Guia de TPs 2019

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BIOTECNOLOGÍA I 
 
2019 
 
GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS 
 
Licenciatura y Tecnicatura en Biotecnología 
 
 
Profesor a cargo de teóricas: Dr. Leonardo romorini 
Jefe de trabajos prácticos: Dr. Andrés Orqueda 
 
 
Universidad Nacional de Moreno 
Departamento Ciencias Aplicadas y Tecnología 
1 
 
Cronograma de clases teóricas 
 
14/: Unidad I 
21/8: Uninad II 
28/8: Unidad III 
4/9: Unidad IV 
11/9: Unidad V 
18/9: Unidad V 
25/9: Repaso 
2/10: Primer parcial teórico 
9/10: Unidad V 
16-/10: Unidad VI 
23//10: Unidad VIII 
6//11: Repaso 
20/11: Segundo parcial teórico 
27/11: Recuperatorios de exámenes teóricos 
 
Cronograma de Trabajos Prácticos 
 
Clase 1, 15/8: Presentación de la materia. Formación de grupos de trabajo. Asignación de 
papers. Cómo se presentan los papers. Confección de informes de laboratorio. 
Clase 2, 22/8: TP 1: Clonado de EPO. Análisis bioinformático. 
Clase 3, 29/8: Laboratorio. PCR de eritropoyetina. Problemas: Bioinformática. 
Clase 4, 5/9: Laboratorio. Digestión con enzimas de restricción de producto de PCR y 
plásmido. Problemas: RNA no codificante. 
Clase 5, 12/9: Laboratorio: Ligación. Problemas: RNA no codificante. 
Clase 6, 19/9: Laboratorio: transformación de bacterias. 
Clase 7, 26/9: Problemas: edición génica. 
Clase 8, 3/10: Problemas: tecnologías ómicas. 
Clase 9, 10/10: TP 2: cuantificación de miRNA. Laboratorio: obtención de cDNA a partir de 
micro RNA 
Clase 10, 17/10: Laboratorio: PCR cuantitativa de miRNA. 
Clase 11, 24/10: Problemas: microbiología industrial e ingeniería genética. 
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Clase 12, 31/10: Problemas: microbiología industrial e ingeniería genética. Repaso final. 
Clase 13, 7/11: examen práctico 
Clase 14, 14/11: Seminarios 
Clase 15, 21/11: Seminarios 
Clase 16, 28/11: Recuperatorio examen práctico 
 
Régimen de aprobación y promoción 
 
La materia se aprueba promediando 4 (cuatro) entre los dos exámenes teóricos y la 
nota de trabajos prácticos. La nota de trabajos prácticos estará compuesta por un 75 % 
correspondiente a la nota obtenida en el examen práctico, y un 25 % correspondiente a la 
presentación de seminarios y desempeño en el laboratorio. La promoción sin rendir examen 
final se alcanzará cuando se promedie 7 (siete) o más, obteniéndose además una nota mínima 
de 7 en cada examen teórico y en los trabajos prácticos. Alumnos y alumnas podrán recuperar 
sólo uno de los dos exámenes parciales teóricos, y/o el examen práctico, en caso de no 
alcanzar el 4 requerido para la aprobación de cada uno de los exámenes parciales. 
Aquellos/as que aprueben la materia sin acceder a la promoción, deberán rendir examen final. 
 
Trabajos prácticos 
 
Serán realizados en el laboratorio de Biotecnología. Es imprescindible respetar las 
normas y procedimientos detallados más adelante. Parte de los trabajos prácticos serán 
evaluados a partir del desempeño individual y grupal en el laboratorio. La aprobación de los 
trabajos prácticos exige además la aprobación de todos los informes correspondientes a cada 
TP. 
 
Problemas y Seminarios 
 
Las/os alumnas/os deberán presentar en forma oral y grupal dos publicaciones 
originales (papers) asignadas por el docente, y un tercer trabajo elegido por miembros de 
cada grupo, de un tema vinculado a los contenidos de la materia. Los trabajos se presentarán 
en las fechas asignadas a tal fin. Podrán emplearse herramientas como presentaciones en 
powerpoint, prezi, computadora, proyector, pizarrón etc. 
Por otro lado, se trabajará en clase con problemas relacionados a distintos temas 
abordados en clases teóricas.
3 
 
Confección de informes de trabajos prácticos 
 
 Elaboraremos informes de TPs siguiendo la estructura de las publicaciones científicas 
(papers). De esta manera, los informes deben contener los siguientes ítems: 
1- Título y autores del trabajo 
2- Introducción: se trata de un breve texto donde se explica el estado del conocimiento del 
tema trabajado. Es un marco teórico necesario para comprender la hipótesis de trabajo y su 
demostración. Este apartado debe incluir la hipótesis y/o objetivos. 
3- Metodología: aquí se detallan los procedimientos experimentales. La metodología consta 
en esta guía de TP, pero debe incluirse también en los informes. Es importante detallar 
cualquier cambio que se haya hecho a la metodología propuesta en la guía. 
4- Resultados. Se informan de dos maneras: a través de gráficos y/o tablas (incluyendo una 
leyenda que hace referencia a cada gráfico o conjunto de gráficos) y mediante un texto donde 
se describen los resultados obtenidos. 
5- Conclusiones y discusión: se analizan los resultados obtenidos contrastándolos con lo 
esperado y con el conocimiento del tema. Se indica si se verifica o se refuta la hipótesis de 
trabajo. Se contextualizan los resultados, tomados en su conjunto. 
Referencias. Un informe debe contener citas bibliográficas referidas a los temas, conceptos y 
teorías abordadas, en cualquier parte del informe (aunque principalmente en la introducción y 
en la discusión). El modo correcto de citar una fuente es indicar en el texto una referencia 
(numérica, por ejemplo) que permite al final del informe conocer el título del trabajo, los 
autores, la revista, el número y volumen, y las páginas. También pueden citarse libros y sitios 
de internet.
4 
 
TP 1: clonado de EPO en el vector pCMV-LacZ 
 
Introducción y objetivos 
 
 Eritropoyetina (EPO) es una hormona proteica que induce la producción de glóbulos 
rojos. Es secretada por los riñones, aunque en el feto el hígado es la fuente de producción. La 
concentración de EPO está alterada de manera dinámica por condiciones de hipoxia o 
anemia, llegando a alcanzar, en pacientes anémicos, niveles 1000 veces superior a los 
normales. 
La hormona actúa a través del receptor de Eritropoyetina, o EPOR, presente en células 
progenitoras eritroides, en las cuales inhibe la apoptosis e induce la diferenciación celular. El 
mecanismo de acción involucra la vía clásica JAK/STAT, Ras y PI3K. Mutaciones en el gen 
EPO, codificante para la proteína Eritropoyetina, son las causas principales de la anemia 
renal. 
 El objetivo del trabajo práctico 1 consistirá en clonar el gen de EPO de ratas en un 
vector plasmídico. Para ello, se aislará y amplificará la secuencia codificante por PCR 
empleando primers con secuencias de reconocimiento para enzimas de restricción, que luego 
será introducido en un vector, obteniéndose el DNA recombinante.
5 
 
Parte 1: Análisis bioinformático 
 
A- Análisis de secuencias de eritropoyetina (EPO) 
 Emplearemos la base de datos de los Institutos Nacionales de la Salud (NIH) de los 
EEUU, llamada NCBI o Pubmed. Pubmed es un conjunto de bases de datos con información 
sobre publicaciones científicas, donde también se ingresan secuencias de genes, ARNm, 
proteínas, estructuras 3D de proteínas, sustancias químicas, etc. 
 En esta sección, el objetivo será analizar la secuencia del ARNm codificante de la 
eritropoyetina (EPO), que será clonado a lo largo de las siguientes secciones del TP. 
1- Ingresar en la web del NCBI: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/. 
2- Seleccionar “Nucleotide” como base de datos. 
3- Buscar “erythropoietin”, en el cuadro de búsqueda. Se puede especificar la versión de rata 
o de Rattus. 
4- En la columna izquierda, figuran filtros de búsqueda. Probar la opción “refSeq”. 
5- Seleccionar el mRNA de EPO. 
6- ¿Qué información se obtiene de esta búsqueda? (exones, secuencia codificante, 
identificación, etc.). 
 
 A continuación, busque la secuencia génica de EPO de rata, empleando la base de datos 
“Gene”. 
7- Obtenga las secuencias del gen, del ARNm y de la proteína EPO. 
8- ¿Qué información se obtiene en esta búsqueda? 
 
B- Uso de BLAST 
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) es una herramienta de análisis de alineamientos 
de secuencias. En esta ocasión, alinearemos las secuencias del gen EPOy del mRNA EPO. 
Para ello: 
9- Abrir BLAST en la página: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 
10- Optar por “nucleotide BLAST”. 
11- Clickear la opción “Align two or more sequences”. 
12- Pegar en cada uno de los dos espacios en blanco las dos secuencias en formato 
FASTA y “blastear”. 
13- ¿Qué información se obtiene del alineamiento? 
 
C- Alineamiento múltiple con ClustalW 
El ClustalW es un programa clásico para el alineamiento simultáneo de varias secuencias. 
14- Abra el programa de acceso libre en la página https://www.genome.jp/tools-
bin/clustalw. 
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15- Ingrese al menos tres secuencias en formato FASTA de un mismo ARNm, de tres 
especies distintas (por ejemplo humano, rata y ratón), todas en la misma ventana separadas al 
presionar “ENTER”. 
16- Ejecutar el alineamiento múltiple. 
17- Opte por la elaboración de un árbol filogenético enraizado. 
 
D- Diseño de primers para analizar la expresión génica de F9 
 Emplearemos el software libre Primer3Plus, junto con la base de datos de Pubmed, para 
diseñar primers para amplificar el gen F9 humano, que codifica el factor IX, una proteína 
importante para la coagulación, cuyas mutaciones son causa frecuente en la hemofilia. 
18- Buscar la secuencia del mRNA de F9 humano y copiar la secuencia en formato 
FASTA. 
19- Ingresar al sitio de diseño: http://primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi 
20- Pegar la secuencia y buscar los primers clickeando el botón “pick primers”. Tomar 
nota del mejor par. 
21- ¿Qué consideraciones son importantes a la hora de diseñar primers de expresión en 
células de mamífero? 
22- ¿Qué indican los parámetros Start, length, Tm, GC %, etc.? 
 
Una vez encontrado un par de primers, es imprescindible verificar que ese mismo par es 
específico, y no amplificará ninguna otra secuencia génica (off-target, o mis-match). Para 
ello, se puede usar la opción primer-BLAST, que nos informará aquellas secuencias donde se 
aparearán los primers usados. 
23- En BLAST, elegir la opción primer-BLAST. 
24- Ingresar las secuencias de los primers forward y reverse, y contrastar contra la base de 
datos de BLAST. Tomar nota de posibles casos de apareamiento indeseado. 
 
E- Diseño de primers para clonar F9 
25- Especifique qué tipo de secuencia deberá emplear para clonar el gen F9. 
En este caso, los oligos deberán contener sitios de corte para HindIII y EcoRIV. 
26- ¿Qué consideraciones son esenciales para diseñar oligos que contengan los sitios de 
corte para enzimas de restricción? 
27- Diseñe, usando Primer3Plus, oligos para clonar F9 humano. 
28- Verificar la especificidad de estos primers. 
 
 
 
 
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Cuestionario 
 
1- ¿Cómo se identifican las secuencias? 
2- ¿Qué significa que una secuencia está curada? 
3- ¿Cómo se identifican los exones, intrones y secuencia codificante? 
4- ¿Qué es un árbol filogenético? 
5- ¿De qué manera se concluye acerca de la cercanía o lejanía entre especies (o secuencias) al 
realizar filogenias moleculares? 
6- ¿Qué debe considerarse a la hora de diseñar primers para analizar la expresión génica? ¿Y 
para clonar? 
8 
 
Parte 2: Extracción de DNA plasmídico (no se realiza en clase) 
 
 Este protocolo de extracción de DNA plasmídico se basa en el uso de una solución 
de Fenol/Cloroformo/isoamílico. Sirve para obtener DNA de buena pureza (apto para 
transfecciones de células de mamíferos) en bajos volúmenes (menores a 0,4 ml) y baja 
concentración (típicamente hasta 1mg/ml). 
 Se partirá del cultivo de una colonia de E. coli (cepa DH5) en 3 ml de medio LB-
ampicilina (100 g/ml) previamente transformada con el plásmido a aislar (pCMV-LacZ) 
crecido toda la noche (over-night, ON) a 37°C en estufa. 
 
Materiales 
Solución 1: Tris-Cl 0,025 M; EDTA 0,01 M; pH 8 
Solución 2: NaOH 0,2 N; SDS 1 % 
Solución 3: Acetato de Potasio 3 M, ácido acético 11,5 %; pH 4,8 
25:24:1 (v/v/v) fenol/cloroformo/alcohol isoamílico en relación 25:24:1 (v/v/v) 
Acetato de sodio 3M pH 5.2 
Etanol 100 % frío 
Etanol 70 % 
H2O destilada (H2Od) 
Buffer TE (Tris-HCl pH 8 10 mM, EDTA 1 mM) 
 
Metodología 
1- Cosechar las células en cultivo por centrifugación a 5000 rpm durante 5 min a temperatura 
ambiente (T.a.). Descartar el sobrenadante. 
2- Al pellet agregarle 200 l de Solución 1. Vortexear hasta que se resuspenda el pellet. 
3- Agregar 400 l de Solución 2 de a 1 tubo por vez y mezclar por inversión 5 min. hasta que 
la suspensión se vea clara. Incubar 5 min. en hielo mezclando regularmente. 
4- Agregar 300 l de la Solución 3 y mezclar rápidamente por inversión hasta que los 
grumos se repartan homogéneamente en el tubo. Incubar 5 min. en hielo mezclando 
regularmente. 
5- Centrifugar 5 min. a velocidad máxima. 
6- Transferir el SN (700 l) a un nuevo tubo limpio. Agregar 3 l de RNasaA (10 mg/ml) e 
incubar 15 min. a 37 °C. 
7- Agregar igual volumen de fenol/cloroformo/ alcohol isoamílico a la solución de DNA en 
un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. 
8- Vortexear 10 seg. y centrifugar 15 seg. a T.a. 
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9- Remover la fase superior (acuosa) que contiene el DNA y transferir a nuevo tubo y 
rotulado. Medir con pipeta el volumen que se toma. 
10- Agregar 1/10 volumen de 3M Acetato de sodio pH 5,2 a la solución de DNA. 
Vortexear brevemente o mezclar por inversión. 
11- Agregar 2,5 vol de Etanol 100 % pre-enfriado. Mezclar con vortex y dejar en hielo 
por 5 min. 
12- Centrifugar 5 min. a máxima velocidad. Remover el SN. 
13- Agregar 1ml de Etanol 70 % a Ta. Mezclar por inversión y centrifugar 5 min. a 
máxima velocidad. 
14- Remover el SN. Dejar secar el pellet por hasta 5 minutos. 
15- Resuspender el pellet de DNA en 100 l de buffer TE. 
16- Cuantificar el DNA plasmídico con el espectrofotómetro. 
17- Guardar a -20 °C. 
 
Electroforesis en gel de agarosa 
Las muestras de plásmidos purificados por cada grupo se correrán en un gel de agarosa 0,8 
%. Para ello, deberán sembrarse las muestras en una solución adecuada, buffer de siembra 
(loading buffer) en nuestro caso. 
Fórmulas del buffer TAE: (50 X, 1 litro): Tris base 242 g, Acético glacial 57.1 ml, EDTA pH 
8 100 ml de 0.5 M. 
1- Pesar la cantidad necesaria de agarosa y agregarla a un volumen de buffer TAE, de modo 
que la concentración final de agarosa sea 0,8 %. El volumen del gel dependerá de la cantidad 
que soporta la “cama” de la cuba electroforética. 
2- Calentar en microondas para diluir la agarosa. 
3- Dejar enfriar ligeramente. 
4- Preparar la cama con los peines. 
5- Agregar Bromuro de Etidio llevando a concentración final 1 g/ml. CUIDADO: EL 
BROMURO DE ETIDIO ES ALTAMENTE MUTAGÉNICO. 
6- Preparar las muestras en buffer de siembra. Considerar el volumen que se sembrará y la 
concentración de trabajo del buffer de siembra. 
7- Sembrar 10 l de muestras en buffer de siembra, con una muestra por calle incluyendo un 
marcador de PM. 
8- Correr a 100 V. 
9- Visualizar en transiluminador. CUIDADO: EL TRANSILUMINADOR FUNCIONA 
CON LUZ UV. 
 
 
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Cuestionario 
1- ¿Cuáles son las características de la cepa DH5? 
2- ¿Por qué se usan geles de agarosa de diferentes porcentajes? 
3- Explicar para qué se usa bromuro de etidio, cómo corre, cómo se relaciona con la carga 
del DNA, los electrodos y cuáles son los peligros al usarlo. 
4- ¿Cuáles son los elementos relevantes del plásmido pCMV-LacZ y por qué? 
5- ¿Qué información se obtiene a partir de los valores de las relaciones A 260/A230 y A 
260/280 (donde A es absorbancia y 230, 260 y 280 son las longitudes de onda medidas en 
nanómetros)? 
6- ¿Qué representan las bandas observadas en la electroforesis en gel de agarosa? Describir 
un resultado típico. 
7- Explicar la función del marcador de peso molecular. 
11 
 
Parte 3: PCR de Eritropoyetina 
 
 El fragmento de ADN que contiene la secuencia codificante para Eritropoyetina 
(EPO) se obtendrá mediante amplificación por PCR utilizando un par de primers específicos 
y, como templado,el cDNA obtenido a partir de la retro-transcipción del RNA total 
purificado a partir de un cultivo de células de mamífero. 
 
Materiales 
 
Buffer reacción 10 X 
MgCl2 50 mM 
dNTPs 10 mM (mezcla) 
Secuencias de los primers: 
Forward: AGCCGAATTCCGAGATGGGGGTGCCCGAA 
Reverse: GATTGGATCCTCACCTGTCCCCTCTCCTG 
Taq polimerasa 
H2Od 
cDNA 
 
Metodología 
 
1- Se utilizarán tubos de 0.2 ml, manteniendo las muestras siempre en hielo hasta el 
momento de la reacción (PCR). Emplearemos 1 l de cDNA disuelto en H2O. A continuación 
se detalla la tabla con las concentraciones iniciales, finales y volumen a pipetear de cada 
reactivo. 
 Concentración final Volumen 
cDNA 1 l 
Buffer 10 X 1 X 2,5 l 
MgCl2 50 mM 4 mM 2 l 
dNTPS mix 10 mM 0.25 mM 0.625 l 
Primers mix 20 M c/u 0,4 M 0.5 
Taq DNA Pol 1.25 U 0.2 l 
H2O 17,625 l 
 
2- Dar un spin a las muestras. 
3- Colocar los tubos en la máquina cicladora (PCR). 
4- Programa PCR: 
12 
 
Desnaturalización 95 °C 5 min 
 Desnaturalización 95 °C 30 seg 
 Annealing 60 °C 30 seg x 40 ciclos 
 Elongación 72 °C 30 seg 
Elongación 72°C 10 min 
 
5- Correr los productos de PCR en un gel de agarosa 2 %, con una muestra por calle 
incluyendo un marcador de PM. 
 
Cuestionario 
1- ¿En qué consiste la retro-transcripción? ¿Qué elementos y reactivos se emplean en este 
ensayo? Describa la metodología. 
2- Cuáles son los factores que controlan la especificidad de la pegada de los primers a la 
secuencia blanco, y de qué modo lo hacen? 
3- ¿Cuáles son las consecuencias de realizar una PCR con un alto número de ciclos? 
4- Graficar una curva típica de producto de PCR formado vs. número de ciclos. Explicar el 
gráfico. 
13 
 
Parte 4: Doble digestión con enzimas de restricción 
 
 Mientras que una alícuota de la preparación de vector puede ser digerida con enzimas de 
restricción sin pasos previos, el producto de PCR contiene Taq polimerasa y dNTPs que 
deben ser eliminados antes de la digestión. Por lo tanto, el producto de PCR será purificado 
con un kit de extracción de DNA a partir de agarosa (Qiagen) 
 Emplearemos dos enzimas de restricción (ER), EcoRI y BamHI, que usan diferentes 
buffers óptimos. Por lo tanto, el protocolo para la doble digestión se modificará de acuerdo a 
las instrucciones del fabricante. 
 
Materiales 
 
Enzimas de restricción EcoRI y BamHI 
Buffer Tango para las ER 
Producto de PCR y plásmido 
cicladora 
 
Metodología 
1- Utilizaremos un tubo para digerir el vector y otro tubo para digerir el producto de PCR, 
preparando las reacciones en tubos de PCR de acuerdo a la siguiente tabla: 
 
Tubo Vector: 
pCMV-LacZ x l (0.1-0.3 g DNA en buffer TE) 
Buffer 10X ER 2 l 
Enzima EcoRI 1 l (1 U/g DNA) 
Enzima BamHI 1 l (1 U/g DNA) 
H2O c.s.p. a 20 l 
 
Tubo fragmento (PCR) 
Producto PCR x l (0.4-0.8 g DNA en buffer TE) 
Buffer 10X ER 2 l 
Enzima EcoRI 1 l (1 U/g DNA) 
Enzima BamHI 1 l (1 U/g DNA) 
H2O c.s.p. a 20 l 
 
2- Programar la cicladora: 
Incubación por 2 horas a 37 °C. 
Inactivación de las ER a 65 ºC por 20 minutos. 
3- El DNA puede congelarse a -20°C hasta su re utilización. 
 
 
 
14 
 
 
Cuestionario 
 
1- Explicar en qué se basa la purificación de ácidos nucleicos a partir de geles de agarosa 
teñidos con bromuro de etidio. 
2- Indicar qué son las enzimas de restricción y cuáles son sus características. Diferenciar 
entre extremos romos y cohesivos de los sitios de corte. 
3- ¿Cómo está dada la especificidad de las ER? ¿Cómo se ve afectada por las 
condiciones de la digestión? 
4- Explicar cómo se calculan las probabilidades de corte de las ER. En el caso de querer 
cortar una única vez una secuencia de DNA con una ER que reconoce varios sitios de 
cortes en dicha secuencia: ¿cómo puede logarse este objetivo? 
15 
 
Parte 5: Ligación 
 
 Se ligará el producto de PCR con el vector pCMV-LacZ, ambos previamente digeridos 
con enzimas de restricción. Utilizaremos la ligasa de DNA del fago T4, una enzima 
ampliamente utilizada para ligaciones estándares. Las reacciones de ligación serán llevadas a 
cabo en tubos de PCR (0,2 ml) en cicladora. 
 
Materiales 
T4 DNA ligasa 
Buffer T4 DNA ligasa 
Vector e inserto 
Cicladora 
 
 
Metodología 
1- Preparar los tubos de reacción de acuerdo a la siguiente tabla: 
 
Buffer de reacción 5x 4 l 
Vector linearizado 20-50 ng 
Inserto X (Relación Molar Inserto:Vector 3:1) 
T4 DNA Ligasa 1 l 
H2O a 20 l 
 
2- Realizar control sin ligasa. 
3- Incubar a 23-26 ºC durante 1 hora 
 
Cuestionario 
1- ¿De qué modos puede controlarse la ligación por la ligasa de DNA T4? 
2- Cómo afectan los extremos romos y cohesivos a la ligación? 
3- Explicar cómo puede evitarse la sobreligación de repeticiones en tándem, ya sea en el caso 
de emplear ER que dejan extremos romos o cohesivos. 
4- ¿Para qué se emplea un control sin ligasa? 
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Parte 6: Transformación de bacterias competentes 
 
 Se emplearán cultivos bacterianos de Escherichia coli cepa DH5 competentes. Las 
bacterias competentes serán preparadas por los docentes por el método de CaCl2. La 
selección consistirá en la resistencia al antibiótico ampicilina. 
 
Materiales 
Bacterias competentes 
DNA recombinante 
Medio LB estéril 
Estufa a 37 °C con agitación 
Placas con LB-agar, ampicilina 100 g/ml, IPTG (0,5 mM) y X-gal (80 g/ml) 
 
Metodología 
1- En un eppendorf estéril mezclar 50 l de células competentes preparadas anteriormente 
con 5 l de la reacción de ligación. 
2- Incubar 30 min. en hielo y transferir a 42 °C durante 90 seg. (MUY IMPORTANTE 
CONTROLAR EL TIEMPO). 
3- Agregar 1 ml de LB e incubar durante 30 min a 37 °C en agitación. 
4- Centrifugar 2 min. A 6000 rpm y descartar el sobrenadante dejando una gota. 
5- Sembrar en placas de LB-ampicilina. Se realizarán los siguientes controles: 1) Eficiencia 
de las competentes con vector cuantificado sin cortar en LB-ampi; 2) Transformación con 
vector cortado sin ligasa en LB-ampi; 3) No crecimiento de competentes en LB-ampi. 
6- Incubar toda la noche (ON) a 37 °C. luego dejar en heladera a 4 °C 
7- Estimar la eficiencia de transformación (en cfu/ g DNA) de acuerdo a la siguiente 
fórmula: 
 
 
 
Como referencia, un valor estándar de eficiencia de transformación 108 cfu/g DNA. 
8- Contar el número de colonias positivas (transformadas con el vector con el inserto ligado) 
y calcular el % de colonias positivas. 
 
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Cuestionario 
1- ¿Por qué hablamos de colonias y clones? 
2- ¿Qué indican números bajos y altos de eficiencia de transformación? 
3- ¿Qué representan las colonias blancas y las azules? ¿Para qué sirven el IPTG y el X-gal? 
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Parte 7: Análisis de transformantes (Screening) (no se realiza en clase) 
 
 Se evaluarán las colonias transformadas por colony PCR a través de la formación de 
de colonias blancas y azules. Además, se amplificará EPO a partir de una colonia empleando 
primers específicos. 
 
Materiales 
Buffer reacción 10 X 
MgCl2 50 mM 
dNTPs 10 mM (mezcla) 
primers 
 
Taq polimerasa 
H2Od 
Placas de bacterias 
 
Metodología 
1- Se utilizarán tubos de 0.2 ml, manteniendo las muestras siempre en hielo hasta el 
momento de la reacción (PCR). Emplearemos como molde una colonia blanca de la placa de 
transformación, tomandola con tip amarillo y sumergiendo en el tubo de reacción. A 
continuación se detalla la tabla con las concentraciones iniciales, finales y volumen a pipetear 
de cada reactivo. 
 Concentración final Volumen 
DNA 1 colonia 
Buffer 10 X 1 X 2,5 l 
MgCl2 50 mM 
dNTPS mix 10 mM c/u 0.28 mM final c/u 0.7 l 
Primers mix 20 M c/u 0,4 M 0.5 
Taq DNA Pol 1.25 U 0.25 l 
H2O 25 l 
 
6- Dar un spin a las muestras. 
7- Colocar los tubos en la máquina cicladora (PCR). 
8- Programa PCR: 
 
 
 
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Desnaturalización 95 °C 3 min 
 Desnaturalización95 °C 30 seg 
 Annealing 55 °C 30 seg x 35 ciclos 
 Elongación 72 °C 30 seg 
Elongación 72°C 10 min 
9- Correr los productos de PCR en un gel de agarosa 2 %, con una muestra por calle 
incluyendo un marcador de PM. 
 
Cuestionario 
1- Explique a qué se debe la formación de colonias blancas y azules. 
2- Para que la colony PCR sea efectiva, es necesario que esté libre el DNA bacteriano. 
¿Cómo se logra esto? 
3- ¿A qué podrá deberse la presencia mayoritaria de colonias azules y unas pocas colonias 
blancas de diferente tamaño? 
4- Usted clonó un gen con primers que contenían en sus secuencias el sitio de 
reconocimiento para una misma enzima de restricción junto con una secuencia 
complementaria a una porción del gen de interés; al final del clonado (siguiendo el mismo 
esquema que el de este TP) se obtienen en una placa con IPTG y X-Gal colonias blancas y 
azules. Tras realizar una colony PCR, con los mismos primers con los que amplificó el gen de 
interés al comienzo, de una única colonia, se amplifica un producto del tamaño adecuado. Sin 
embargo, al extraer proteínas y realizar ensayos de Western blot, no se detecta ninguna 
proteína. ¿Cuál podrá ser la causa/s? 
20 
 
TP 2: cuantificación de micro RNA 
 
Introducción y objetivos 
 
 Los microARNs son moléculas de ARN no codificantes de aproximadamente 18-24 
nucleótidos que regulan la expresión génica al interactuar con secuencias específicas 
presentes en los ARNm o en las regiones regulatorias de los mismos. Estos reguladores post-
transcripcionales pueden ser célula- o tejido- específicos, y establecen y mantienen el perfil 
de expresión proteico característico de cada fenotipo celular. En particular, 1 único 
microARN es capaz de regular a cientos de ARNm por lo que es posible cambiar un fenotipo 
mediante la modulación de un solo microARN. Los microARNs se han comenzado a utilizar 
como herramientas biotecnológicas, como por ejemplo en producción biofarmacéutica 
manipulando procesos celulares que permiten una mejora en la eficiencia de producción de 
bioproductos de interés. 
 Durante los últimos años numerosos estudios han demostrado que la expresión de un 
grupo específico de microARNs se encuentra inducida en condiciones de hipoxia. El único 
que presenta un aumento robusto en todos los tipos celulares estudiados es el microARN-210, 
el cual regula genes asociados al procesamiento y reparación del ARN y ADN, tráfico nuclear 
y citoplasmático, función mitocondrial, metabolismo, control del ciclo celular y proliferación, 
apoptosis y supervivencia celular, diferenciación y desarrollo. La expresión del microARN-
210 es inducida por hipoxia en células madre pluripotentes humanas (CMPh) y, dado que la 
hipoxia favorece el mantenimiento del estado indiferenciado, la proliferación y también 
previene la diferenciación espontánea de CMPh, la manipulación genética de dicho 
microARN puede llegar a ser de importancia biotecnológica en medicina regenerativa. 
 
Objetivos del TP: 
A partir de ARN total aislado de CMPh transfectadas con secuencias que sobre-expresan al 
microARN-210 o por el contrario lo inhiben (miRNA mimic o miRNA inhibitor, 
respectivamente): 
Parte 1: Se obtendrá ADNc (o cDNA) por retrotranscripción de los ARNm y del microARN-
210 mediante la utilización de oligo-dT y un stem-loop primer específico para el microARN-
210. 
Parte 2: Se cuantificarán y compararán los niveles de expresión relativa del microARN-210 y 
de un gen normalizador (house-keeping) como RPL7 mediante PCR en tiempo real (qPCR) 
entre las distintas condiciones experimentales. 
 
Parte 1 - Metodología 
 
Las muestras que emplearemos son microARN obtenido a partir de cultivos de células H9 
NSC (neural stem cells derivadas de células madre embrionarias H9), transfectadas con 
diferentes secuencias de microARN: 
 
21 
 
- mimic NT (not targetting), control de la secuencia mimética. 
- mimic mir-210. 
- inhibitor NT, control de la secuencia inhibitoria. 
- inhibitor mir-210. 
 
a- Retrotranscripción de los microARNs maduros 
 
• 0,25 µg de Oligo dT (0,5 µg/µl). 
• 1 µg RNA tratado con ADNasa 
• 0,4 mM de cada dNTPs 
• 1 µM stem loop primer 
• H2O MilliQ volumen final 13,5 µl 
En cada tubo Volumen (µl) 
Oligo dT (0,25µg) 0,5 
SLO primer mix (10 µM) 2 
dNTPs 8 mM 1 
RNA (1-2 µg) 
H2O MilliQ a 13,5 
 
1- Incubar 5 minutos a 65 ° 
2- Incubar 1 minuto en hielo 
3- Hacer un spin 
 
b- Preparar la siguiente mix (se indican los volúmenes para cada tubo de reacción): 
 
• 4µl de First Strand Buffer 5X 
• 1µl de 0,1 M DTT 
• 1µl RNasa OUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor 
• 0,5 µl de SSIII Reverse Transcriptase (100 U) 
 
1- Incubar 30 minutos a 16 °. 
2- Incubar 30 minutos a 42 °. 
3- incubar 1h a 50 °. 
4- Hacer un spin. 
5- Incubar 15 min a 70° 
22 
 
Hacer una dilución 1:10 en agua Milli-Q para hacer la q-PCR 
 
Parte 2 – Metodología 
 
Se realizará la cuantificación de los microARN por PCR en tiempo real cuantitativa 
empleando SYBR Green™. Este método se basa en la amplificación de una secuencia por 
PCR, empleando SYBR Green™, un fluoróforo que se intercala en el ADN, de modo tal que 
el equipo Real time mide la fluorescencia emitida por el mismo durante la etapa de la 
elongación de la síntesis del ADN. De esta manera, a mayor detección de fluorescencia, 
mayor cantidad de ADN sintetizado. 
Con este objetivo, emplearemos el kit comercial de Applied Bioscences, que consiste en una 
Master Mix que contiene la ADN polimerasa, un buffer adecuado, magnesio (cofactor de la 
ADNpol) y dNTPs. Solo resta agregarle los primers específicos y el molde, en un volumen 
final de 20 l. se trabajará con microtubos en ristra y tapas especiales. 
La cuantificación se realizará a partir de una curva de calibración (o estándar) empleando 
diluciones seriadas de la muestra que contiene mayor cantidad de microARN. 
Los tubos de reacción que se prepararán serán los siguientes, tanto para amplificar 
microARN-210 con el house-keeping RPL7: 
- mimic NT (not targetting). 
- mimic mir-210. 
- inhibitor NT. 
- inhibitor mir-210. 
- Control negativo (pipetear agua en lugar de molde). 
- Punto 1 de la curva. 
- Punto 2 dela curva. 
- Punto 3 de la curva. 
- Punto 4 de la curva. 
 
 
a- Preparación de la mezcla de reacción para las muestras: 
 
Master Mix 2X 10 l 
Primer 5´ 0,5 l 
Primer 3´ 0,5 l 
Molde (cDNA) 1 l (dilución 1/10) 
H2O 8 l 
 
Preparación de la mezcla de reacción para la curva de calibración: 
 
 Punto 1 Punto 2 Punto 3 Punto 4 
Master Mix 2X 10 l 10 l 10 l 10 l 
Primer 5´ 0,5 l 0,5 l 0,5 l 0,5 l 
Primer 3´ 0,5 l 0,5 l 0,5 l 0,5 l 
Molde (cDNA) 4 l (dilución 
1/10) 
1 l 0,25 l 0,0625 l 
H2O 5 l 8 l 8,75 l 8,94 l 
 
 
23 
 
b- Programación del equipo de Real time. 
Programar el equipo a partir de una plantilla o molde. Dado que el método empleado es el del 
SYBR Green, asegurarse que la lectura de la fluorescencia por equipo se realiza durante la 
elongación. Además de amplificar una secuencia de interés, se realizará una curva de melting 
para evaluar la calidad del amplicón (esta función debería estar incluida en la plantilla). 
 
c- Análisis de los resultados. 
Tomar nota de los valores de Ct arrojados por el programa del equipo, así como rescatar la 
información de la curva de amplificación y de melting. 
Determinar los niveles iniciales de microARN de acuerdo a la fórmula logarítmica de 
amplificación exponencial. Estimar la eficiencia de amplificación. Informar los valores de 
masa relativa, para cada tratamiento, del microARN-210 relativizado a RPL-7. 
 
 
Anexo – Secuencias de primers empleados 
 
- mIR-210 Stemloop: 
GTCTCCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGGAGACTCAGCC 
- mIR-210 Fw (5´): 
GCGGCGGCTGTGCGTGTGACAG 
- microRNAs Rv (3´) (secuencia universal): 
ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG 
- RPL7 Fw: 
AATGGCGAGGATGGCAAG 
- RPL7 Rv: 
-TGACGAAGGCGAAGAAGC 
24 
 
REGLAS BÁSICAS DE HIGIENE Y SEGURIDAD EN LABORATORIOS DE 
QUÍMICA Y BIOLOGÍA – PAUTAS DE ACTUACIÓN EN CASOS DE 
EMERGENCIAS 
 
Las prácticas que se realizan en los laboratorios presentan riesgos propios de cada actividad. 
Las reglas básicas aquí indicadas son un conjunto de normas destinadas a proteger la salud de 
los alumnos y a evitar accidentes y contaminaciones tanto dentro del ámbito de trabajo, como 
hacia el exterior. 
Es un elemento clave en la seguridad la información que permita reconocer y minimizar o 
evitar los riesgos presentes en el laboratorio. Será fundamental respetar la metodología de 
cada técnica, y trabajar con cuidado y en forma ordenada. 
 
MEDIDAS GENERALES 
 
1. Se deberá conocer la ubicación de los elementos de seguridad en el lugar de trabajo, tales 
como: matafuegos, salidas de emergencia, mantas ignífugas, lavaojos, gabinete para contener 
derrames, accionamiento de alarmas, etc. 
2. No se debe comer, beber, fumar o maquillarse en el laboratorio. 
3. No se debe guardar alimentos en heladeras que contengan drogas o preparados. 
4. Se debe utilizar vestimenta apropiada para realizar trabajos de laboratorio, guardapolvo 
abrochado (preferentemente de algodón y de mangas largas) y zapatos cerrados. Evitar el uso 
de accesorios colgantes (aros, pulseras, collares, etc.) y cabello recogido. 
5. Las mesadas de trabajo, deben estar despejadas, sin libros, ni abrigos ni objetos personales. 
Es imprescindible mantener el orden y la limpieza. Cada persona es responsable directa de la 
zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes. 
6. Las manos deben lavarse cuidadosamente después de cualquier manipulación de 
laboratorio y antes de retirarse del mismo. 
7. Se deben utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias química o 
material biológico. Toda persona cuyos guantes se encuentren contaminados no deberá tocar 
objetos, ni superficies, tales como: teléfono, lapiceras, manijas de cajones o puertas, 
cuadernos, etc. 
8. No se permite correr en los laboratorios. 
9. No se deben bloquear las rutas de escape o pasillos con bancos, sillas, equipos, máquinas u 
otros elementos que entorpezcan la correcta circulación. 
10. De aviso inmediato al docente responsable si encuentra instalaciones eléctricas y de gas 
precarias o provisorias. 
11. No utilice equipos (Ej. Rotavap, columnas de destilación, sonicadores, hornos etc) sin 
haber recibido entrenamiento previo y sin supervisión durante su uso. 
12. Toda herida o abrasión, aún los pequeños cortes que puedan producirse durante el trabajo 
práctico deben ser informados al Docente. Los laboratorios cuentan con un botiquín de 
primeros auxilios con los elementos indispensables para atender casos de emergencia. 
13. Respete las señales de advertencia. (ej.: riesgo eléctrico, alta temperatura, radiaciones, 
etc.) 
25 
 
14. Todo residuo generado debe colocarse en los recipientes destinados para tal fin según las 
indicaciones del docente (ver Pautas para Gestión de Residuos). 
 
LABORATORIOS DE QUÍMICA 
 
1. No se permite pipetear con la boca. 
2. Siempre que sea necesario proteger los ojos y la cara de salpicaduras o impactos se 
utilizarán anteojos de seguridad, viseras o pantallas faciales u otros dispositivos de 
protección. Cuando se manipulen productos químicos que emitan vapores o puedan provocar 
proyecciones, se evitará el uso de lentes de contacto. 
3. No utilice el contenido de un recipiente que no esté identificado. Los envases que 
contengan agentes químicos deben adecuadamente etiquetados con la denominación del 
compuesto y el tipo de riesgo (Ej.: corrosivo, tóxico, inflamable, oxidante, radiactivo, 
explosivo o nocivo). 
4. Cuando sea necesario manipular grandes cantidades de materiales inflamables (más de 5 
litros) deberá tenerse a mano un extintor apropiado para ese material en cuestión. 
5. Al almacenar sustancias químicas se debe considerar las incompatibilidades que dan lugar 
a reacciones peligrosas. Consultar con el Docente. 
6. No almacenar en estantes sobre mesadas sustancias corrosivas y en caso de ácidos o álcalis 
concentrados (mayor de 2N) deben ser mantenidos en bandejas de material adecuado. 
7. Las prácticas que produzcan gases, vapores, humos o partículas, y que puedan ser riesgosas 
por inhalación deben llevarse a cabo bajo campana. 
8. Se debe verificar la ausencia de vapores inflamables antes de encender una fuente de 
ignición. 
9. No se debe trabajar con materiales inflamables o solventes sobre llama directa o cerca de 
las mismas. Para calentamiento, sólo se utilizarán resistencias eléctricas o planchas 
calefactoras blindadas. Se prestará especial atención al punto de inflamación y de 
autoignición del producto. 
10. Está prohibido descartar líquidos inflamables o tóxicos o corrosivos por los desagües de 
las piletas, sanitarios o recipientes comunes para residuos. Se deben seguir las pautas para la 
gestión de residuos. 
11. Los cilindros de gases comprimidos y licuados deben estar en posición vertical sujetos 
con correas o cadenas a la pared en sitios de poca circulación, de ser posible fuera del lugar 
de trabajo, protegidos de la humedad y fuentes de calor. 
12. El material de vidrio roto no se depositará con los residuos comunes. Será conveniente 
envolverlo en papel y ubicarlo en cajas resistentes. 
13. Todo recipiente que hubiera contenido agentes químicos puede ser descartado junto a los 
residuos comunes vaciado totalmente, enjuagado apropiadamente y sin etiquetas. 
14. Está terminantemente prohibido hacer experimentos no autorizados por el Docente. No 
substituya nunca, un producto químico por otro en una práctica. 
 
LABORATORIOS DE BIOLOGIA 
 
1. Leer Reglas Básicas para Laboratorios de Química. 
26 
 
2. Se deben utilizar mascarillas descartables cuando exista riesgo de producción de aerosoles 
(mezcla de partículas en medio líquido) o polvos, durante operaciones de pesada de 
sustancias tóxicas o biopatógenas, apertura de recipientes con cultivos después de agitación, 
etc. 
3. Está prohibido descartar materiales biológicos por los desagües de las piletas, sanitarios o 
recientes comunes para residuos. En cada caso se deberán seguir los procedimientos 
establecidos para la gestión de residuos. 
4. La superficie de trabajo se deberá descontaminar una vez terminadas las tareas o luego de 
cada derrame de material viable, utilizando productos probadamente efectivos contra los 
agentes con que se trabaja. 
5. El derrame o caída de muestras contaminadas, diluciones y medios sembrados o inoculados 
será informada al docente de inmediato. Se procederá a tratar el área afectada con la solución 
desinfectante que corresponda, la cual se dejará actuar y se recogerá con papel absorbente que 
será luego descartado con los residuos patogénicos. 
6. En caso de rotura del recipiente de vidrio que contiene microorganismos, proceder de igual 
forma, pero no tocarlos residuos antes que el desinfectante haya actuado. 
7. Cuando proceda a la limpieza de una superficie con alcohol, verifique que no haya 
mecheros encendidos. 
8. Consulte con el Docente si el material biológico debe ser descontaminado previo a su 
descarte en recipiente de residuos patogénicos (bolsa roja). 
 
PAUTAS PARA LA GESTION DE RESIDUOS PELIGROSOS Y PATOGENICOS 
 
Peligrosos (ácidos, álcalis, oxidantes, corrosivos, guantes, trapos, etc.): 
Los residuos líquidos se deberán acumular en Bidones provistos por el Servicio de Higiene y 
Seguridad. Mantenerlos tapado. No mezclar sin consultar al Docente. 
Los residuos sólidos se deberán acumular en bolsas negras dentro de cajas provistas por el 
Servicio de Higiene y Seguridad. No tirar residuos domésticos. 
Patogénicos (tips, guantes, cajas de petri, etc.): 
Los residuos biológicos (sangre, tejidos animales o humanos y todo el material que haya 
estado en contacto con ellos) se deberán acumular en bolsasrojas dentro de cestos con tapa 
provistos por el Servicio de Higiene y Seguridad. 
Quedan exceptuados los elementos cortopunzantes (agujas, hojas de bisturíes), que se 
recogerán en contenedores especiales. 
 
ANTE CUALQUIER DUDA CONSULTE CON EL DOCENTE 
 
PAUTAS DE ACTUACION EN CASO DE EMERGENCIAS 
 
EMERGENCIAS MÉDICAS 
 
Si ocurre una emergencia tal como cortes o abrasiones, quemaduras o ingestión accidental de 
algún producto químico, tóxico o peligroso, se deberá proceder en la siguiente forma: 
1. A los accidentados se les proveerá los primeros auxilios 
27 
 
2. Se da aviso a la enfermería (Int.101) dependiente del Departamento de Bienestar 
Universitario (Int. 126) 
1. Quemaduras 
Las pequeñas quemaduras producidas por material caliente, baños, placas o mantas 
calefactoras, etc., se tratarán lavando la zona afectada con agua fría durante 10-15 minutos. 
Las quemaduras más graves requieren atención médica inmediata. No utilices cremas y 
pomadas grasas en las quemaduras graves. 
2. Cortes 
Los cortes se tienen que lavar bien, con abundante agua corriente, durante 10 minutos como 
mínimo. Si son pequeños y dejan de sangrar en poco tiempo, lávalos con agua y jabón y 
tápalos con una venda o apósito adecuados. Si son grandes y no paran de sangrar, requiere 
asistencia médica inmediata. 
3. Derrame de productos químicos sobre la piel. Los productos químicos que se hayan vertido 
sobre la piel han de ser lavados inmediatamente con agua corriente abundante, como mínimo 
durante 15 minutos. Es necesario sacarle toda la ropa contaminada a la persona afectada 
loantes posible. El lavado es muy importante para reducir la gravedad y la extensión de la 
herida. Requiere asistencia médica. 
La seguridad la disfrutamos todos. Actuemos responsablemente. En caso de accidente, avisar 
inmediatamente al Docente. 
4. Actuación en caso de producirse corrosiones en la piel 
Por ácidos. Sacar o cortar lo más rápidamente posible la ropa. Lavar con agua corriente 
abundante la zona afectada. Neutralizar la acidez con bicarbonato sódico durante 15-20 
minutos. Esperar la asistencia médica. 
Por álcalis. Lavar la zona afectada con agua corriente abundante y luego con una solución 
saturada de ácido bórico. Secar y esperar la asistencia médica. 
5. Fuego en el cuerpo. 
Si se te incendia la ropa, pide ayuda. El afectado tiene que tirarse en el suelo y rodar sobre sí 
mismo para apagar las llamas, que no corras. Es tu responsabilidad ayudar a alguien que se 
esté quemando. Cubrirlo con una manta antifuego, conducirlo hasta la ducha de seguridad, si 
está cerca. No utilices nunca un extintor sobre una persona. Una vez apagado el fuego, 
mantener a la persona tendida, hasta que llegue la asistencia médica. 
6. Actuación en caso de producirse corrosiones en los ojos. 
En este caso el tiempo es esencial (menos de 10 segundos). Cuanto antes se lave el ojo, 
menos grave será el daño producido. Lavar los dos ojos con agua corriente abundante durante 
15 minutos como mínimo en una ducha de ojos o con solución fisiológica. Es necesario 
mantener los ojos abiertos con la ayuda de los dedos para facilitar el lavado debajo de los 
párpados. Es necesario recibir asistencia médica, por pequeña que parezca la lesión. 
7. Actuación en caso de ingestión de productos químicos. 
Antes de cualquier actuación concreta pide asistencia médica. Si el paciente está inconsciente, 
ponerlo en posición inclinada, con la cabeza de lado. Si está consciente, mantenerlo apoyado. 
No dejarlo sólo. No provocar el vómito si el producto ingerido es corrosivo. 
8. Actuación en caso de inhalación de productos químicos. 
Identificar el vapor tóxico. Si se trata de un gas, utilizar el tipo adecuado de máscara para 
gases durante el tiempo que dure el rescate del accidentado. No arriesgarse. Conducir 
28 
 
inmediatamente la persona afectada a un sitio con aire fresco. Requiere asistencia médica lo 
antes posible. Ante el primer síntoma de dificultad respiratoria, iniciar la respiración artificial 
boca a boca. 
 
INCENDIOS 
 
1. Fuego en el laboratorio. 
Mantenga la calma. 
Informe al docente responsable. 
Se dará aviso inmediatamente al Departamento de Bienestar Universitario (Int. 126) 
Informando el lugar y las características del siniestro. 
2. Fuegos pequeños 
Si el fuego es pequeño y localizado, y sabe utilizar un extintor, trate de apagarlo utilizando un 
extintor adecuado, arena, o cubriendo el fuego con un recipiente de tamaño adecuado que lo 
ahogue. 
Retirar los productos químicos inflamables que estén cerca del fuego. 
No utilices nunca agua para extinguir un fuego provocado por la inflamación de un 
solvente. 
3. Fuegos grandes 
Si el fuego es de consideración, no se arriesgue y manteniendo la calma ponga en marcha el 
plan de evacuación. 
Apague los equipos eléctricos y cierre las llaves de gas y ventanas. 
Acate las indicaciones de los brigadistas. 
Evacue la zona por la ruta asignada. 
No corra, camine rápido, cerrando a su paso la mayor cantidad de puertas. No utilice 
ascensores. Descienda siempre que sea posible. 
No lleve consigo objetos, pueden entorpecer su salida. 
Si pudo salir por ninguna causa vuelva a entrar. Deje que los equipos especializados se 
encarguen. 
 
DERRAME MAYORES DE PRODUCTOS QUÍMICOS 
 
 Avise al Departamento de Bienestar Universitario (Int. 126) 
 Atender a cualquier persona que pueda haber sido afectada. 
 Notificar a las personas que se encuentren en las áreas cercanas acerca del derrame. Buscar 
los elementos en el Gabinete para contener derrames. 
 Coloque la cinta de demarcación para advertir el peligro. 
 Evacuar a toda persona no esencial del área del derrame. 
 Si el derrame es de material inflamable, apagar las fuentes de ignición, y las fuentes de 
calor. 
 Evite respirar los vapores del material derramado, si es necesario utilizar una máscara 
respiratoria con filtros apropiados al tipo de derrame. 
 Ventilar la zona. 
29 
 
 Utilizar los elementos de protección personal tales como equipos de ropa resistente a 
ácidos, bases y solventes orgánicos y guantes. 
 Confinar o contener el derrame, evitando que se extienda. Para ello extender los cordones 
en el contorno del derrame. 
 Luego absorber con los paños sobre el derrame. 
 Deje actuar y luego recoger con pala y colocar el residuo en la bolsa roja (patogénicos) o 
negra (peligrosos) y 
 ciérrela. 
 Si el derrame es de algún elemento muy volátil deje dentro de la campana hasta que se lo 
retire para su disposición. 
 Disponer la bolsa con los residuos (consultar a la división de limpieza y mantenimiento, 
int. 153). 
 Lave el área del derrame con agua y jabón. Seque bien. 
 Cuidadosamente retire y limpie todos los elementos que puedan haber sido salpicados por 
el derrame. 
 Lave los guantes, la máscara y ropa. 
 
 
Fecha: 
DECLARO HABER LEÍDO LAS REGLAS BÁSICAS DE HIGIENE Y SEGURIDAD 
EN LOS LABORATORIOS DE QUÍMICA Y BIOLOGÍA, ADEMÁS DE LOS 
PROCEDIMIENTOS ANTE EMERGENCIAS QUE APARECEN EN LA GUÍA DE 
TRABAJOS PRÁCTICOS DE LA MATERIA: BIOLOGÍA. 
Turno de Laboratorio: 
Firma: 
Aclaración: 
L.U. Nº: