Unidad 2 Biot

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Biotecnología I
Unidad II 
Carrera: LICENCIATURA EN BIOTECNOLOGIA
Trayecto curricular: Ciclo de Formación Inicial
Período: 2º Cuatrimestre – 2018
Pequeñas moléculas de ARN no codificantes
Dogma central de la Biología Molecular
1984: En E. coli, pequeñas moléculas de RNA (100 nt aprox) se aparean con 
regiones complementarias en mRNAs, inhibiendo la traducción
Historia del descubrimiento del RNAi
-1993: En C. elegans, pequeños RNAs antisentido regulan la traducción 
durante el desarrollo (Ambros y Ruvkun)
-Década 90’: En plantas, se había visto que introducir un transgén podía, 
no sólo estimular la actividad del gen, sino también inhibir secuencias 
homólogas; y esto podía ser a nivel transcripcional (TGS) o 
postranscripcional (PTGS) (Napoli et al y van der Krol et al)
-1998: RNA interferente (RNAi) (Fire y Mello)
-Sólo dsRNA
-Especificidad de mRNA
-No aplica a promotores o intrones
-El target se degrada
-Unas pocas moléculas son 
suficientes
Historia del descubrimiento del RNAi
2006 Nobel Laureates Andrew 
Fire, Craig Mello
- 2000: Se descubre RISC en Drosophila (Hammond et al)
- 2000: El PTGS está mediado por siRNAs de 25 nt aprox (Parrish et al)
Historia del descubrimiento del RNAi
Funciones del RNAi:
-Defensa contra virus
-Silenciamiento de transposones
-Regulación de la expresión por miRNAs
-Mantiene la heterocromatina silenciando la expresión génica (TGS)
-Herramienta experimental para silenciar genes específicos
-Potencial uso en terapia génica
RNAs no codificantes
En el genoma humano, la gran mayoría (casi el 
98%) del ADN es de la variedad no codificante.
Valor evolutivo de los RNAs no codificantes
Taftet al, Bioessays, 2007
Clasificación RNA no codificantes
circRNA
(circular RNA)
RNA no codificantes
LncRNAs
• 200nt > lncRNA
• Pueden estar localizados dentro de fracciones nucleares o citosólicas, 
puede o no estar poliadenilados.
• Se puede transcribir como:
(1) sentido (2) antisentido (3) bidireccional (4) o (5) intergénico
lncRNAs no son ruido transcripcional!!!
Highly Specific Expression Mouse Brain 
Ponting, Cell, 2009 
Regulación de la expresión génica por lncRNAs
John R. Prensner Cancer Discovery 2011 
John R. Prensner Cancer Discovery 2011 
Mecanismos funcionales de los lncRNAs
Un modelo para la función de 
lncRNA los circuitos celulares. Los 
factores de transcripción 
específicos de células de madre 
embrionarias (Oct4, Sox2 y 
Nanog) se unen al promotor de 
lncRNA y conducen la 
transcripción. El lncRNA se une a 
proteínas reguladoras ubicuas, 
dando lugar a complejos de ARN-
proteína específicos del tipo 
celular. A través de diferentes 
combinaciones de interacciones 
de proteínas, el complejo lncRNA-
proteína da lugar a programas 
transcripcionales únicos. Un 
proceso similar puede funcionar 
en otros tipos de células con 
factores de transcripción 
específicos que regulan lncRNAs, 
que forman complejos de ARN-
proteína específicos del tipo 
celular 
lncRNAs actúan en el circuito que controla la pluripotencia y
diferenciación [Guttman et al. (2011) Nature 477, 295]
circRNA - Características
Características de los circRNAs:
- Construidos con bloques de ARN regulares
- No poliadenilados
- Menos abundantes que las transcripciones lineales (no siempre)
- Predominantemente citoplasmáticos
-Conservados
-Muy estables (~ 5 veces más estables que el ARNm)
-Funciones que promueven la circularización:
Intrones flanqueantes más largos que el promedio
Secuencias de intrones complementarios 
Exones más largos que el promedio
circRNA - Biogénesis
Mecanismo de producción Direct splicing:
Abundancia: 
- Miles de circRNAs ya reconocidos
- La mayoría de las backsplices están asociadas con circRNAs -
- Diferentes circRNAs en diferentes células
Aunque la mayoría de los circRNAs aún carecen de anotación funcional, 
Las observaciones recientes están comenzando a revelar que los 
circRNAs pueden jugar papeles potencialmente importantes en la 
regulación genética
circRNAs - FUNCIONES
Ejemplos:
1- circRNAs como el ciRS-7 (muy abundante) se expresa preferentemente en 
cerebros de humanos y ratones y actúa como esponja de miRNA.
2- Se mostró un conjunto de circRNAs que contienen intrones para regular la 
transcripción de la ARN polimerasa II (Pol II).
3- Cientos de circRNAs están regulados durante la transición epitelio-
mesénquima humano (EMT), lo que indica que ciertos circRNAs pueden 
afectar a los relacionados a funciones celular asociadas a la EMT.
4- Miles de circRNAs están sobre-expresados en el cerebro. Y muchos de ellos 
se regulan positivamente durante la neurogénesis.
microRNAs
Características de los microARNs
• Pequeños (19-22nt de long.) ARN doble cadena no 
codificantes.
• Reprimen la actividad de los ARNm complementarios.
• Regulan aprox. un 30% de los genes humanos
• 1 microARN = cientos de mARNs
“se puede cambiar un fenotipo mediante la modulación de un 
solo microARN” Thomas Wurdinger, HMS
• Han sido descriptos en invertebrados y vertebrados: C. 
elegans, hongos, plantas y mamíferos
• Muchos están conservados entre los vertebrados e 
invertebrados.
- Como regla general, la secuencia completa del microARN casi nunca es 
completamente complementaria a la secuencia objetivo.
Es muy común ver un bucle después de la semilla cuando se une.
Loop es a menudo una horquilla debido a la estabilidad.
- El sitio donde los miRNAs atacan a menudo está en el 3 'UTR de su objetivo.
Hairpin is more stable
than a simple bulge
Bucle
The MRE is known as the 
“miRNA recognition 
element.” This is simply 
the sequence in the target 
that an miRNA binds to
Nomenclatura y familia génica
Nomenclatura y familia génica
hsa-miR-210-3p
Sp Nombre 3´/5´
Nomenclatura y familia génica
miRNAs con la misma secuencia en los nucleótidos 2-8 pertenecen a 
la misma familia.
Los primeros miRNAs se nombraron según el fenotipo que generaban 
(let-7, lin-4, lys-6). Luego comenzaron a nombrarse con un número 
creciente, a medida que se fueron descubriendo .
miRNAs que difieren en unos pocos nucleótidos, pero mantienen la 
región semilla, se nombran con sufijos alfabéticos (miR-26a, miR-
26b).
miRNAs con idéntica secuencia, pero provenientes de diferentes loci se 
nombran con sufijos numéricos (miR-191-1, miR-191-2).
Cada uno de los dos miRNAs que provienen de un stem-loop se 
denomina 3’ o 5’ dependiendo de qué lado se encuentre en el precursor.
Citoplasma
Precursor miRNA
(pre-miR)
Drosha
Dgcr8
Primario miRNA
(pri-miR)
Dicer
RISC
RISC RISC
Núcleo
miARN
Degradación de ARNm Represión de la 
traducción de ARNm
miRNA guía
miRNA:miRNA*
duplex
Biogénesis de microRNAs
Biogénesis de microRNAs – Eventos nucleares
Ha et al, Nature Reviews in Molecular Cell Biology, 2014
Biogénesis de microRNAs – Eventos 
citoplasmáticos
Ha et al, Nature Reviews in Molecular Cell Biology, 2014
Ha et al, Nature Reviews in Molecular Cell Biology, 2014
Biogénesis de microRNAs no canónica
Ha et al, Nature Reviews in Molecular Cell Biology, 2014
Localización genómica
Zhao et al, Trends in Biochemical Sciences, 2007
Localización genómica
miRNA intrónico–expresión canónica
Kim et al, Nature Reviews in Molecular Cell Biology, 2009
Localización genómica
miRNA intrónico–expresión no canónica
Kim et al, Nature Reviews in Molecular Cell Biology, 2009
Biogénesis de microRNAs – Complejo efector RISC (AGO)
Reconocimiento del 
mRNA target
Biogénesis de microRNAs – Complejo efector RISC (AGO)
Familia de proteínas AGO:
AGO –ubicuas, asociadas a miRNAs o siRNAs
PIWI –específicas de línea germinal, asociadas a piRNAs
En Drosophila, la carga del miRNA dúplex en cada AGO es 
selectiva
En humanos, la carga del miRNA dúplex en cada AGO no tiene 
direccionamiento, y no se encontraron sets de miRNAs para cada 
una
En humanos, Dicer no parece ser importante para la carga en AGO
siRNA miRNA
Relevancia de los microRNAs para la Biología Humana
• Cáncer. Se ha encontradoque los miRNAs están regulados negativamente en varios tumores, y en algunos casos se ha
demostrado que la reintroducción de estos miRNAs afecta la viabilidad de las células cancerosas. El valor de los perfiles de
miARNs en el diagnóstico de tumores está bien establecido. Subrayando el importante papel que miRNAs juegan en oncología
es la formación de varias compañías nuevas que buscan expandir el desarrollo de terapias basadas en miRNAs.
• Enfermedades relacionadas con la edad. Se está acumulando evidencia de que muchas enfermedades relacionadas con la 
edad están asociadas con un control disminuido de la señalización celular que ocurre en la mitad de la vida. Se ha demostrado
que el control por miRNAs de sistemas tales como el ciclo celular, la reparación del ADN, las respuestas al estrés oxidativo y la 
apoptosis se expresan anormalmente en la mitad de la vida. Es muy probable que la investigación continuada revele 
asociaciones importantes con el proceso de envejecimiento y pueda conducir a terapias que puedan mejorar la calidad de vida.
• Enfermedad del corazón. Se eliminaron dos miRNAs específicos del corazón en modelos de ratón que dieron como resultado
un desarrollo anormal del corazón en una gran proporción de la descendencia. Si bien se esperaban estos efectos letales, otros
estudios muestran un papel más sutil para los miRNAs en el corazón. Cuando se eliminó miR-208, los ratones parecían
normales. Los defectos se revelaron solo cuando sus corazones estaban estresados. Estos resultados muestran que los estudios
exhaustivos de miARNs pueden ser valiosos en el diagnóstico de enfermedad cardíaca.
• Enfermedades Neurológicas. Numerosos informes han demostrado el papel de miRNAs en el desarrollo neuronal. La 
evidencia de un papel en la enfermedad de Parkinson proviene de estudios de modelos animales que muestran que la pérdida 
de miRNAs puede estar involucrada en el desarrollo y la progresión de la enfermedad. En experimentos de cultivo celular, la 
transferencia de pequeños fragmentos de ARN preserva parcialmente las células nerviosas deficientes en miRNAs. Si bien estos 
resultados y otros señalan un papel importante para los miRNAs en los trastornos neurodegenerativos, se necesita mucho más 
trabajo para delinear el papel exacto de los miRNAs en esta importante área.
• Trastornos de la función inmune. Recientes estudios de eliminación de miRNAs han revelado un papel central en la
regulación de la respuesta inmune. La eliminación de miRNA-155 disminuyó la diferenciación de las células T y B en los
centros germinales, y disminuyó en gran medida la producción de anticuerpos y citoquinas. Se encontraron dos estudios
adicionales que eliminan miRNA-181 y 223 para controlar la respuesta de células T y la producción de granulocitos,
respectivamente. A medida que se encuentran más funciones para los miRNAs en la respuesta inmune, la lista de trastornos de
la función inmune con un componente miRNAs también se expandirá.
microRNAs regulan el desarrollo de la corteza cerebral
Potenciales productos asociados con microRNAs en ensayos clínicos
MicroRNAs como herramientas en producción biofarmacéutica
Células CHO miRnoma Manipulación procesos celulares
Mejora en la eficiencia de producción de bioproductos farmacéuticos
Herramientas para trabajar con microRNAs
Detección/cuantificación de microRNAs
Purificación/control de calidad
Control calidad del RNA total con gel Poliacrilamida 15%
Trizol miRvana
tRNA--
5.8S rRNA
5S rRNA
Evaluar rutinariamente la calidad del ARN total con Bioanalyzer
(Agilent) o Experion (Bio-Rad) - RIN> 7 (puntaje de integridad del ARN)
Cuantificación por Northern blot
Ampliamente utilizado para visualizar microARNs específicos
Permite medir pre y pri-microARNs y estudiar variaciones en el 
procesamiento y en enfermedades
1.Fraccionamiento por electroforesis en gel de alto%
2.Transferencia a membrana
3. Fijar y probar con sonda específica del microARN
4. Visualización radioactiva/no radiactiva
Requiere mucho 
tiempo y gran 
cantidad de ARN
Cuantificación por Retrotranscripción-PCR en tiempo real
Estrategia de retrotranscripción con stem-loop primers específicos:
SYBR GREENSondas TaqMan
• Sensible y específico
• Cuantificación absoluta es posible
Estrategia de retrotranscripción con RT primers universales:
Extracción de microARNs y análisis del perfil de expresión por 
Secuenciación (High-throughput RNAseq) o MicroArrays
Detección de microARNs por hibridización in situ
Permite saber 'cuándo' y 'dónde' se expresa un microARN 
- Sondas largas para pri-microARNs 
- MicroARNs maduros - tamaño pequeño - sondas técnicamente 
desafiantes 
- Sondas basadas en LNA
• alta afinidad de unión por ARN cortos
• detección sensible y específica de microARNs
• sirven para una amplia gama de muestras
Exiqon
Yamashita JBC 2010 
Cómo descubrir la función de 
un microARN
Manipulación in vitro
• miméticos e inhibidores del microARN por transfección 
(antimiRs)
• 'absorbiendo' - vectores de esponja/señuelos que contienen 
muchos sitios de destino
Manipulación genética
• transgénesis in vivo o eliminación genética (CRISPR/Cas9)
Hace falta tener mucho cuidado en el caso de los miARNs
intrónicos y los policistrónicos
Inhibición terapéutica in vivo
Parámetros a definir antes de empezar:
Validación in vitro
Elección de la secuencia blanco
Elección del sistema de entrada en la célula: Transfección, 
Transducción, electroporación, etc.)
Elección de herramienta: siRNA sintéticos, plásmido expresando un 
shRNA inducible o no, vector víral.
Análisis del efecto: como? Cuando? 
Eficiencia y cinética de la inhibición
Uso in vivo
Técnica de administración
Biodistribución
Estabilidad
Nivel de extinción
Duración del efecto y necesidad de duración
Preguntas
Toxicidad, efectos off-target
Cantidad, frecuencia de inyección o tratamiento….
Sobreexpresión/inhibición de microRNAs
Validación in vitro: Transfección de los siRNA o plásmido expresando 
un shRNA
Técnica de Transfección
Cada célula tiene su requisito
Primera elección: CaPO4--
Productos para transfectar disponibles: liposomas, polímeros. 
Mirus: transitTKO
PolyfectAmine, PolyFect, OligoFect y RNAiMax(Invitrogen)
PEI y derivados (PolyPlus)
Hiperfect(Qiagen)
Electroporación
Medición de la eficiencia de Transfección
siRNA Fluorescentes
Quenching de la fluorescencia por algunos productos de transfección.
Microscopia confocal: discriminación de lo que entró realmente en la 
célula y no solo en la membrana
Co-Transfección de un vector de expresión para la luc, o GFP…..(1/10)
Validación in vitro: transfección
Para las células difíciles de transfectar
Efecto estable o por largo tiempo
Validación in vitro: transfección
Elección del “mejor” siRNA
Aclaración de la dosis eficaz necesaria… extinción parcial o casi-total
comúnmente 1-30 nM
Mas un siRNA será eficaz a una dosis baja:
menos off-target…..in vitro e in vivo.
Se puede utilizar los vectores expresando un shRNA por promotores de 
la ARN polimerasa de tipo III. 
Lentivirus expresando un shRNA
Validación in vitro: TRANSDUCCION
Elección el vector viral, depende del tipo de célula
Músculo, próstata: AAV
Las células madre hematopoyéticas: retrovirus MMLV, pseudotipado
VSVG VIH
Métodos de infección
Clásico con 1 o 2 rondas de infección
infección (spin)
Análisis de transducción
Marcador fluorescente interno (GFP dsRed)
Marcador de superficie (especialmente CDs)
Número de copias integradas
Validación indispensable in vitro =Caracterización del/os siRNA a 
utilizar in vivo
Dosis y nivel de silenciamiento
Cinética de la aparición del efecto
Duración del silenciamiento
Técnica de análisis del fenotipo, y eficiencia….
Interferencia de ARN in vivo: ejemplos de estrategias utilizadas
Uso de ARNip sintético
Efecto transitorio o inyecciones múltiples
Mismas limitaciones conocidas para otros Ácidos nucleicos
(antisentido ...), pero los siRNA son más estables
-Uso de vectores de expresión
Expresión transitoria o expresión permanente
Los mismosproblemas que la terapia génica
Transfección in vitro o transducción de células con siRNAs o 
vectores antes de la transferencia in vivo
- Transducción de cigoto en un estadio unicelular y antes del 
trasplante
In vivo -Los diferentes sistemas de administración en ratones
siRNA desnudo
1.Inyección intra-venosa
2.Co-inyección del siRNA con un plásmido que codifica la proteína diana.
3.Quimera con unión al Colesterol 
4.Inyección intra-espinal
5.Liposoma catiónico, polímero (Lipofectamine, PEI, TargeTron...)
6.Inyección ocular (subconjuntival)
7.Intraperitoneal
8.Inyección nasal en contra VSR e Influenza por ej.
9.La electroporación de embriones para la transferencia de siRNA.
10.La microinyección de células madre embrionarias con siRNA (EGFP).
11.Células de preimplantación, transfección mediante siRNA para la inhibición de un 
gen endógeno.
Vector Expresando un shRNA
1.Plásmido
mismas técnicas que los siRNA
2. Virus
Adenovirus por iny. en el cerebro o por vía intravenosa.
Los lentivirus: en casi todas las células, incluidas las células quiescentes.
Generación de animales transgénicos por transducción de Stemcells o cigotos.
Inyeccion IV
microARNs target prediction - Bioinformática
http://www.mirdb.org/
Le pedí que me prediga targets del microARN-210 en humano
http://www.targetscan.org/vert_72/
Análisis UTR in vitro – clonar 3'UTR del gen target en reportero
• sobreexpresar/inhibir microARN y mutar el sitio de destino en el 
tipo de celular de interés para evaluar si la regulación realmente 
ocurre
Transcriptoma /análisis proteómico
• la mayoría de los cambios en el nivel de proteína se deben a cambios 
en el nivel de ARNm
• análisis de ARNm/proteína siguiendo a la regulación del microARN
Ensayos bioquímicos
• ensayos de inmunoprecipitación de Argonauta para identificar los 
ARNm target de un microARN
• HITS-CLIP (secuenciación de alto rendimiento para la 
inmunoprecipitación luego de crosslinking)
Validación de las predicciones
CLIP (cross-linking immunoprecipitation) 
Objetivo:
Identificar y analizar microARNs involucrados en el proceso de 
diferenciación cardíaca de células madre embrionarias humanas
Aislar distintas 
poblaciones del proceso 
de diferenciación 
Indiferenciadas
Progenitor de 
mesodermo
Cardiomiocitos
Extracción de microARNs y análisis del perfil de expresión 
por Secuenciación (High-throughput RNAseq)
microARNs en la diferenciación
Screening de microARNs descriptos en la diferenciación en 
general y en diferenciación cardíaca en distintos sistemas
Cardíacos:
• miR-1
• miR-133 a/b
• miR-499 a/b
• miR-206
• miR-143
• miR-208
Indiferenciación:
• miR-302 a/b/c/d
Diferenciación:
• miR-145
• miR-296
Puesta a punto:
• Extracción con el kit miRvana y Trizol
• Estrategia de retrotranscripción con stem-loop primers específicos:
Control calidad del RNA total con gel 
Poliacrilamida 15%
Trizol miRvana
tRNA--
5.8S rRNA
5S rRNA
miR-302 miR-145 miR-296 miR-16
Chequeo de primers: Gel de agarosa 4% producto de la qRT-PCR. 
Control sin retrotranscripción
Secuenciación
Análisis de expresión durante la diferenciación cardíaca por qRT-PCR 
Población 
PROGENITOR DE MESODERMO (hEMP)
Protocolo diferenciación:
Cell Sorting
hEMP
Validación de marcadores por qRT-PCR
Análisis de miRNAs involucrados en la transición epitelio-
mesénquimal (EMT)
Screening de miRNAs descriptos en la EMT durante el desarrollo tumoral 
• miR-155
• miR-30
• miR-138
• miR-34
• miR-205
• miR-200a/b/c/d
• miR-125
Análisis del perfil de expresión de microARNs en d0 y d3.5 
(población del progenitor de mesodermo sorteada)
El miR-205 y la familia del miR-200 estarían siendo modulados en la transición 
epitelio-mesenquimal.
ZEB1
ZEB2
miR-205
miR-200
E-Cadherin
ZEB1
ZEB2
miR-205
miR-200
E-Cadherin
Vimentin
Pathway en el que están involucrados el miR-205 y la familia miR-200
Perfil de expresión de mRNA en d0 y d3.5
Puesta a punto mIR-205 mirna mimic e inhibitor (Life Technologies)
Células H9 indiferenciadas
Mimic scramble mIR-205 mimic
Inhibitor scramble mIR-205 inhibitor
Obtención hEMP
Efecto de la 
sobreexpresión e 
inhibición de mIR-205
Análisis bioinformático de la expresión de 
microRNAs en la generación de Neural Stem
Cells y Neuronas a partir de células 
pluripotentes humanas
Análisis de la expresión de los miRNAs
en la neurogénesis a partir de células 
Madre Pluripotentes humanas y en su 
ciclo celular 
Esquema de trabajo
• Inhibidor general de los factores de transcripción E2Fs (iE2Fs):
HLM006474.
• El HLM006474 es un inhibidor pan-E2Fs que inhibe la unión al
ADN de todos los complejos de factores de transcripción E2Fs.
• 24hs con una concentración 20uM del inhibidor pan-E2Fs:
HLM006474.
+ iE2Fs
CMEh + iE2Fs
Objetivos generales
 Identificar microRNAs conocidos pero que no estaban previamente
relacionados tanto con el desarrollo neuronal/ciclo celular y/o
identificar nuevos microRNAs relacionados tanto con el potencial para
la diferenciación neuronal (experimento 1), como con el ciclo celular y
capacidad proliferativa de las CMEhs (experimento 2).
 Identificar los microRNAs con niveles de expresión más
representativos
 Analizar en diferentes bases de datos (miRWalk, miRNet, Targetscan,
DIANA, etc) los genes targets predichos de estos microARNs.
 Realizar una reconstrucción funcional con la ontogenia de los genes.
 Seleccionar microRNAs candidatos ,relacionados con la regulación del
ciclo celular y la neurogénesis, para experimentos posteriores
(experimentos funcionales).
Generación NSC
Cultivo de 
CMPh sobre 
vitronectina
Día 1 de 
pasaje NSC
Cryo-preservación
Expansión
Diferenciación
Inducción Neural
7 días
• Extracción de ARN total con un kit especifico para
purificar pequeños ARNs: miRVana (Life Technologies)
• Ilumina Small RNA Library de ARN total de las
muestras de CMEhs (H9), NSC derivadas de H9, y
Neuronas diferenciadas a partir de NSCs, cada muestra
se analizó por triplicado.
• N° de lectura por muestra: 21666667.
Secuenciación - Macrogen
Secuenciación - Macrogen
Análisis bioinformático inicial se realizó en las facilities de High Throughput
RNA sequencing de la compañía Macrogen , Korea del Sur.
Secuenciación - Macrogen
Distribución de la expresión de los microARNs
Secuenciación - Análisis
Secuenciación - Análisis
Niveles de expresión 
miRNAs - Experimento 
diferenciación 
miRNAs con lecturas > 10
Secuenciación - Análisis
Experimento FDR 0.1 FDR 0.05
CMEh – iE2Fs 52 33
CMEh – NSC 806 728
NSC – NEU 335 270
CMEh – NEU 883 798
Número de miRNAs expresados diferencialmente entre las
distintas condiciones/poblaciones según el FDR (del inglés, False
Discovery Rate) utilizado.
Secuenciación - Análisis
Secuenciación - Análisis
Análisis de Componentes Principales (PCA)
Gráficos diagnostico
Volcano Plots - ver simultáneamente el fold change (eje X) y significancia (eje y) de
cada miRNA testeado.
Secuenciación - Análisis
• genes target para 3´UTR, CDS y 5´UTR
• Presentes en las tres bases de datos disponibles (TargetScan, MirDBase y
miRTarBase)
• score de 0.8 o mayor (probabilidad de que un sitio target candidato sea un sitio
target real)
• Nos quedamos sólo con los target con los posibles sitios en la región 3´UTR. De cada
miRNA seleccionamos los primeros 100 (o menos en el caso de no existir tantos) con
el mayor valor de p binding
Secuenciación - Análisis
Genes Target
Secuenciación - Análisis
Ontología génica – Procesos Biológicos
Paquete Cluster Profiler – Funcion groupGO () -clasificación génica basada en la distribución GO en un nivel
especifico
Cluster : Familia
miR-302 + miR-
367
Esencial para 
mantener
pluripotencia
CMEh1 CMEh2 CMEh3 iE2Fs1 iE2Fs2 iE2Fs3
hsa-miR-302a-3p 1095153 1228716 537152 1225797 834573 635771
hsa-miR-302a-5p 1144706 1508639 575230 1418581 1041807 1038065
hsa-miR-302b-3p 1234695 1322872 613527 1305564 886792 655253
hsa-miR-302b-5p 6907 8864 3453 9066 5465 4107
hsa-miR-302c-3p 1079285 1271846465726 1601667 835143 777278
hsa-miR-302c-5p 66200 84460 27990 81693 54090 47640
hsa-miR-302d-3p 1319910 1660719 601260 1771436 1123507 982183
hsa-miR-302d-5p 7813 10688 3966 8387 6860 5905
hsa-miR-302e 2125 2749 1028 2935 2046 1850
Antecedentes miRNAs poblaciones celulares
Secuenciación - Validación
CMEh1 CMEh2 CMEh3 NSC1 NSC2 NSC3 NEU1 NEU2 NEU3
hsa-miR-9-3p 351 369 153 12040 29212 26993 40555 15625 15961
hsa-miR-9-5p 17318 18921 9636 1474278 3595936 3838653 5634302 3942438 2819965
hsa-miR-124-3p 8328 10074 4472 134586 111918 99323 266646 225617 96313
hsa-miR-124-5p 1631 2091 788 6858 5153 5143 12333 9509 3357
CMEh1 CMEh2 CMEh3 NSC1 NSC2 NSC3 NEU1 NEU2 NEU3
hsa-miR-
329-3p 0 4 0 60 92 106 88 106 26
Posibles Herramientas
Experimentales:
• inhibitors/mimics
• genes reporteros
• CRISPR (clusters)
• AGO-IP
• Esponjas (familias)
Secuenciación - Perspectivas
Secuenciación - Perspectivas
Vector viral o 
plasmido
Promotor fuerte 
permite alta 
expresión del 
transcripto 
inhibidor 
competidor
KO de familias de 
miRNAs
¿¿ ??