ANALISISADN

Vista previa del material en texto

1
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA
SECCION DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN
ESPECIALIDAD EN MEDICINA FORENSE
ANÁLISIS DE ADN EN MUESTRAS DE CADÁVERES
MEDIANTE AMPLIFICACIÓN DE SECUENCIAS STR
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL DIPLOMA DE:
ESPECIALIDAD EN MEDICINA FORENSE
PRESENTA:
MARIBEL GUTIÉRREZ PÉREZ
MÉXICO, D.F., ENERO DEL 2009
3
4
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA
ANÁLISIS DE ADN EN MUESTRAS DE CADÁVERES MEDIANTE
AMPLIFICACIÓN DE SECUENCIAS STR
Este trabajo se realizò en el laboratorio de Biología Molecular e Inmunología del
Depto. de Bioquimica de la Escuela Superior de Medicina del Instituto Politécnico
Nacional, con la colaboración conjunta del Servicio Medico Forense (SEMEFO)
del Distrito Federal, bajo la dirección del Dr. Leobardo Mendoza Alcantar y del Dr.
Eleazar Lara Padilla.
5
II. AGRADECIMIENTO
Se agradece a la Secretaria de Investigación y Posgrado del Instituto Politecnico
Nacional y al área de investigación del Servicio Medico Forense del Distrito
Federal por brindarme la oportunidad de realizar este trabajo de tesis y por el
apoyo prestado en todo mi periodo de investigación.
6
AGRADECIMIENTOS ESPECIALES
Expreso mi sincero y cordial agradecimiento:
Al Dr. Eleazar Lara Padilla, por el apoyo incondicional brindado durante mi
formación en la especialidad en Medicina forense.
Al M. en C. Israel López Reyes por tener la paciencia y dedicación para brindarme
de su tiempo y su sabiduría.
Al Dr. Angel Miliar García por su colaboración y apoyo para la realización de PCR
en tiempo real.
A Alejandro e Israel por apoyo incondicional y su amistad.
A cada de uno de mis sinodales por sus atinadas observaciones durante la
revisión del presente trabajo de tesis.
7
DEDICATORIA
A
Maria Isabel y Gustavo
Mis hijos.
Gamaliel
Mi esposo y amigo.
Dios
Mi apoyo y guía.
8
III. INDICE
I. Titulo……………………………………………………………… 2
II. Agradecimiento…………………………………………………… 5
III. Índice……………………………………………………………… 8
IV. Glosario…………………………………………………………… 9
V. Relación de Tablas, Figuras y Gráficas………………………… 12
VI. Resumen…………………………………………………………… 13
VII. Summary…………………………………………………………… 14
VIII. Introducción………………………………………………………… 15
IX. Marco teórico……………………………………………………… 19
X. Antecedentes……………………………………………………… 23
XI. Planteamiento y justificación del problema……………………… 26
XII. Objetivos…………………………………………………………… 27
A. Objetivo general………………………………………………… 27
B. Objetivos particulares…………………………………………… 27
XIII. Material y Métodos………………………………………………… 28
XIV. Resultados ………………………………………………………… 31
XV. Discusión………………………………………………………… 35
XV. Conclusiones……………………………………………………… 36
XVI. Bibliografía………………………………………………………… 37
XVII. Anexos …………………………………………………………… 41
9
IV. GLOSARIO
DNA: Macromolécula que normalmente está formada por cadenas polinucleóticas
antiparalelas unidas por puentes de hidrógeno, en la que el residuo de azúcar es
la desoxirribosa. Es la principal molécula que contiene información genética.
ALELO: Uno de los posibles estados mutacionales de un gen, diferente de otros
alelos por sus efectos fenotípicos.
AMPLÍMEROS: Secuencias cortas de nucleótidos que en presencia de una ADN
polimerasa termorresistente y de precursores de ADN (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
pueden iniciar la síntesis de nuevas cadenas de ADN complementarias a cada
cadena individual de ADN blanco.
AUTOSOMA: Cromosomas diferentes de los sexuales. En la especie humana hay
22 pares de autosomas.
CROMOSOMA: En procariotas, molécula de ADN intacta que constituye el
genoma; en eucariotas molécula de ADN acomplejada con RNA y proteínas para
formar una estructura filamentosa en donde se encuentra la información genética
dispuesta en secuencia lineal.
CROMOSOMAS HOMÓLOGOS: Cromosomas que se emparejan o sufren
sinapsis en la meiosis.
Cromosomas que son idénticos respecto de la situación de sus loci y del
centrómero.
CROMOSOMA-Y: Cromosoma sexual en especies en donde el macho es el sexo
heterogamético (XY).
CROMOSOMA SEXUAL: Cromosoma como el X y el Y de la especie humana,
implicado en la determinación del sexo.
DELECIÓN: Mutación cromosómica que implica la pérdida o deleción de material
cromosómico.
DERIVA GENÉTICA: Variación aleatoria de la frecuencia génica de generación en
generación. Se observa más a menudo en poblaciones pequeñas.
ELECTROFORÉSIS: Técnica utilizada para separar una mezcla de moléculas por
su migración diferencial en una fase estacionaria sometida a un campo eléctrico.
10
FENOTIPO: Propiedades observables de un organismo controladas
genéticamente.
GEN: Unidad física fundamental de la herencia cuya existencia se puede
confirmar por variantes alélicas y que ocupa un locus cromosómico concreto.
Secuencia de ADN que codifica para un polipéptido.
GENOTIPO: Alelo concreto o constitución genética de un organismo; a menudo, la
composición alélica de uno o de un número limitado de genes sujetos a
investigación.
GENOMA: Conjunto de genes que lleva un organismo.
HLA: Proteínas de la superficie celular, producidas por los loci de
histocompatibilidad, que están implicadas en la aceptación y el rechazo de injertos
y de transplantes de tejidos y de órganos.
HAPLOIDE: Numero de cromosomas no emparejados en un tipo de célula.
HAPLOTIPO: Grupo de alelos de loci íntimamente ligados que se encuentran en
un individuo y normalmente se heredan como una unidad.
LOCUS: Región de un cromosoma en donde se localiza un gen dado. Plural: loci.
MUTACIÓN: Proceso que da lugar a la alteración del ADN o de la estructura del
cromosoma. Origen de la mayoría de alelos.
NUCLEÓTIDO: Nucleósido unido convalentemente a un grupo fosfato, los
nucleótidos son las piezas de construcción básicas de los ácidos nucléicos. Los
nucleótidos que normalmente se encuentran en el ADN son el ácido desoxitidílico,
desoxiguanílico y el ácido desoxiadenilico. Los nucleótidos del RNA son el ácido
citidílico, ácido guanílico, ácido uridílico y el acido adenilico.
NUCLEÓSIDO: es una molécula monomérica orgánica que integra las
macromoléculas de ácidos nucleicos que resultan de la unión covalente entre una
base heterocíclica con una pentosa que puede ser ribosa o desoxirribosa.
Ejemplos de nucleósidos son la citidina, uridina, adenosina, guanosina, timidina e
la inosina.
PCR: (del inglés Polymerase Chain Reaction) Reacción en cadena de la
polimerasa. Método para amplificar segmentos de ADN que utiliza ciclos de
11
desnaturalización, de emparejamiento a cebadores y de síntesis de ADN dirigida
por la ADN polimerasa.
POLIMERASAS: Enzimas que catalizan la formación de ADN y de ARN a partir de
desoxirribonucleótidos y de ribonucleótidos, respectivamente.
POLIMORFISMO: Existencia de dos o más fenotipos discontinuos que segregan
en una población.
POLIMORFISMO CROMOSÓMICO: Estructuras u ordenaciones alternativas de
un cromosoma que se encuentran en los miembros de una población.
RECOMBINACIÓN: Proceso que da lugar a la formación de nuevas
combinaciones génicas en los cromosomas.
12
RELACION DE TABLAS, FIGURAS Y GRAFICAS
Figura 1. Gel de Agarosa al 1% con la demostración de ADN genómico de las
muestras de tejido múscular de cadáveres. Pág. 28
Fig 2. Gel de Agarosa al 1%de ADN genómico de las muestras de tejido muscular
de cadáveres. Pág. 28
Figura 3. Productos de PCR vistos en gel de agarosa al 1% en el cual se muestra
la presencia de β-actina de 437 pb. Pág. 29
Fig 4. Productos de PCR vistos en gel de agarosa al 1% de β-actina.
Pág. 29
Figura 5. Gel de Agarosa al 3% teñido con BrEt en donde se visualizan los
productos de PCR de las muestras con β-actina de 437 pb la numero 3,5, 7 y la
amplificación de un fragmento de 161-181 pb del repetido STR A7.1.
Pág. 30
13
VI. RESUMEN
La tecnología de investigación de personas a través de su huella genética ha sido
relevante para poder descubrir lo que se encuentra en el genoma humano,
aplicado a las ciencias forenses. Parte de esta metodología utilizadapara describir
la huella genética, son los STRs los cuales son secuencias cortas de repetición en
tandem, formadas por dos a cinco pares de bases, repetidas un número variable
de veces en cada individuo. En este trabajo nos propusimos como objetivo iniciar
la estandarización de la amplificación de secuencias STRs en muestras de tejido
muscular de cadáveres con la finalidad de demostrar su reproducibilidad y lograr
así la obtención de perfiles genéticos para su uso en la medicina forense útiles
para la identificación. Para esto, utilizamos muestras de tejido muscular de
cadáveres en su mayoria hombres, realizándose extracción de ADN genómico,
electroforesis en geles de agarosa y poliacrilamida y amplificación de secuencias
STRs por medio de la técnica de PCR. Los resultados obtenidos muestran que
logramos la amplificación del STRs denominado Y-GATA A 7.1 en al menos dos
muestras de varón que son exclusivas de cromosoma Y. Como control negativo
utilizamos muestras de mujer. Además, como control interno amplificamos un
fragmento del gen de la β-actina humana. Con estos resultados podemos sugerir
que es posible utilizar secuencias STRs para la obtención de perfiles genéticos,
que puedan ser utilizados en la identificación de personas desconocidas a partir
de una muestra de tejido. Cabe mencionar que este trabajo podría dar inicio a la
creación de una base de datos de la población mexicana a partir de cadáveres.
14
VII. SUMMARY
The technology of investigation of people through its genetic track has been
excellent to be able to discover what it is in the human genome, applied to forensic
sciences. Part of this used methodology to describe the genetic track, is the STRs
which are short sequences of repetition in tandem, formed by two to five pairs of
bases, repeated a variable number of times in each individual. In this work we
seted out as objective to initiate the standardization of the amplification of STRs
sequences in muscular corpse weave samples in order to demonstrate its
reproducibility and to obtain therefore the obtaining of genetic profiles for its use in
the forensic medicine useful for the identification. For this, we used corpse weave
samples muscular in its majority men, being realised genomic DNA extraction, gel
electrophoresis of agarosa and poliacrilamida and amplification of STRs
sequences by means of the PCR technique. The obtained results show that we
obtained the amplification of denominated STRs Y-GATA To 7.1 in at least two
samples of man that are exclusive of chromosome and. As negative control we
used woman samples. In addition, as internal control we amplified a fragment of
the gene of the human β-actina. With these results we can suggest is possible to
use STRs sequences for the obtaining of genetic profiles, that can be used in the
identification of people unknown from a weave sample. It is possible to mention
that this work could give beginning to the creation of a data base of the Mexican
population from corpses.
15
VIII. INTRODUCCIÓN
La unidad básica de la vida es la célula (1), ésta pequeña fábrica miniatura
produce la materia prima, la energía y la capacidad requerida para sustentar la
vida. El DNA contenido en el núcleo celular posee la información necesaria para
transmitirla de generación en generación y tiene dos funciones primordiales: hacer
copias de sí mismo de manera que las células se puedan dividir y llevar la misma
información y contener los elementos para sintetizar las proteínas que realizan
todas las funciones que realizan las células.
En 1953, Watson y Crick (2) propusieron el modelo de la estructura del DNA
como una doble hélice, dispuesta como una escalera de caracol. Los dos lados de
la escalera están compuestos por subunidades repetidas de desoxirribosas
(azúcar de 5 carbonos) unidas entre sí por un enlace fosfodiester entre el extremo
5´OH de un azúcar, con el extremo 3´OH del siguiente azúcar. Los “peldaños”
están formados por bases nitrogenadas unidas al carbono uno de cada
desoxirribosa por un enlace glicosídico y apareadas entre sí, cada par constituido
por una base de purina y una base de pirimidina. En el DNA hay cuatro bases:
adenina (A), guanina (G), timina (T) y citosina (C), las dos primeras son purinas y
las últimas pirimidinas. Una de las características (3) más importantes del DNA es
la complementaridad de las bases, es decir (A) puede aparearse solamente con la
(T) y la (G) sólo con la (C). Los pares de bases (pb) están unidos por puentes de
hidrógeno. La importancia de los nucleótidos (conformada por la base nitrogenada,
la desoxirribosa y el fosfato) radica en el almacenamiento de la información
biológica y constituyen los elementos de construcción de los ácidos nucleicos, que
son largos polímeros en los que las subunidades de nucleótidos están unidas
covalentemente gracias a la formación de un enlace éster entre el grupo hidroxilo
3’ del residuo de azúcar de un nucleótido y el grupo fosfato 5’ del nucleótido
siguiente. Existen dos tipos principales de ácidos nucleicos que se diferencian en
el tipo de azúcar de su esqueleto. Los que se basan en la desoxirribosa, se
denominan ácidos desoxirribonucleicos, o DNA y contienen las bases A, T, G y C
y los que se basan en la ribosa y reciben el nombre de ARN que contienen uracilo
(U) en lugar de timina. La secuencia de las bases de un polímero de DNA
16
representa la información genética de la célula viva. La capacidad de las bases de
diferentes moléculas de ácidos nucleicos para reconocerse unas a otras mediante
interacciones no covalentes (denominadas apareamiento de bases) –G con C y A
con T o con U- constituyen la base de toda la herencia y la evolución. El DNA
contiene toda la información necesaria para constituir un individuo completo.
Todos los seres vivos tienen como portador de la información genética al DNA y
es el mismo en todas las células del individuo, es decir, el DNA de un hombre es
el mismo en su sangre, en sus células de la piel, en su semen o en su saliva.
La tecnología de identificación de personas por medio del DNA se basa en las
diferencias individuales. Los polimorfismos del DNA tienen un patrón inconfundible
para cada ser humano. Las características particulares y únicas del DNA de cada
individuo hacen posible la identificación inequívoca de todas las personas que
viven y de las que han existido y hay restos mortales de ellas para extraer DNA.
Las diferencias individuales se representan como bandas paralelas en distintas
posiciones, de manera semejante a los códigos de barras de los artículos de las
tiendas. Al patrón que se obtiene se le llama “huella genética” (DNA fingerprinting,
en inglés). Si dos muestras de DNA presentan la misma huella genética, se puede
afirmar con altas probabilidades que pertenecen a la misma persona.
En la actualidad es posible la resolución de casos forenses con más eficacia en
los cuales, no se encontraba fácilmente al agresor o en aquellos casos de
desastres masivos en que los cuerpos quedaban en calidad de desconocidos, en
raptos, o en casos de comprobación de paternidad (4). El método de identificación
por las huellas del DNA es tan eficiente y seguro como el de las huellas digitales,
con la ventaja de que se usa una cantidad mínima de muestra. Un cabello, una
gota de sangre, de saliva o de semen es suficiente para identificar con certeza a
un individuo. Sobre todo porque la metodología de Reacción en cadena de la
polimerasa o PCR (del inglés Polymerase Chain Reaction) permite amplificar la
muestra millones de veces. En la investigación forense, el ADN se obtiene de
muestras muy pequeñas de saliva (un beso, una mordida, un cigarro, dejan
rastros), de semen, de fluido vaginal, de sangre, de cabellos, de pedazos de uña,
de piel que se queda entre las uñas por un rasguño, etc. Hasta del material que
17
hay en un anillo o en unos aretes podría obtenerse ADN de la persona que los
uso. Esta tecnología también se usa con restosde tejidos de cadáveres.
En este trabajo de investigación con el apoyo del Servicio Medico Forense
(SEMEFO) se tuvo como proposito iniciar la realización de una base de datos, a
partir de perfiles genéticos de cadáveres desconocidos y conocidos en las cuales
se pueda demostrar su identidad utilizando técnicas apropiadas para el análisis
del ADN como son las secuencias cortas en tandem o STR (del ingles Short
Tandem Repeat) (5). Esta tecnología denominada huella digital de ADN se basa
en la caracterización de regiones variables o polimórficas del material genético de
los individuos. Actualmente el uso de los STRs ha demostrado su utilidad en la
medicina legal en otros países (6). A partir de estos marcadores se han realizado
investigaciones en el cromosoma Y, el cual posee un gran potencial para
identificar varones y líneas paternas (7) de manera confiable en pruebas forenses
y de paternidad. En nuestro país no se cuenta con una base de datos de perfiles
genéticos de la población mexicana, que podria ser usada en la identificación de
aquellas personas desconocidas que se encuentran sin identidad. Para ello es
posible el uso de ciertas técnicas empleadas en genética para la identificación de
individuos a través de una base para el análisis de los polimorfismos del ADN (8),
en tres áreas:
1.- Identificación de personas desaparecidas.
2.- Investigación de la paternidad, tanto desde el punto de vista de la reclamación
como de la impugnación.
3.- Criminalistica, el análisis de restos orgánicos como cabellos, semen, saliva,
sangre, etc. que se encuentren en la escena de un crimen o de un delito sexual.
Nuestro trabajo se centra en la identificación de cadáveres por medio de un
estudio genético. Cuando por métodos internacionales de identificación no es
posible establecer su identidad (antropológicos, odontológicos, etc.), se puede
recurrir a este método como complemento o como vía única posible de saber
quien era esa persona.
Se han producido importantes avances en el campo de la biología molecular y en
concreto en su aplicación en el campo de la genética forense, con lo cual en la
18
actualidad es posible resolver casos de identificación, cada día más complejos, a
través de análisis más detallados y mejorados. Incluso los procesos que van
desde la toma de muestra y su tratamiento para la obtención de perfiles genéticos
han sido más rigurosos.
19
IX. MARCO TEÓRICO
En 1974 (21) fue publicado un artículo llamado "Exclusión de paternidad: el estado
actual del arte". Veinte años después, ya la prueba de paternidad se había
convertido en una ciencia, mediante la utilización de polimorfismos genéticos.
Inicialmente, los científicos forenses usaban los marcadores genéticos como los
grupos sanguíneos (22) y las proteínas para "excluir" o "incluir" a un acusado de
entre los individuos que podrían haber sido padres potenciales, y por tanto fuentes
de evidencia. Pero, según su poder discriminatorio poblacional los grupos
sanguíneos y las proteínas son considerados poco informativos. Estos marcadores
genéticos "clásicos" solo permitían dilucidar alrededor de un 75% de los casos
corrientes de paternidad, lo cual nos da una idea de la limitada eficacia de este
sistema de marcadores. En este contexto, una "inclusión" podía significar
teóricamente, tanto una paternidad verdadera, como una incapacidad técnica para
excluir a un inocente. Está última situación, teóricamente, se podía presentar en
25 de cada 100 casos, a pesar de que en los casos de paternidad se cuenta con
abundante sangre fresca de la madre, su hijo y del presunto padre. La situación
era mucho peor en los casos forenses, ya que las muestras biológicas son
escasas, y pueden estar contaminadas o severamente deterioradas por el
ambiente, por lo que resultan ser técnicamente mucho más difíciles. Incluso el
análisis de los grupos sanguíneos aportaba alguna información de utilidad en
apenas el 13% de los casos. Por el contrario, mediante la utilización de
marcadores genéticos de DNA las disputas de paternidad, y los casos forenses
pueden ser resueltas con certeza en virtualmente cada caso, razón por la cual los
grupos sanguíneos fueron rápidamente substituidos por las pruebas de DNA en
Europa, Norte América, y una larga lista de países del mundo. Analizando un
determinado número de regiones polimórficas, la probabilidad de que dos
individuos sean genéticamente iguales es prácticamente nula (excepto en el caso
de gemelos univitelinos). Aunque la ciencia poseía las herramientas necesarias
para el estudio del ADN, su aplicación en la resolución de casos judiciales no se
produjo hasta 1985, cuando el Ministerio del Interior Británico solicitó la ayuda de
Alec J. Jeffreys, (23) profesor de Genética de la Universidad de Leicester. Los
20
primeros casos de Criminalística fueron resueltos gracias a la técnica de los
Fragmentos de restricción de longitud polimórfica ó RFLPs (del ingles Restriction
Fragment Length Polymorphisms), Jeffreys descubrió la existencia de unas
regiones minisatélites hipervariables dispersas por el genoma humano que al ser
tratadas con enzimas de restricción generaban fragmentos de longitud variable.
Estudios posteriores realizados por el mismo Jeffreys demostraron que las
diferencias en el tamaño de estos fragmentos se debían a que estas regiones
consistían en un determinado número de repeticiones en tándem de una
secuencia central, el cual variaba de unos individuos a otros.
El primer locus de DNA polimórfico fue descubierto por Wyman y White en 1980
usando una sonda de DNA arbitraria (24). De esta manera observaron fragmentos
de más de 15 longitudes diferentes en una pequeña muestra de individuos.
Posteriormente se encontraron otros loci hipervariables (25) como en la secuencia
del gen de la insulina humana, en el oncogen “ras”, en el pseudogen de la zeta-
globina y en el gen de la mioglobina. Estos loci hipervariables constaban de
repeticiones en tándem de una secuencia de oligonucleótidos (11 a 60 pb), de
manera que las diferentes longitudes de los fragmentos originados dependían del
número de dichas repeticiones y se les denominó VNTR (del inglés Variable
Number of Tandem Repeat). Tras el descubrimiento de los primeros VNTRs se vio
que éstos podían ser aplicados a la medicina forense y sustituir a los marcadores
clásicos. Otras regiones en el genoma poseen secuencias repetidas aún más
pequeñas: Son los microsatélites o secuencias cortas de repetición en tandem
(STR por sus siglas en ingles, Short Tandem Repeats), son regiones de ADN
repetitivo que se encuentran repetidas a lo largo de todo el genoma, existiendo,
como media, un microsatélite por cada 5000-10000 pares de bases y están
compuestos por una secuencia de 2-7 pares de bases que se repite en tandem.
Un gran número de estas regiones STR presenta un alto grado de polimorfismo
genético de longitud cuya base molecular es la variación en el número de
unidades de repetición. El alto grado de polimorfismo de algunas de estas
pequeñas regiones del genoma (100-400 pares de bases), la posibilidad de
analizarse mediante técnicas de biología molecular de muy alta sensibilidad como
21
la PCR (incluso es posible a partir de muestras antiguas que contienen ADN en
un avanzado estado de degradación) y la posibilidad de realizar una tipificación
genética de alta resolución que permite una asignación inequívoca de los alelos,
son las razones fundamentales que han convertido a estos marcadores genéticos
en los más utilizados en la actualidad en el campo de la genética forense. La
amplificación y caracterización de los STRs ha seguido una evolución paralela.
Cuando se comenzó a usar la técnica de PCR, se analizaban de forma individual
con reacciones simples de amplificación y del mismo modo su caracterización se
realizaba de forma individual en geles de poliacrilamida en condiciones
desnaturalizantes y tinción con nitrato de plata. Con posterioridad, se amplificaban
en reacciones múltiplesSTRs que no solapasen en tamaño (2, 3 ó 4 loci
simultáneamente) debido a que la caracterización se realizaba de la misma forma.
Actualmente, se amplifican hasta 16 loci en la misma reacción, gracias al marcaje
de uno de los oligonucleótidos en el extremo 5’ con fluorocromos, lo que permite
mezclar en la reacción de amplificación y caracterizar STRs que tengan el mismo
tamaño, puesto que los que coinciden se marcan con fluorocromos que emiten a
distinta longitud de onda y por tanto se detectan con un color distinto. Esta
tecnología permite que la caracterización de productos se realice mediante un
análisis automatizado que convierte en alelos los picos que detecta en función de
su movilidad asignándoles un tamaño, gracias a la incorporación de un estándar
interno con fragmentos de longitud conocida. En cuanto a los STRs de cromosoma
Y, en la actualidad se realiza una amplificación simultánea de 12 STRs, con lo que
se ha aumentado de una forma considerable el poder de discriminación de la
técnica al contar con un número considerable de marcadores, son muy útiles en la
resolución de casos en los que únicamente se dispone de parientes por vía
paterna como muestras de referencia, debido a su herencia paterna. En otros
casos de identificación genética cuando el caso se trate de una mujer podemos
utilizar fragmentos del DNA mt , ya que en ocasiones se trata del único DNA que
puede recuperarse de forma reproducible fundamentándose que el DNA mt es un
genoma circular pequeño de 16559 pares de bases que, en contraposición al
genoma nuclear, se encuentra en gran número de copias (100-1000 copias por
22
célula) y que debido a su compartimentación dentro de la célula y a su propia
estructura circular podría estar mas protegido de la acción destructiva de las
nucleasas. Su herencia exclusivamente materna hace que el DNA mt sea un
marcador ideal para estudios en los que sólo se disponga de la línea materna
usándose la región no codificante de aproximadamente 1100 pares de bases
conocida como región de control que contiene el origen de replicación de la
cadena pesada y los dos promotores de la trascripción lo cual representa una alta
tasa de mutación y por tanto una gran variabilidad de secuenciación entre los
individuos.
23
X. ANTECEDENTES
El descubrimiento en 1980 de los polimorfismos del DNA en el genoma humano y
su variabilidad, los cuales se encuentran distribuido en diferentes poblaciones
humanas, permitió que científicos forenses reconocieran el uso del DNA para la
identificación de criminales en muestras encontradas en la escena del crimen. En
países como Inglaterra y E.U.A (9) es aceptable en las litigaciones criminales y
civiles. A los finales de los 80 se reportó por primera vez la amplificación de ADN
proveniente de huesos antiguos y se desarrolló el estudio del DNA mt. A partir de
su secuenciación se logró el desarrollo de la tecnología de DNA antiguo y
degradado (10, 11).
Así que en los restos cadavéricos en buen estado de conservación la toma de
muestra se realiza inmediatamente después de la muerte (12), las muestras más
adecuadas son sangre y/o músculo. Con esto la obtención de DNA en buen
estado de conservación de estas muestras no suele representar un problema.
El uso de la metodología de PCR (13) para la caracterización del DNA humano ha
proporcionado una herramienta en los análisis forenses y de paternidad.
Sin embargo, los marcadores genéticos que pueden ser útiles en la identificación
de individuos, deben tener un gran poder de discriminación o capacidad de
distinguir entre dos individuos (variación genotípica). Así, entre más alelos tenga
un marcador genético (mayor polimorfismo) más uniforme será su distribución
entre la población (mayor heterocigosidad), lo que significa que tendrá mayor
poder de discriminación (7).
Gracias a que este método se puede utilizar para localizar en los varones la
región no seudoautosomica del cromosoma Y, ya que no recombina, la
combinación alélica de diferentes marcadores polimorficos, conocidos como
haplotipos, se pasan de padre a hijo sin cambios. Esto ha permitido clarificar
casos especiales en medicina forense (14) debido a que la mayoría de los
crímenes son causados por hombres: Los casos de violación en donde hay
mezclas de muestras de hombre o de mujer, raptos o indagación de un
perpetrador. La identificación se realiza a través del DNA mt, usando como
muestras de referencia a parientes que compartan la línea materna. En varones se
24
realiza a través del DNA del cromosoma Y usando como muestras de referencia a
parientes que compartan la línea paterna. Aproximadamente un 18-20% de los
casos de identificación se han resuelto mediante algunas de estas estrategias.
La utilización de esta metodología en poblaciones donde no se cuenta con una
base de datos de las frecuencias alélicas y genotípicas, ha suscitado
controversias, especialmente cuando coincide el patrón genético de una muestra
biológica de la evidencia de un crimen y la del sospechoso: esto ocurre cuando no
se conoce la probabilidad de coincidencia al azar (PCA) entre dos individuos de
una población (7). Este es el problema principal y el punto de controversia en los
casos legales, y su resolución requiere de la aplicación de los métodos de la
genética de población.
Actualmente es posible detectar varios marcadores genéticos mediante de kits
comerciales, lo que ha facilitado su estudio. Por esta circunstancia los marcadores
genéticos HLA-DQA1, LDLR, GYPA, HBGG, D7S8 y GC y D1S80 (10) han sido
estudiadas en poblaciones de paises como: Bolivia, Brasil, Argentina, Chile, Costa
rica, España, Nicaragua, Perú, El salvador, Portugal, Australia, Chipre, Croacia,
Emiratos árabes, Estados unidos, China, Italia, Guam, Japón, Jordania, Malasia,
Paquistán, Qatar, Suiza, Suecia, Turquía, Tailandia, Zimbabwe, India. Estos
marcadores han tenido buena aceptación, sin embargo se pretende la substitución
de estos por marcadores STRs. Las normas internacionales promovidas por la
sociedad internacional de genética forense (15) exigen la existencia y publicación
de datos nacionales que sustenten los análisis bioestadísticos en aquellos casos
en que no se logra encontrar una exclusión, tanto en las investigaciones biológicas
de paternidad como en los análisis de vestigios biológicos de interés criminalístico.
Por lo que un proyecto de ADN en forma de base de datos requiere del
conocimiento detallado de la estructura genética de la población. Las bases de
datos genéticos (16) en su comienzo se crearon con el propósito de mantener una
ficha de identificación de un criminal o de un convicto así tenemos algunos
ejemplos de la creación de bases de datos. La primera base Internacional fue
creada en el Reino Unido en abril de 1995 a partir de toma de muestras a los
criminales en los reclusorios. La segunda en Nueva Zelanda (17) en donde se
25
realizaba a los infractores menores y a los criminales, a aquellos que podían
demostrar su inocencia se les podía retirar de la base. En Francia se creo una
base en 1998, originalmente prevista únicamente para ofensores sexuales. En
Inglaterra, en la región de Wales se realiza en cualquier persona arrestada la
toma de muestra para integrarse a una base de datos; En Escocia la ley es
diferente, ya que si la persona arrestada es absuelta se le quita de la base da
datos. En Suecia solo los criminales que han permanecido 2 años en prisión son
registrados en un base de datos. En Noruega y Alemania se registran los
convictos más peligrosos. Los 50 estados de los Estados Unidos de America
guardan archivos de ofensores violentos y guardan pocos de sospechosos.
Portugal ha planeado la introducción de su base de datos, aun sin llevarse a cabo.
En los Estados Unidos de America su base de datos se denomina “CODIS” (18) la
que es utilizada por el FBI desde el año 1990 el cual contiene 2 índices o listado
de perfiles genéticos: El primero es un índice de convictos y el segundo es uníndice forense. El cual se registra el material biológico que se encuentra en
escenas del crimen. En España se cuenta con el programa “Phoenix” (19)siendo
este que desde 1999 fue el primer país que oficialmente contribuyó en un
programa nacional para la identificación de cadáveres y restos humanos en los
que no se lograba su identificación por técnicas tradicionales forenses. Para ello
se usó haciendo uso el DNA mt. En Costa rica en 1993 se implemento el
“Proyecto de DNA” (10) para la identificación de personal en casos criminalísticos
y de paternidad. En México el uso de las pruebas de DNA comenzó su aplicación
a fines del gobierno de Ernesto Zedillo (20) en 1999, en la Procuraduría General
de la Republica (PGR), utilizando como base al sistema “CODIS” empleado en
Europa y en Estados Unidos. Sin embargo en nuestro país no se cuenta con una
base de datos que contenga los perfiles genéticos de la población. Algunos
autores han realizado estudios en población mexicana con el fin de encontrar su
diversidad genética mediante el uso de STRs y VNTRs (7, 8) Especificamente
estudios del cromosoma Y, encontrándose que los mestizos constituyen mas del
90% de la población mexicana generada por la mezcla con población europea
durante la conquista ocasionando su distribución en regiones urbanas y rurales a
26
lo largo del país. Esto significa que la diversidad genética de nuestra población es
bastante alta y que estos marcadores se pueden utilizar en problemas legales y en
casos de paternidad.
PLANTEAMIENTO Y JUSTIFICACION
El mayor problema de esta investigación es que no se cuenta con un perfil
genético de un individuo conocido a través del reconocimiento de un familiar que
haya dado una muestra de saliva o sangre para la confirmación de su parentesco.
Sin embargo, será de utilidad contar con el perfil genético de cadáveres
desconocidos a través la extracción de su DNA con el cual realizar pruebas que
nos conlleven a la generación de una base de datos de perfiles genéticos de la
población mexicana que pueda ser utilizada para la ubicación e identificación de
personas.
En el Distrito Federal se cuenta con un laboratorio de Genética por parte de la
PGR que es utilizado en casos relevantes en la búsqueda de personas
desconocidas, aún así no se ha logrado tener el perfil genético ya sea de
delincuentes o de cadáveres. El SEMEFO aplica las normas internacionales para
el reconocimiento de una persona a través de un sistema de búsqueda por
fotografías, antropología y odontología, con el cual han llegado a tener la
identificación de algunos cadáveres con el 60% de certeza. Nuestra propuesta es
usar técnicas de biología molecular empleando STRs como marcadores con el fin
de obtener el perfil genético de todos los cadáveres que ingresen a esta
institución. En otros países se cuenta con esta tecnología demostrando
versatilidad y facilidad de uso.
Si nuestra propuesta es aceptable, lo más conveniente seria tomar una muestra
de sangre o de saliva de las personas que están realizando una búsqueda de
algún familiar, se analiza y se archiva este perfil, con la finalidad de poder hacer
un rastreo de la persona desconocida, basándose en los perfiles de cadáveres
que ya se tengan.
27
XII. OBJETIVOS
A. GENERAL
Estandarizar la técnica de PCR para la amplificación de secuencias STRs a partir
del DNA del músculo de cadáveres, con la finalidad de iniciar una base de datos
que permita la identificación de individuos.
B. PARTICULARES
1.- Obtener el DNA genómico de muestras de cadáveres
2.- Realizar ensayos de electroforésis en geles de agarosa y poliacrilamida.
3.- Estandarizar la amplificación de algunos STR`s mediante la técnica de reacción
de la cadena de la polimerasa.
28
XIII. MATERIALES Y METODOS
1.- Obtención del tejido:
Se seleccionó el cadáver y se colectó tejido muscular de tórax o de pierna. (Éste
se colectó en tubo eppendorf de 1.5 ml tejido muscular de 5-15 µg utilizando hoja
de bisturí y pinzas previamente estériles. Se utilizarón guantes para no contaminar
la muestra y sin tocar la parte interna del tubo se colocó la muestra y se almacenó
en un contenedor con hielo). Al llegar al laboratorio de Biología Molecular las
muestras se congelarón a -70 ºC en el ultracongelador (REVCO).
2.- Extracción de DNA (kit de epicentre):
Se realizó la descongelación del tejido y se colocó en un contenedor con hielo.
Previamente se esterilizó por autoclave una caja de Petri, agua desionizada estéril
y se tuvo calibrado el baño de agua a 65 ºC. Se utilizó el Kit de purificación
completo de DNA de Epicentre (Epicentre, USA). Se Colectó de 1-5 mg de tejido
y se colocó en la caja de Petri y con una hoja de bisturí se procedió a cortar el
tejido en pedazos finos (se utilizò una hoja de bisturí por cada muestra). Se diluyó
1µl de proteinasa K (50 µg/µl) en 300 µl de solución de lisis celular para cada
muestra. Se homogenizó la muestra y se transfirio a un tubo de micro centrifuga.
Se agregaron 300 µl de solución de lisis celular conteniendo la proteinasa K y se
mezcló. Se incubó a 65 ºC por 20 minutos; y se mezcló en vortex invirtiendo cada
5 minutos. Se colocarón las muestras en hielo por 3-5 minutos y entonces se
procedió con la precipitación de ácidos nucleicos descrita en la parte B.
Parte B: Precipitación de ácidos nucleicos totales. Se agregaron 150 µl de reactivo
MPC a 300 µl de muestra lisada y se agitó en vórtex vigorosamente por 10
segundos. Se empastillaron los restos celulares por centrifugación durante 10
minutos a 10,000 x g a 4 ºC en un micro centrifuga. Se transfirió el sobrenadante
a un tubo de micro centrifuga limpio y se desecho lo demas. Se agregaron 500 µl
de isopropanol al sobrenadante y se invirtio el tubo varias veces (30 – 40). Se
obtuvo el DNA por centrifugación fría a 4 ºC por 10 minutos en un micro
centrifuga. Cuidadosamente se desechó el isopropanol sin remover la pastilla de
DNA. Se realizó el lavado con etanol al 80%, y se centrifugo brevemente. Los
29
residuos del etanol se removieron con una pipeta Pasteur. Se resuspendieron los
ácidos nucleicos totales en 40 µl de TE buffer y se almacenaron a -70ºC.
3.- Electroforesis en geles de agarosa:
La integridad del DNA se verificó mediante electroforesis en geles de agarosa al
1% en solución de TAE 1X (40 mM tris acetato, 1mM EDTA [ácido
etilendiaminotetraacético]). Para ello, se mezclaron 2µl de DNA con 1 μl de
solución amortiguadora de carga (azul de bromofenol 0.25%, xilencianol 0.25%,
glicerol 30% en agua bidestilada) y se depositaron en uno de los pozos del gel. La
electroforesis se llevó a cabo a 80 voltios durante 1 hora 30 mins
aproximadamente. Para detectar el DNA, los geles se sumergieron en una
solución de BrEt [bromuro de etidio] (0.5 g/ml) durante dos minutos, se lavaron
con agua destilada y el DNA se visualizó y se tomó registro con el documentador
de imágenes con luz UV (UVP, USA).
4.- Diseño de los oligonucleótidos iniciadores (primers) para amplificar un
fragmento del gen de la β-actina y PCR
La amplificación de un fragmento del gen de β-actina humana se realizó mediante
la reacción de PCR. Para la amplificación, se utilizaron como iniciadores
oligonucleótidos localizados en la secuencia 130-150 pb sentido (5´-ATG, GTG,
GGC, ATG, GGT, CAG, AAG-3´). E iniciadores en antisentido a partir del sitio 566-
546 pb (5´-AGG, TAG, TCA, GTC, AGC, TCC, CGG-3´) del gen de la de β-actina.
Para la PCR se utilizaron 4µL de ADN de la muestra de tejido muscular, 10 mM de
cada dNTP (dATP, dCTP, dTTP y dGTP), solución amortiguadora 5µl, 2 mM de
cloruro de magnesio, 0.5 U de la enzima Taq DNA polimerasa (Invitrogen) y agua
bidestilada en un volumen de 30.5 μl.Para el control negativo no se agregó DNA.
La amplificación se llevó a cabo en un termociclador PCR System 2700 (Applied
Biosystems), utilizando el siguiente programa: desnaturalización inicial a 94 ºC por
5 min, 28 ciclos a 94 ºC por 30 seg, 50 ºC por 1 min y 72 ºC por 1 min y finalmente
se realizóuna extensión adicional a 72 ºC por 7 min. Los productos de PCR se
analizaron en geles de agarosa al 1% en solución de TAE 1X.
30
5.- Diseño de los oligonucleótidos para amplificar fragmentos de los
marcadores del cromosoma Y (Y-GATA A4, Y-GATA A7.1 y Y-GATA C4) y
PCR
Para la amplificación de una secuencia del cromosoma Y (Y-GATA A4) la PCR se
realizó utilizando como iniciadores oligonucleótidos localizados en la secuencia:
sentido (5´-TCG, ACT, CGG, TAC, CAC, TTC, CTA, GGT, TTT, C-3´) y el
oligonucleótido antisentido (5´-TGG, CTT, GGA, ATT, CTT, TTA, CCC, ATC, ATC,
T-3´) del marcador Y-GATA A4 que permitiría la amplificación de un fragmento de
entre 242-246 pb.
Para el caso de la amplificación de un fragmento del marcador Y-GATA A7.1 se
utilizaron como iniciadores oligonucleótidos localizados en la secuencia: sentido
(5´-CAA, ATT, TGC, CAA, ACT, CTT, TC-3´) y el oligonucleótido antisentido (5´-
TCT, ATC,CTC, TGC, CTA, TCA, TTT, ATT, A-3´) del marcador Y-GATA A7.1
que permitiría la amplificación de un fragmento de 161-181 pb. En Y-GATA C4 se
utilizaron como iniciadores oligonucleótidos localizados en la secuencia: sentido
(5´-AGT, GTC, TCA, CTT, CAA, GCA, CCA, AGC, AC-3´ y el oligonucleótido
antisentido (5´-GCA, GCA, AAA, TTC, ACA, GTT, GGA, AAA, ATG, T-3´) del
marcador Y-GATA C4 que permitiría la amplificación de un fragmento de 251-275
pb.
Por el momento sólo se realizó la estandarización de la amplificación de un
fragmento del marcador Y-GATA A7.1 Para ésta PCR se utilizaron 4µL de ADN
molde de la muestra de tejido muscular, 10 mM de cada dNTP (dATP, dCTP,
dTTP y dGTP), solución amortiguadora 5µl, 2 mM de cloruro de magnesio, 0.5 U
de la enzima Taq DNA polimerasa (Invitrogen) y agua bidestilada en un volumen
de 30.5 μl.Para el control negativo no se agregó DNA. La amplificación se llevó a
cabo en un termociclador PCR System 2700 (Applied Biosystems), utilizando el
siguiente programa: desnaturalización inicial a 94 ºC por 5 min, 28 ciclos a 94 ºC
por 30 seg, 50 ºC por 1 min y 72 ºC por 1 min y finalmente se realizó una
extensión adicional a 72 ºC por 7 min. Los productos de PCR se analizaron en
geles de agarosa al 1% en solución de TAE 1X.
31
XIV. RESULTADOS
EXTRACCION DEL ADN GENOMICO
Con el objeto de extraer el DNA genómico de muestras de cadáveres de tejido
muscular, se utilizó como ya se mencionó el kit de Epicentre. Se procesaron las
muestras de la 1 a la 30 las cuales son todas de varones y 3 de mujeres.
Obsérvese en la figura 1 y 2.
El ADN se observo en gel de agarosa al 1%, con esto se verificó la integridad del
mismo.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Fig. 1. Gel de agarosa al 1% en donde se observa el ADN de tejido muscular de cadáver.
ADN extraído del tejido de algunos individuos, éste se ve íntegro en los carriles que van del
3 al 12.
ADN
Marcador
molecular
1 Kpb
900 pb
800 pb
700 pb
600 pb
500 pb
400pb
300pb
200 pb
100 pb
32
1 2 3 4 5 6
Fig.2 Gel de agarosa al 1%. ADN de tejido muscular de cadáver. ADN extraído del tejido de
las muestras de otros individuos, éste se ve íntegro en los carriles que van del 1 al 6.
AMPLIFICACION DE UN FRAGMENTO DEL GEN DE LA β-ACTINA HUMANA
MEDIANTE PCR
Para amplificación de un fragmento de DNA del gen de β-actina humana se
estandarizó la técnica de PCR con las muestras del DNA de cadáveres. Estas
reacciones ya se realizaron como ya se menciono en materiales y métodos.
Observese en la figura 3 y 4. El resultado obtenido fue la amplificación de
productos de PCR de 437 pb en cada una de las muestras analizadas del ADN
genómico de cadáveres.
ADN
Marcador de
tamaño
molecular
33
1 2 3 4
Marcador molecular 1Kpb
900 pb
800 pb
700 pb
600 pb
500 pb
400 pb
300 pb
200 pb
100pb
Fig. 3. Gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio en donde se visualizan los
productos de PCR de las muestras analizadas en donde se utilizaron los oligos para un
fragmento del gen de la β-actina humana.
1 2 3
Fig. 4. Gel de agarosa al 1% en donde se ve la amplificación de productos de PCR de 437 pb
correspondientes a un fragmento del gen de la β-actina humana
AMPLIFICACION DE UN FRAGMENTO DEL REPETIDO STR A7.1 MEDIANTE
PCR
Para la amplificación de un fragmento del ADN del repetido STR A7.1 se inició la
estandarización de la técnica de PCR para las muestras del ADN de cadáveres.
Estas reacciones se realizaron como ya se menciono anteriormente en materiales
y métodos. El resultado fue la amplificación de productos de PCR de
aproximadamente 161-181 pb en al menos 2 de las muestras de ADN genómico
de los cadáveres que corresponden a varones.
437 pb
B-actina 437 pb
Marcador
molecular
1000 kpb
900 pb
800 pb
700 pb
600 pb
500 pb
400 pb
300 pb
200 pb
100 pb
34
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1617
Fig. 5. Gel de agarosa al 3% teñido con BrEt en donde se visualizan los productos de PCR
de las muestras con β-actina de 437 pb en los carriles 3,5, 7 y la amplificación de un
fragmento de 161-181 pb del repetido STR A7.1 en los carriles 13 y 16. En el carril 16 la
banda de menor tamaño podría corresponder a un exceso de oligonucleótidos presentes en
la reacción, mientras que la banda de mayor tamaño muy probablemente corresponde a un
producto de amplificación inespecífico.
Las primeras bandas del marcador de tamaño molecular 2 log, de abajo hacia arriba del gel
corresponden a 100 y 200 pb respectivamente.
Marcador molecular 2 log
B- actina de 437 pb
A7.1 de 161-181 pb
35
XV. DISCUSION
Este trabajo de investigación se realizó en tejido muscular de cadáveres, por lo
cual podríamos considerarlo como un aporte a la medicina forense, este tipo de
estudios se ha realizado en otros países con la finalidad de una base de datos
para su población.
En México se tiene el registro de análisis de secuencias de STRs en varones,
esto fue realizado en el Estado de Jalisco. Este grupo publico un artículo de
investigación el cual sirvió como principal referencia para nuestro proyecto. Otros
investigadores de nuestro país han realizado este tipo de trabajo en poblaciones
no mestizas, logrando así obtener información sobre el código genético de
huicholes, purepechas, etc.
El enfoque que dimos a nuestro proyecto pretende que en un futuro sea posible
elaborar una base de perfiles genéticos para ayudar a la identificación de
personas extraviadas. Nuestra propuesta es llegar a utilizar los perfiles genéticos
de cadáveres, a partir del uso de la amplificación de secuencias STRs y su
posterior secuenciación. El análisis de dichas secuencias podría ser de suma
utilidad en la identificación de individuos.
36
XVI. CONCLUSIONES
1.- Se realizó la extracción de ADN genómico del tejido muscular de cadáveres
mediante la utilización de kits comerciales.
2. Se realizaron ensayos de PCR utilizando oligonucleotidos específicos para
amplificar un fragmento del gen de la β-actina humana, estandarizando así la
técnica para los subsecuentes ensayos con éste control.
3. Se realizaron ensayos de PCR utilizando oligonucleótidos de los marcadores de
cromosoma Y, Y-GATA A4, Y-GATA A7.1 y Y-GATA C4. De los cuales por el
momento, sólo se obtuvieron resultados para el marcador Y-GATA A7.1
4. Dado los resultados obtenidos, podemos sugerir esta metodología podría ser de
utilidad para la posterior elaboración de una base de datos que sea utilizada en la
medicina forense en la búsqueda e identificación de individuos desconocidos.
5.- Debido a limitaciones de tiempo dejamos como perspectivas:
Analizar la amplificación de Y-GATA A7.1 en las demás muestras de ADN de
cadáveres con los que ya contamos. Continuar con la estandarización de la PCR
para los marcadores del Cromosoma Y Y-GATA A4 y Y-GATA C4 una vez que ya
contamos el ADN genómico de varias muestras y los oligonucleótidos específicos
para amplificar fragmentos de cada uno de estos marcadores.
37
XVII. BIBLIOGRAFIA
1. Klug, .W., S., y Cummings, .M., R. Conceptos de genética (1999) 5a ed.,
prentice may ibérica. Madrid.
2. Watson,.J.,D., y Crick,.F.,H.,C.Molecular structure of nucleic acids a
structure for Deoxyribose Nucleic Acid (1953) Nature 171;4356:737-738.
3. Kornberg. A., DNA Replication (1988) The Journal of Biological a
Chemistry: Vol. 263, No. 1, Issue of January 5, pp. 1-4.
4. Martínez, B. (1999). La prueba de ADN en medicina forense, ed. Masson.
Barcelona.
5. Jobling, M. Y Gill, P. Encoded evidence: DNA in forensic analysis.(2004)
Nat Rev Genet. Oct; 5(10):739-51.
6. Berumen-Campos J., Casas-Avila L., Hernández-Mendoza A., Segura-
Salinas E., Medina-León R., Larriva-Sahd J.Genetic diversity of 3 DNA
probes in the DNA fingerprinting of a Mexican population. Rev Invest Clin
(1994); 46: 457-64.
7. Rangel-Villalobos H., Jaloma-Cruz AR., Cerda-Aguilar L., Ríos-Angulo CD.,
Mendoza-Carrera F., Patiño-García B., Sandoval-Ramírez L., Figuera-
Villanueva LE.The genetic DNA trace in men: chromosome Y haplotypes in
a Mexican population, analyzing 5 STRs. Rev Invest Clin (2001); 53(5) Sep-
Oct. pag 311-314.
8. Rangel-Villalobos H, Jaloma-Cruz AR, Sandoval-Ramírez L, Velarde-Félix
JS, Gallegos-Arreola MP, Figuera LE.Y-chromosome haplotypes for six
short tandem repeats (STRs) in a Mexican population. Arch Med Res.(2001)
May-Jun; 32(3):232-7.
9. Mullis.,K.,B., y Faloona F., Specific synthesis of DNA in vitro via a
polymerase catalysed chain reaction.(1987) Meth. Enzymol, 155: 335-350.
10. Ana Isabel Morales C., Bernal Morera & Gerardo Jiménez-Arce. La
implementación forense de la tecnología del ADN en Costa Rica.Un análisis
retrospectivo. (2004) Rev. Biol. Trop. 52 (3): pag 695-712.
38
11. Corach D. (1999). Identificación Molecular de Restos Humanos
Emergentes de Desastres en Masa Mediante Análisis de A.D.N. "La prueba
del ADN en Medicina Forense", Ma. Begoña Martinez Jarreta, Masson S.A.
Ed. -Barcelona, España. Capitulo 16, pgs. 84-93.
12. Rangel-Villalobos H, Rivas F, Sandoval L, Ibarra B, Garcìa-Carvajal ZY,
Cantú JM, Figuera LE.Genetic variation among four Mexican populations
(Huichol, Purepecha, Tarahumara, and Mestizo) revealed by two VNTRs
and four STRs. (2000) Hum Biol. Dec;72(6):983-95.
13. Rangel-Villalobos H, Rivas F, Torres-Rodríguez M, Jaloma-Cruz AR,
Gallegos-Arreola MP, López-Satow J, Cantú JM, Figuera LE.Allele
frequency distributions of six Amp-FLPS (D1S80, APO-B, VWA, TH01,
CSF1PO and HPRTB) in a Mexican population. Hum Biol. (2000) Dec;
72(6):983-95.
14. Weir.,B. Population genetics in the forensic DNA debate. (1992). Proc Natl
Acad Sci USA, Dec 15;89(24):11654-9.
15. Corach D., Penacino G., Sala A., Iannucci N., Martinez M., Villafañe A.,
Kayser M. and Roewer L. (1998) Validation Studies of Y-Specific STRs:
Forensic Casework Evaluation. Progress in Forensic Genetics 7: 418-420.
16. Williams.,R., y Johnson.,P. Inclusiveness, effectiveness and intrusiveness:
issues in the developing uses of DNA profiling in support of criminal
investigations.(2006) Fall;33(3):545-58.
17. Technical working group on DNA methods. (1995) guidelines for a quality
assurance program for DNA analysis. Crime Laboratory Digest, 22:18–43.
18. Lorente.,J.,A., Entrala.,C., Alvarez.,J.,C,. Identification of missing persons:
the Spanish “phoenix” program (2001). Croat. Med. J. 42 267-270.
19. Manual específico de operación de servicios periciales en la especialidad
de genética forense. Coordinación general de servicios periciales.
Procuraduría General de Justicia del D,F . (2004).
20. Brenner C.H. and Morris J.W (1990). Paternity index calculations in single
locus hypervariable DNA probes: validation and other studies. In
39
Proccedings for the international symposium on human identification (1989).
Promega, Madison, pp.21-52.
21. John R. Masters, Jim A. Thomson, Bernadette Daly-Burns, Yvonne A.
Reid, Wilhelm G. Dirks, Phil Packer, Lorraine H. Toji, Tadao Ohno, Hideyuki
Tanabe, Colin F. Arlett, Lloyd R. Kelland, Maureen Harrison, Arvind Virmani,
Timothy H. Ward, Karen L. Ayres, and Paul G. Debenham. Short tandem
repeat profiling provides an international reference standard for human cell
lines.(2001) Medical Sciences, vol 98, nº 14, 8012-17, 2.
22. Jeffreys.,A.,J.,Wilson.,V., y Thein.,S.,J. Individual-specific 'fingerprints' of
human DNA.(1985) Nature 316, 76-79.
23. Arlene R., Wyman and Ray White. A Highly Polymorphic Locus in Human
DNA (1980). PNAS.November. vol. 77.no.11 pages: 6754-6758.
24. Nakamura.,Y., Leppert.,M., O´connell.,P., Wolf.,R.,Culvert.,M.,Martín.,C.,
Fujimoto.,E.,Hoff.,M.,Kumlim.,E., y White., R. Variable number of tandem
repeat (VNTR) markers for human gene mapping (1987) Science vol. 235,
issue 4796 pages 1616-1622.
25. Alonso.,A.,Martin.,P.,Albarran.,C.,Garcia.,P.,Fernandez de Simon., J.,
Iturralde.,M.,Fernandez-Rodriguez.,A.,Atienza.,I.,Capilla., Garcia-Hirschfeld,
J., Martinez.,P.,Vallejo.,G.,García.,O.,Garcia.,E.,Real., P., Alvarez, D., León,
A., Sancho, M., Challenges of DNA profiling in mass disaster investigations
(2005). Croat. Med. J. 46, 540-548.
26. Martin-de las Heras.,S., Valenzuela., A., Villanueva., E., Marques., T.,
Exposito., N., Bohoyo., J.,M. Methods for identification of 28 burn victims
following a 1996 bus accident in Spain. (1999) J Forensic Sci;44: 428-31.
27. Corach.,D., Sala.,A.,Penacino.,G.,Iannucci., N., Bernardi., P., Doretti., M.,
et al. Additional approaches to DNA typing of skeletal remains: the search
for “missing” persons killed during the last dictatorship in Argentina. (1999)
Electrophoresis; 18:1608-12.
28. Corach D., Andrea Sala, Gustavo Penacino and Alicia Sotelo. Mass
Disasters: Rapid Molecular Screening of Human Remainsby Means of STRs
Typing. Electrophoresis (1995) 16 (9):1617-1623.
40
29. Urquhart, A., Kimptom, C, P., Downes, T,J. Y Gill, P. Variation in short
tandem repeat sequences a survey of twelve microsatellite loci for use as
forensic identification markers (1994) Int. J. Leg. Med. 107, 13-20.
30. J. M. Butler. Recents developments in y-short tandem repeat and y-single
nucleotide polymorphism analysis. (2003) Forensic Sci Rev 15:91(july).
31. Yunis, J.J., O. Garcia, I. Uriarte and E.J. Yunis 2000b.Population data on 6
short tandem repeat loci in a sample o Caucasian-Mestizos from Colombia.
Int J Legal Med. 113:175-178.
32. Pérez-Lezaun A, Calafell F, Clarimón J, Bosch E, Mateu E, Gusmão L,
Amorim A, Benchemsi N, Bertranpetit J. Allele frequencies of 13 short
tandem repeats in population samples from the Iberian Peninsula and
northern Africa.(2000) Int J Legal Med.;113(4):208-14.
33. Grattapaglia D, Schmidt AB, Costa e Silva C, Stringher C, Fernandes AP,
Ferreira ME Brazilian population database for the 13 STR loci of the
AmpFlSTR Profiler Plus and Cofiler multiplex kits.(2001) Forensic Sci Int.
Apr15;118(1):91-4.
41
XVIII. ANEXOS
ANEXO1. TÉCNICA DE CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDOS
NUCLÉICOS
Para la cuantificaciòn de los ácidos nucléicos, se empleò la espectrofotometría de
absorción de luz UV. Las características de la absorción de la luz por parte de los
ácidos nucleicos se deben a la presencia de bases nitrogenadas que absorben
con intensidad la luz UV (entre 204-280 hm), y a los efectos químicos y
conformaciónales del esqueleto pentosa-fosfato que modulan dicha absorción. Los
polinucleótidos presentan una longitud de onda máxima (lambdamax) que oscila
entre 258-260nm y una longitud de onda mínima (lambdamin) que oscila entre 230-
250 nm. Cada ácido nucléico presenta un coeficiente de extinción molar
característico y menor al de los ácidos nucléicos individuales debido al efecto
hipocrómico producido por el apilamiento de las bases en el helicoide y a las
interacciones por puentes de hidrogeno entre las bases de duplex. Estas
características no solo se emplean para determinar la cantidad de ácidos
nucléicos, sino también para evaluar su pureza y comportamiento cuando son
sometidos a desnaturalización por calor y a procesos de reasociación. Sin
embargo, se debe de tener en cuenta que el emparejamiento de las bases por
puentes de hidrogeno reduce la absorción de luz ultravioleta,por lo que el ADN
monocatenario absorbe mas luz.
Se ha establecido para el ADN purificado, que las absorbancias leídas a 260 nm y
280 nm (razón A260/ A280) debe de ser de 1.8 y el valor de A260 / A280 para el ARN
es de 2.0. Si la muestra presenta contaminación con proteínas, estos valores son
menores puesto que los polipéptidos absorben a 280 nm; si se observa absorción
en 230 nm, puede haber contaminación por compuestos con grupos aromáticos
como el fenol, por urea o por otros contaminantes.
42
ANEXO 2. TÉCNICA DE PCR
La reacción de PCR permite amplificar más de un millón de veces un ADN
obtenido a partir de una región seleccionada del genoma o de una secuencia
especifica de ADN, siempre y cuando se conozca una parte de su secuencia de
nucleótidos.(6)
Para la PCR se utilizan dos oligonucleótidos sintéticos de unos 15-20 nucleótidos
que son complementarios a las zonas flanqueantes de la región que se quiere
amplificar. Estos oligonucleótidos (habitualmente conocidos por su nombre en
inglés, "primers") que son oligonucleòtidos los cuales actúan como iniciadores
para la síntesis in vitro de ADN. Asì entonces se requiere de un ADN que sirve
como molde donde se localiza la región que se quiere amplificar y de la enzima
llamada DNApolimerasa, la cual tiene su actividad a temperaturas elevadas entre
79-85 ºC, así como de los desoribonucleótidos (dNTPs).
ANEXO 3. COMPONENTES DE LA PCR
Amortiguador de la reacción
Los amortiguadores de PCR que se utilizan normalmente contienen KCl, Tris y
MgCl2. El MgCl2 es el componente que más influye en la especificidad y
rendimiento de la reacción ya que los iones Mg2+ son necesarios para la actividad
de la Taq DNApolimerasa, es decir, actúan como cofactores de la polimerasa.
La concentración óptima de MgCl2 está en torno a 1.5 mM si se emplean
concentraciones de 200 µM de cada uno de los dNTPs. No obstante, a veces es
necesario probar con diferentes cantidades de Mg2+ ya que un exceso del mismo
origina una acumulación de productos inespecíficos y una cantidad insuficiente
hace que disminuya el rendimiento de la amplificación.
Oligonucleótidos
Al momento de elegir los oligonucleòtidos para amplificar un determinado
fragmento de ADN hay una serie de reglas a seguir:
La longitud de cada uno de los oligonucleòtidos debe estar comprendida entre 18
y 24 bases ya que se ha comprobado que oligonucleòtidos de mayor longitud (30-
35 bases) no aumentan el rendimiento mientras que los cortos carecen de
43
suficiente especificidad. Ambos oligonucleòtidos deben tener una Tm (siglas en
ingles,melting temperature) similar (como mucho la diferencia entre ambas
temperatura debe ser de 2 ºC).
La relación bases púricas y bases pirimidícas debe ser 1:1 (o como mucho 40-
60%). De preferencia la secuencia de los oligonucleòtidos debe comenzar y
terminar con 1-2 bases púricas. Para evitar la formación de dímeros de
oligonucleòtidos es necesario comprobar que estos no contengan secuencias
complementarias entre sí. Los dímeros de oligonucleòtidos consisten en
fragmentos de doble cadena cuya longitud es muy próxima a la de la suma de los
mismos y se producen cuando un oligonucleòtido es extendido a continuación del
otro. La observación de que oligonucleòtidos con los extremos 3' complementarios
favorecen su formación sugiere que el paso inicial se debe a interacciones
transitorias que aproximan los extremos complementarios.
ADN molde
Es el ADN del cual queremos amplificar un determinado fragmento y el cual la Taq
DNApolimerasa utiliza como molde para la síntesis de nuevas cadenas
polinucleotídicas. La cantidad de ADN necesaria para la PCR depende de varios
factores: Siendo la principal de la secuencia que se va a amplificar es necesario
realizar un estudio de validación en él que se incluye un estudio de sensibilidad en
el que se determina cuál es la mínima cantidad de ADN que se va a amplificar en
condiciones estándar. De manera general, para casi todos los STR utilizados en
Genética Forense la cantidad óptima de ADN que asegura un rendimiento
adecuado es de aproximadamente de 5 ng. Esto es cuando se trabaja con ADN
cuya calidad es óptima y no suele haber problemas en la amplificación y
cantidades del mismo por encima e incluso por debajo de los 5 ng rinden buenos
resultados. Uno de los problemas que se presenta en la amplificación es porque
esta afectado el ADN en su integridad o porque contiene contaminantes que
pueden inhibir la actividad de la polimerasa. En el caso en el que tengamos ADN
sin degradar pero unido a una acción para evitar el efecto de los contaminantes
diluir al máximo la muestra, pero siempre dentro de un rango de ADN que no esté
por debajo del límite de sensibilidad de la PCR.
44
dNTPs
Las concentraciones de dNTPs (dATP, dGTP, dCTP y dTTP) que suelen usarse
son de alrededor de 200 µM de cada uno de ellos. En un volumen de reacción de
25 µl con esta concentración de dNTPs se sintetizarían entre 6-6.5 µg de ADN. La
concentración de dNTPs y de MgCl2 estàn relacionadas ya que el Mg
2+ se une a
los dNTPs con lo que concentraciones elevadas de dNTPs inhibirían la reacción al
no tener la Taq DNA polimerasa suficiente Mg2+ como para incorporar dNTPs.
Para una concentración de 200 µM de cada dNTP se suele añadir MgCl2 a una
concentración de 1.5 mM de MgCl2.
Taq DNApolimerasa
Las cantidades óptimas de Taq DNApolimerasa necesarias para la síntesis de
ADN están alrededor de 2 unidades en 25 µl de volumen final de reacción. La
actividad de este enzima se ve influenciada por la concentración de dNTPs, de
Mg2+ y de algunos iones monovalentes de manera que concentraciones elevadas
de los mismos inhiben dicha actividad. Por otro lado, pequeñas concentraciones
de KCl estimulan la actividad sintética de la Taq en un 50-60% con un máximo
aparente cuando su concentración es de 50 mM. Existen algunos datos
relacionados con la influencia de ciertos reactivos que se emplean antes de la
amplificación y que alteran la actividad de la Taq. Por ejemplo concentraciones 1M
de urea estimulan la actividad, el SDS a bajas concentraciones que la inhibe al
igual que concentraciones mayores del 10% de etanol.
FASES DE LA PCR:
La reacción de PCR se lleva a cabo en una serie de ciclos cada uno de los cuales
incluye tres fases:
1.- Desnaturalización: Para que comience la reacción es necesario que el ADN
molde se encuentre en forma de cadena sencilla. Esto se consigue aplicando
temperaturas de 90 a 95 ºC que producen la rotura de los puentes de hidrógeno
intercatenarios y por lo tanto la separación de ambas cadenas. Para conseguir la
45
completa separación de las hebras de toda la muestra esta temperatura debe
mantenerse unos minutos.
2.- Hibridación: Esta fase se denomina también fase de “annealing” o de
emparejamiento. Una vez que el ADN está desnaturalizado se disminuye la
temperatura hasta un rango comprendido entre los 40 y los 60 ºC para que se
pueda producir la unión de los iniciadores a las secuencias flanqueantes del
fragmento que se va a amplificar. La temperatura depende de la longitud de los
iniciadores y la secuencia para la amplificación, una fórmula simple para calcular
el Tm es la siguiente:
Tm = 4(G+C) + 2 (A+T).
No obstante, cada oligonucleótido exige una serie de estudios experimentales
para determinar su temperatura de apareamiento específica ya que si la
temperatura es muy baja la unión se hará de forma inespecífica y si es muy alta no
se producirá una unión completa.
3.- Extensión: Durante este paso la Taq DNApolimerasa incorpora nucleótidos en
el extremo 3' del iniciador utilizando como molde la cadena de ADN previamente
desnaturalizada. La temperatura a la que se lleva a cabo este paso suele ser de
72 ºC ya que es la temperatura a la que la Taq DNApolimerasa alcanza su
máxima actividad. Normalmente una extensión de 20 segundos es suficiente para
fragmentos menores de 500 pb, y 40 segundos para fragmentos mayores de 1.2
Kpb.
ANEXO 4. TÉCNICA DE ELECTROFORÉSISUna vez amplificado el ADN, los fragmentos resultantes son separados en función
de su tamaño por medio de un proceso de electroforésis. Generalmente se utilizan
dos tipos de electroforésis, sin embargo nuestro estudio se basa en:
46
Electroforésis en geles verticales de poliacrilamida:
Es una técnica de separación de proteínas y otras biomoleculas tales como los
acidos nucleicos las cuales se mueven por acción de una corriente eléctrica a
través de un gel compuesto de una molécula orgánica (Agarosa) unida mediante
enlaces transversos para formar un tamiz molecular. La resistencia que opone
este al paso es lo que permite separar los diferentes ácidos nucleicos que se
extraen de las células. Para determinar la concentración y el tamaño del ADN se
utiliza como patrón marcadores de tamaño molecular los cuales se corren al
paralelo junto con el ADN muestra.