidos entre las bases, se constituyen dos puentes de hidrógeno entre los pares A-T y
tres puentes de hidrógeno entre los pares G-C.
La adenina siempre se unirá a la timina y la guanina siempre se unirá con la citosina. Los
puentes de hidrógeno pueden romperse por el calor y por agentes químicos, obteniéndose un
DNA desnaturalizado.
El aislamiento y purificación del DNA se puede realizar aprovechando su propiedad de
absorber luz a la longitud de onda de 260 nm.
Objetivos
1. Obtención del DNA usando como fuente, timo de ternera
2. Identificación del componente desoxirribosa del DNA : Reacción de Dische
3. Desnaturalización del DNA: Observación del efecto hipercrómico
Procedimiento
1. Aislamiento del DNA
a) Homogenizar 2 g de timo de ternera en una licuadora en 25 ml de una solución
salina 0,15 M más EDTA 0,1M pH 8
b) Transferir el homogenizado anterior a una probeta de 100 ml y añadir 2 ml de
detergente aniónico ( Lauril Sulfato al 25%, mezclar )
c) Colocar en baño maría a 60 oC durante 10 min.
d) Añadir 6,3 ml de NaCl 5M; mezclar.
e) Añadir solución de cloroformo-alcohol isoamílico (24 :1 v/v) en un volumen
igual al obtenido en la etapa anterior ; aproximadamente 30 ml, agitar
vigorosamente
f) Centrifugar a 10 000 rpm. por 15 minutos.
g) Separar el sobrenadante con todo cuidado para evitar que el DNA se
desnaturalice y colocarlo en una probeta de 100 ml. Agregar dos volúmenes de
alcohol etílico al 95%. El alcohol debe añadirse lentamente, mientras que con
una varilla de vidrio se trata de enrollar el DNA.
h) Colocar la varilla de vidrio con el DNA enrollado en un tubo de prueba y
disolverlo en 20 ml de solución salina citrato (0,015 - 0,0015 M). Dejar en
reposo 30 min.
i) Añadir 2 ml de solución acetato de sodio 3 M a pH 7 la cual contiene 0,001 M
de EDTA.
j) Mezclar con una varilla de vidrio, añadiendo simultáneamente gota a gota 9,5
volúmenes de isopropanol para precipitar selectivamente al DNA. Seguir
mezclando con la varilla de vidrio tratando de enrollar el DNA.
k) Disolver el DNA obtenido en 20 ml. de solución salina citrato.
1. Identificación de Desoxirribosa : Reacción de Dische
Fundamento:
Desoxirribosa reacciona en presencia de ácido acético y sulfúrico con difenilamina
(DPA), dando como resultado un color azul.
Se ha conseguido mayor sensibilidad adicionando a la reacción ácido perclórico y
acetaldehído y dejando que desarrolle el color por 17 horas a 30 ºC. El color azul
producido por el ADN, sólo mide los azúcares enlazados a purinas, ya que el reactivo
DPA reacciona solamente con las moléculas de desoxirribosa unidas a purinas.
Según Stacey y col., se ha identificado al intermediario responsable del desarrollo del
color azul, el cual corresponde a un compuesto llamado: Hidroxi Levulínico aldehído.
En cambio, las desoxirribosas enlazadas a pirimidinas pueden ser detectadas por el
reactivo Carbazol. Pruebas con varios tejidos usando los reactivos DPA y Carbazol, han
mostrado que la cantidad de ADN es la misma, sin considerar cuál reacción se empleó
para la determinación. Esto indica por supuesto que el ADN de estos tejidos contienen
iguales proporciones de nucleótidos púricos y pirimidínicos, puesto que del apareamiento
de bases según Watson-Crick, se asume que la suma de A + G = T + C .
Procedimiento:
a) Tomar 2 tubos de prueba y marcarlos de la siguiente manera:
- X (Solución de DNA obtenido en la práctica) y C (Control)
b) En cada tubo medir lo siguiente:
C X
Solución de ADN obtenido ------- 2.0 ml.
Agua destilada 2.0 ml. -------
Reactivo difenilamina en
solución ácida
4.0 ml 4.0 ml.
c) Mezclar el contenido de cada tubo, colocarlos en baño hirviente durante 10 min.
d) Enfriar en baño de agua corriente por unos minutos. La presencia de desoxirribosa se
revela por la aparición de un color azul
1. Identificación de fosfato
Primero se procederá a hidrolizar el DNA con el objeto de liberar el fosfato, luego se
identificará éste mediante una reacción de coloración.
a) Tomar dos tubos de prueba y marcarlos de la manera siguiente:
- (solución de DNA obtenida en la práctica) C (control)
b) Luego medir lo siguiente:
X C
Solución de DNA obtenida en la práctica 0.5 ml -----
Solución salina citrato ----- 0.5 ml
Ácido perclórico 7.5 N 0.5 ml 0.5 ml
c) Colocar en cada tubo un embudo pequeño con una perla de vidrio. Luego
colocarlo en baño hirviente durante 30 minutos.
d) Enfriar y proceder a identificar el fosfato inorgánico de la siguiente manera:
C X
Contenido del tubo X después de la hidrólisis
ácida.
----- 0.5 ml.
Contenido del tubo C después de la hidrólisis
ácida.
0.5 ml. -----
Agua destilada 3.5 ml. 3.5 ml.
Molibdato de amonio al 2.5 % 0.5 ml. 0.5 ml.
Reactivo Reductor (ácido amino reductor
naftol sulfónico
0.5 ml. 0.5 ml.
e) Mezclar el contenido de cada tubo. Dejar en reposo durante 5 minutos.
Observar la presencia de fosfato inorgánico que se manifiesta por la aparición
de un color azul.
4. Desnaturalización del DNA: Efecto hipercrómico
Diversos agentes externos, como el calentamiento, la disminución de la constante dieléctrica
del medio, pH extremos menores de 4 y superiores de 11, reactivos como la urea y la
formamida pueden debilitar las fuerzas que unen las dos cadenas complementarias del ADN
y rompen los puentes de hidrógeno lo que origina que las dos cadenas se desenrollan y se
separen, proceso conocido como desnaturalización del DNA. En estas condiciones las bases
nitrogenadas quedan más expuestas que en su estado nativo y tienden a absorber mayor luz a
260nm, hecho que se conoce con el nombre de efecto hipercrómico. Cuando la temperatura
desnaturaliza el 50 % del ADN esta se le conoce como Tm o Temperatura de Fusión; esta es
mayor o menor según la proporción de pares de bases G, C o A,T respectivamente.
Procedimiento.
a) Medir en un tubo 5 ml de la solución del DNA obtenida en la práctica. Colocar el tubo
en baño hirviente durante 15 min., enfriar.
b) Medir la absorbancia de la muestra en el espectrofotómetro a 260 nm.
c) Si la solución del DNA es muy concentrada, diluir con solución salina citrato y
determinar nuevamente la absorbancia, hasta que ésta arroje una absorbancia entre 0.5
y 1.0 .
d) Medir la absorbancia a varias longitudes de onda entre 230 y 320 nm.
e) Hacer lo propio con la solución de DNA nativo obtenida en la práctica
f) Comparar la absorbancia obtenida, con ambas soluciones de DNA.
Expresión de Resultados.
Realizando los mismos pasos señalados anteriormente, en una práctica similar a la presente,
se obtuvieron los resultados que a continuación se muestran en el presente cuadro
Longitud de onda en
nm.
Absorbancia del ADN
Nativo
Absorbancia del ADN
desnaturalizado
320 0.005 0.020
310 0.019 0.026
300 0.025 0.038
290 0.062 0.125
280 0.135 0.335
270 0.205 0.520
260 0.283 0.650
250 0.2350.600
240 0.175 0.420
230 0.140 0.350
En el siguiente espacio coloque el gráfico obtenido con los resultados anteriores, colocando
en el eje de las ordenadas las ABSORBANCIAS y en el de abscisas las LONGITUDES DE
ONDA tanto para el DNA nativo como para el desnaturalizado en el mismo gráfico.
INTERROGANTES
1. ¿Qué otros tejidos podrían ser utilizados para aislar DNA en la presente
práctica?
Tenemos diversas alternativas en cuanto a tejidos de los cuales podemos extraer
DNA, como por ejemplo: tejido óseo, fluidos corporales, uñas, cabello, muestras de
saliva, dientes. Sin embargo, se presentan algunos inconvenientes al momento de
secuenciar el ADN, por lo que se recomienda usar tejidos cuyas células proliferen en
gran cantidad. Además, tenemos que considerar que sí o sí tiene que ser una célula
nucleada..
2. ¿Por qué razón se usan 6,3 ml de NaCl 5 M en una de las etapas de extracción
del DNA?
Se usó 6,3 ml de NaCl 5M puesto que, altas concentraciones de esta solución
previenen la contaminación de la muestra con polisacáridos que afectan la pureza del
ADN, pudiendo inhibir la actividad de algunas enzimas como polimerasas, ligasas y
endonucleasas de restricción. Esto se fundamenta en la separación de los polisacáridos
de los ácidos nucleicos, siendo su solubilidad diferencial en presencia de las altas
concentraciones de NaCl, por consiguiente los polisacáridos precipitaron bajo la
acción de fuerzas centrífugas.
3. Si luego de la extracción del DNA realizada en la práctica al leer la absorbancia
a 260 nm se obtiene una lectura de 1,25 D.O. y al calentarla durante un tiempo
considerable, en baño hirviente la lectura es de 1,26 D.O. ¿Qué explicación daría
Ud?
Se podría decir que la absorbancia del DNA conseguido primeramente es menor al
del DNA calentado, esto se debe a que como la gráfica del experimento indica, el
DNA desnaturalizado posee mayor absorbancia que el DNA nativo.
4. ¿Qué bases se encuentran comúnmente formando la molécula del DNA y RNA?
Las bases nitrogenadas fundamentales en estas estructuras son la timina, citosina ,
guanina y adenina; sin embargo, en la composición para el ARN se encuentra uracilo
en reemplazo de la timina.
5. ¿Qué bases no comunes se encuentran también en las moléculas de los ácidos
nucleicos y particularmente cuál?
En la molécula del DNA no se encuentra la base Uracilo por la mutación espontánea
que sufre la citosina, que elimina el grupo amino NH2 del nucleótido y la
incorporación errónea de Uracilo en vez de Timina durante la copia o reparación del
ADN.
El RNA no se encuentra en la Timina ya que posee una estructura química similar al
Uracilo, su diferencia es el grupo metilo que presenta la Timina.
6. ¿Qué importancia cree Ud. que tiene el hecho de que en el DNA las bases queden
en el interior de la doble hélice?
La importancia de las bases nitrogenadas quedan dentro de la hélice del DNA, radica
en que los enlaces puente de hidrógeno aparezcan y hagan de la hélice una más
resistente , ya que se guanina, citosina, etc, la cantidada de puentes de hidrógeno varía
entre estas.
7. ¿Qué tipos de RNA conoce Ud. y dónde se encuentran localizados en la célula?
- RNA mensajero: El ARNm es una versión del ARN del gen que sale del
núcleo celular y se mueve al citoplasma donde se fabrican las proteínas.
- RNA ribosomal: Se encuentra en el citoplasma asociado a proteínas
formando los ribosomas. Su función es acelerar la formación de enlaces
peptídicos.
- RNA de transferencia: Se encuentra disuelto en el citoplasma celular. Pueden
presentar nucleótidos poco usuales como ácido pseudouridílico, ácido
inosílico e incluso bases características del ADN como la timina.
8. ¿Cuáles son las funciones de los diferentes tipos de RNA?
- El ARN mensajero (ARNm) copia las instrucciones genéticas del ADN en el
núcleo, y lleva las instrucciones al citoplasma.
- El ARN ribosomal (ARNr) ayuda a formar ribosomas, el orgánulo donde se
arman las proteínas.
- El ARN de transferencia (ARNt) transporta los aminoácidos a los
ribosomas, donde se unen para formar proteínas.
9. ¿Cuál es el fundamento de la reacción del DISCHE?
El fundamento sería que la desoxirribosa reacciona en presencia de ácido acético y
sulfúrico con difenilamina (DPA), dando como resultado un color azul. Ya que el
ADN reacciona con ácido sulfúrico para producir aldehído hidroxi levulinico o
4-hidroxipentanal.
10. Indique las medidas que se han empleado para detener la actividad de la DNAsa
II
Como ya es bien conocido la DNAsa II es un grupo de enzimas en las cuales su
actividad enzimática radica en la hidrolización de DNA desnaturalizado y DNA
https://es.wikipedia.org/wiki/Citoplasma
https://es.wikipedia.org/wiki/Nucle%C3%B3tido
https://es.wikipedia.org/wiki/Timina
nativo, para detener la actividad de esta enzima fue necesario poner en incubación
nuestra muestra a una temperatura de alrededor de 65°C y por 15 minutos, para que
haci se detuviera la actividad de esta enzima.
Siguiendo las indicación es del video : https://www.youtube.com/watch?v=PN1UvhW6miw
https://www.youtube.com/watch?v=PN1UvhW6miw
REFERENCIAS
1. Foundation C. CK12-Foundation [Internet]. CK-12 Foundation. 2021 [citado el 19 de
junio de 2021]. Disponible en:
https://flexbooks.ck12.org/cbook/ck-12-conceptos-biologia/section/4.4/primary/lesson
/arn
2. Velasco, R. Marcadores moleculares y la extracción de ADN. Biotecnología en el
Sector Agropecuario y Agroindustria [Internet] 2005 [citado el 20 de junio de 2021];
3(1), 14–18. Disponible en: https://dialnet.unirioja.es/descarga/articulo/6117966.pdf
https://flexbooks.ck12.org/cbook/ck-12-conceptos-biologia/section/4.4/primary/lesson/arn
https://flexbooks.ck12.org/cbook/ck-12-conceptos-biologia/section/4.4/primary/lesson/arn
https://dialnet.unirioja.es/descarga/articulo/6117966.pdf