Manual de procedimientos de microbiología cocos gram positivos

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MANUAL DE PROCEDIMIENTOS
 DE MICROBIOLOGÍA
 
 
 
 
 
 
COCOS GRAM POSITIVOS
 
 
 
 
 Dra. Andrea Badanian
Grado 3 (interina) – Cátedra de Microbiología
 
 
Algoritmos de Diagnóstico y Tablas de Identificación
 
Imágenes microscópicas de Cocos Gram Positivos
Algoritmo de diagnóstico de Cocos Gram Positivos
Tabla de identificación de Estafilococos.
Algoritmo general de diagnóstico de Estreptococos
Algoritmo de diagnóstico inicial de Estreptococos alfahemolíticos
Algoritmo de diagnóstico inicial de Estreptococos betahemolíticos
Pruebas de Diagnóstico de Cocos Gram Positivos
 
Imágenes microscópicas de Cocos Gram Positivos
 
Agrupación tipo estafilococos (racimos)
 
               
 
Agrupación tipo estreptococos (cadenas)
 
               
 
 
 
 
 
 
Tabla de características de los géneros Staphylococcus, Micrococcus y Stomatococcus 
[1]
 
  Micrococcus Staphylococcus Stomatococcus
Aerobio estricto + - -
Anaerobio
facultativo
- + +
Fermentador - + +
Catalasa + + Débil/-
Oxidasa + - -
 
 
Tabla de Diagnóstico de Estafilococos (género Staphylococcus)
 
TEST S. AUREUS S. EPIDERMIDIS S. SAPROPHYTICUS
Catalasa + + +
Coagulasa + - -
Formación ácido aerobicamente
del D-manitol
 
+
 
-
 
+/-
DNAasa + - -
Novobiocina S S R
Formación ácido aerobicamente
de la D-trehalosa
 
+
 
+
 
+
 A.Badanian
Formación ácido aerobicamente
de la sacarosa
 
+
 
+
 
+
Pigmento Dorado Blanco Amarillo/Naranja
Aglutinación de látex + - -
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ALGORITMO GENERAL DE DIAGNOSTICO DE ESTREPTOCOCOS
«srrepTococas
loluble
Bilis
Algoritmo de identificación inicial de estreptococos alfa he motil icos
Estreptococos
viridons
óe n i ib las o Cp+oqjho
an
5- pneurnonioe Hidrólisis del FYR
A Badanian
pneumoniaa
£. grvpo Q
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Pruebas de Diagnóstico de Cocos Gram positivos:
 
Test de Coagulasa
Test de Catalasa
Test DNAasa
Lectura de hemólisis
Test de CAMP
Prueba de Solubilidad en Bilis
Prueba de Sensiblidad a la Optoquina
Agar Bilis Esculina
PYR
Prueba de Sensibilidad a la Bacitracina
Sal Tolerancia
Oxidación-Fermentación (OF)
Voges-Proskauer(VP)
Aglutinación de látex
Oxidasa
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Test de Catalasa
[2]
 
v Sobre lámina
1. Colocar una gota de solución de peróxido de hidrógeno al 3% sobre la superficie de un portaobjeto
limpio y seco.
2. Colocar con un ansa una pequeña cantidad de un cultivo puro sobre la gota
3. Observar la aparición de burbujas de gas que indica una reacción positiva.
 
v Sobre medio
1. Sobre un agar inclinado (sin sangre) de un cultivo puro luego de 24-48 horas de incubación gotear
con pipeta Pasteur dos o tres gotas de agua oxigenada o con gotero de reactivo correspondiente.
2. Observar la aparición de burbujas de gas que indica una reacción positiva.
 
Precaución: No realizar la prueba directamente sobre agar sangre porque el contenido de catalasa en los
glóbulos rojos da un falso positivo.
 
 
       
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Test de DNasa
 
Es usado para identificar microorganismo capaz de producir la enzima DNasa (desoxirribonucleasa) que
cataliza la depolimerización del ADN en fragmentos más pequeños. Este agar contiene una emulsión de
ADN, péptidos y verde de metilo. El medio es de un color verdoso a pH 7.5. Las bacterias que secretan
DNasa  hidrolizan el ADN del medio en fragmentos más pequeños. El resultado es un aclaramiento
alrededor de la colonia.
 
 
            
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Test de Coagulasa
 
 
v Sobre lámina (“cumpling factor”)
[3]
1. Colocar una gota de plasma para coagulasa (plasma de conejo con EDTA o citrato) sobre un
portaobjetos.
2. Colocar una gota de agua destilada o solución salina próxima a la gota del plasma como control.
3. Suspender una parte de la colonia en ambas gotas comenzando por el control, tratando de obtener
una solución homogénea.
4. Observar la producción de agregado (grumos blanquecinos) en la gota de plasma mientras el control
permanece homogéneo que indica una reacción positiva. La agregación en ambas gotas indica que el
microorganismo autoaglutina por lo que no es adecuado para esta prueba.
 
v Sobre tubo
[4]
1. A partir de un cultivo de 24 horas en medio sólido, emulsionar una colonia en 1 ml de plasma fresco
citratado de conejo diluído al 1/5 con suero fisiológico.
2. Incubar a baño María a 37°C.
3. Luego de 1, 2, 4, 8 y 24 horas de incubación, cualquier grado de coagulación en cualquiera de estos
tiempos indica actividad coagulasa positiva.
 
                   
 
Lectura de Hemólisis
[5]
 
a-hemólisis: Hemólisis parcial de eritrocitos alrededor de la colonia produciendo una decoloración
verdosa en el medio.
b-hemólisis: Hemólisis total de eritrocitos alrededor de una colonia produciendo aclaramiento de sangre
en el medio.
g-hemólisis: No se produce hemólisis y por tanto no hay cambio del medio alrededor de la colonia. Los
microorganismos que producen g-hemólisis se denominan no hemolíticos.
a-prima:   La zona de eritrocitos inmediatamente adyacentes a la colonia permanece intacta y una zona
de hemólisis total se produce alrededor de la zona de eritrocitos intactos.
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Test de Oxidasa
 
La citocromo oxidasa es una enzima presente en algunas especies que transfieren electrones al oxígeno
(aceptor final en algunas cadenas de transporte de electrones). La presencia de esta enzima puede ser
detectada a través del uso de discos de oxidasa que actúa como una dador de electrones para la
citocromo oxidasa. Si la bacteria oxida el disco (remueve electrones) el disco se tornará violeta,
indicando una reacción positiva. Una reacción negativa determina que no se produzca cambio de color.
 
 
             
Aglutinación de látex
 
Se utilizan partículas de látex cubiertas de plasma. El fibrinógeno unido al látex detecta el factor
clumping. Asimismo, las moléculas de inmunoglobulina presentes en las partículas de látex detectan la
proteína A (presente en la pared celular de S.aureus) que es capaz de unirse a IgG por la región Fc.
Mezclando el reactivo con material de la colonia resulta en un agregado de la suspensión.
 
Descripción de la técnica Slidex Staph Plusâ
[6]
 
Principio
 
El reactivo Slidex Staph Plus comprende partículas de látex azul sensibilizados con fibrinógeno humano
y anticuerpos monoclonales. Por lo tanto permite detectar simultáneamente:
- el factor de afinidad para el fibrinógeno (cumpling factor).
- la proteína A por el fragmento Fc de las IgG de ratón.
- un antígeno de grupo ligado a las estructuras periféricas específicas de S.aureus.
 
En presencia de S. aureus se podrá observar una aglutinación visible a simple vista.
 
Reactivos
 
R1 Reactivo anti-Staphylococcus aureus
Frasco tapón
ROJO
Látex sensibilizado por el fibrinógeno humano y los
anticuerpos monoclonales anti-Staphylococcus aureus
NaN3 < 0.1%
R2 Reactivo Control
Frasco tapón
AZUL
Látex control negativo
NaN3 < 0.1%
   
 
Conservación
 
v Reactivos a 2-8 ºC
v Se debe sospechar de deterioro de los reactivos si:
- el reactivo anti-Staphylococcus aureus no aglutina una cepa de S. aureus conocida y que sirve de
referencia postiva.
- el reactivo anti-Staphylococcus aureus aglutina una cepa de S. epidermidis conocida y que sirve
de referencia negativa.
- los reactivos se autoaglutinan en los frascos.
- los reactivos están contaminados o se han evaporado.
 
Advertencias y Precauciones de Uso
 
v Al contener componentes de origen humano, se aconseja manipularlos con las precauciones de uso
relativas a los productos potencialmente infecciosos.
v No usar asa metálica para realizar la prueba.
v No pipetear con la boca los reactivos.
v Evitar el contacto con los ojos y la piel.
v Después de retirar los reactivos del refrigerador dejarlos hasta que alcancen la temperatura
ambiente.
 
Técnica
 
Luego de la incubación de18-24 horas a 37 ºC
1) Llevar los reactivos a temperatura ambiente.
2) Homogeneizar los reactivos látex.
3) En un cartón desechable (provisto en el kit), escoger 2 círculos adyacentes.
4) En uno de los círculos depositar una gota de R1 y en el segundo una gota de R2.
5) Con bastoncillos diferentes añadir las colonias sospechosas (de 3 a 6 colonias si son muy
pequeñas).
6) Mezclar cuidadosamente durante 10 segundos con los bastoncillos. Extender bien sobre la
superficie de los círculos.
7) Rotar ligeramente la tarjeta por 20 segundos y leer sin lupa.
 
Lectura
 
v Un resultado positivo se indica por la aparición en el reactivo R1 de una aglutinación en los 30
segundos y por ausencia de aglutinación en R2.
v Un resultado negativo se indica por la ausencia de aglutinación en los reactivos R1 y R2.
v La reacción no se pueden interpretar si el reactivo control (R2) presenta una aglutinación.
 
 
 
 
Interpretación de los resultados
 
v La aglutinación de las partículas de látex con el reactivo R1 indica únicamente la presencia de S.
aureus.
v Si la aglutinación es muy débil con el reactivo R1 o si la reacción no se puede interpretar entonces, la
identificación de la cepa se debe efectuar buscando coagulasa o estudiando otras características
bioquímicas.
 
 
Control de Calidad
 
Se recomienda cada vez que se recibe un nuevo lote y en forma periódica.
 
Eliminación de Desechos
 
Todo el material utilizado debe inicinerarse, colocar en autoclave o sumergir en desinfectante antes de
su eliminación.
 
Limitantes de la prueba
 
v Falsos negativos:
o Cantidad insuficiente de colonias.
o Ausencia de factor de afinidad para el fibrinógeno, proteína A y antígenos contra los
anticuerpos monoclonales.
v Falsos positivos:
o Algunas cepas de estreptococos (A,C y G) poseedoras de sitios receptores para las
inmunoglobulinas y para el fibrinógeno.
Test de Camp
 
La beta hemólisis de los Streptococcus del grupo B se combina sinérgicamente con la beta hemólisis de
una cepa de S. aureus lo que produce una gran hemólisis beta  como forma de punta de flecha que
caracteriza a una prueba positiva de CAMP.
 
Procedimiento
[7]
 
1. Inocular trazando una estría, una cepa productora de toxina beta en el centro de una placa de agar
sangre (5%).
2. Inocular los aislamientos de la cepa problema junto con el control del grupo B positivo y control del
grupo A negativo, trazando estrías perpendiculares a la estría del estafilococo, deteniéndose justo
antes de alcanzarla.
3. Incubar las placas a 37º durante 18-24 horas en aerobiosis o durante 6 horas con 5-10% de CO2. La
incubación en aerobiosis aumentará la especificidad de la prueba ya que pocos estreptococos que no
pertenezcan al grupo B serán positivos en esas condiciones. Observar la presencia de una zona en
forma de punta de flecha con hemólisis más intensa en la unión entre los estreptococos positivos y el
estafilococo. Aproximadamente 95% de los estreptococos del grupo B y unas pocas cepas poco
frecuentes de otros grupos son CAMP positivos.
 
 
 
 
Prueba de Sensiblidad a la Optoquina
 
Es un test presuntivo que se usa para identificar cepas de Streptococcus pneumoniae. Los discos de
optoquina (etil hidrocupreina) son colocados en placas sembradas de agar sagar. Debido a que S.
pneumoniae no es optoquina resistente, un halo de inhibición se desarolla alrededor del disco. Esta zona
tiene un diámetro mayor o igual a 14 mm.
 
Procedimiento
[8]
 
1. Inocular un cuadrante o una mitad de una placa de agar sangre (5%) con un cultivo puro de la cepa
problema.
2. Colocar un disco con optoquina en el centro de la zona inoculada.
3. Incubar durante 18-24 horas a 35°C en 5-10% de CO2 o en campana con vela. Las zonas iguales o
mayores a 14 mm que rodean a un disco de 6mm de diámetro y las zonas iguales o mayores a 16 mm
que rodean a un disco de 10 mm se consideran positivas y permiten el diagnóstico presuntivo de
S.pneumonie.
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Agar Bilis Esculina
 
Es un medio usado para la identificación de los estreptococos del grupo D . Este grupo de bacterias
tiene la habilidad de crecer en presencia de bilis. También tienen la habilidad de hidrolizar la esculina lo
que determina el viraje del medio al color negro en la prueba positiva. Otras bacterias con capacidad de
crecer en bilis no cambian el color del medio.
 
Procedimiento:
1. Se siembra en el agar inclinado de Bilis Esculina y se incuba a 37°.
2. Se efectúan observaciones a las 24 y 48 horas. Se considera positivo cuando ocurre ennegrecimiento
del medio.
 
Prueba de solubilidad en bilis
 
Muestra la capacidad de algunos microorganismos de lisarse en preencia de bilis o sales biliares en un
tiempo y temperatura determinados. Las sales biliares aceleran el proceso de autolisis espontánea de
estos microorganismos por activación de autolisinas.
 
 
Procedimiento:
 
v En caldo
[9]
Reactivos:
Solución acuosa de desoxicolato de sodio al 2%
Indicador de pH (rojo fenol)
Solución 0.1 N de hidróxido de sodio.
 
1. Preparar una suspensión densa en 1 ml de suero fisiológico a partir de un cultivo puro y fresco en
medio sólido de la cepa problema. Si se parte de un caldo, se centrifuga descartándose el
sobrenadante.
2. Agregar una gota de rojo fenol y ajustar, si es necesario, a pH 7 mediante el agregado de algunas
gotas de soda 0.1 N (color rosa pálido).
3. Repartir la solución anterior en 2 tubos (0.5 ml en cada tubo).
4. Agregar 0.5 ml de desoxicolato de sodio al tubo problema e igual cantidad de suero fisiológico al
tubo control.
5. Agitar ambos tubos e incubarlos a 37° con estufa o baño María.
6. Examinar periódicamente durante 2 horas.
7. El aclaramiento de la turbidez representa la reacción positiva  mientras que en la negativa el medio
permanece turbio al igual que el tubo control
 
v En placa de Petri
[10]
1. Preparar una solución de sal biliar (desoxicolato de sodio al 10% en agua destilada). Mantener a
temperatura ambiente (vida útil 6 meses).
2. Seleccionar cepa problema  sobre una placa de agar sangre o agar chocolate y colocar una gota del
reactivo directamente sobre la colonia.
3. Dejar secar el reactivo, manteniendo la placa horizontal de forma que el reactivo no se desplace.
Puede acelerarse el proceso colocando la placa en una estufa de incubación en aerobiosis.
4. Cuando el reactivo se ha secado (15 minutos), observar el área de la colonia. La ausencia o reducción
de la colonia original indica solubilidad en bilis.
Test del PYR (hidrólisis de L-pirrolidonil-beta-naftilamida)
 
Identifica en forma presuntiva los estreptococos del grupo A y los enterococos.
 
v Prueba en medio
[11]
:
1. Se inocula un cultivo puro de la cepa problema en un medio que contiene el sustrato para la prueba
PYR las que también contienen agar bilis esculina.
2. Se incuban a 35° durante 18-24 horas en aerobiosis.
3. Se detecta la presencia de betanaftilamina libre producida por la hidróliss del sustrato mediante el
agregado de una gota del reactivo para PYR (N,N-dimetiamincinamaldheído más detergente)
directamente sobre el cultivo en agar. 
4. Las colonias de organismos positivos para la hidrólisis de PYR desarrollan un color rojo cereza
brillante en no más de 2 minutos.
 
 
v Prueba en papel de filtro (Visi-Spotâ) 
[12]
:
 
Principio: La hidrólisis del PYR por la PYRasa permite distinguir estreptococos del grupo A y
enterococos. Asimismo permite detectar la habilidad de beta-D-glucosidasa (GLCasa) de hidrolizar la
esculina en esculatina y glucosa libre. La base de la identificación se basa en la actividad de la GLCasa y
de la PYRasa.
 
Materiales utilizados:
 
Cada kit contiene:
- Papeles de filtro impregnados específicos para PYRasa y GLCasa localizados dentro de los
círculos rojo y azul respectivamente.
- Reactivo buffer: Frasco dispensador de solución salina con conservador.- Reactivo colorimétrico: Frasco dispensador con desarrollador de color.
- Aplicadores de madera.
 
Precauciones: Desechar cuando el papel de filtro dentro de los círculos rojos y azules muestren signos
de decoloración.
 
Almacenamiento: Conservar los kits a 2-8 ºC. Antes de su uso deben mantenerse a temperatura
ambiente (15-30º) por 1 hora.
 
Procedimiento:
1. Picar varias colonias sospechosas con el aplicador de madera provisto en el kit. Colocar en áreas
dentro de los círculos rojo y azul rotando.
2. Humedecer cada área con 3-4 gotas de reactivo buffer.
3. Luego de 5 minutos dispensar 3-4 gotas de reactivo colorimétrico dentro del círculo rojo. La
reacción en el círculo rojo forma un color rojo inmediatamente confirmando su actividad PYRasa. Si
no se desarrolla color el test PYR se interpreta como negativo.
4. Esperar 15 minutos más antes de leer el color en el círculo azul. El desarrollo de color azul dentro
del círculo azul confirma actividad GLCasa.
 
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Interpretaciones:
 
  Círculo rojo Círculo Azul
Enterococcus Rojo Azul
Streptococcus grupo A Rojo Sin color
No enterococos / S.grupo A Sin color Azul/Sin color
 
La posibilidad de que microorganismos no enterococos o no pertenecientes a estreptococos del grupo A
puedan dar cambio de color en el círculo azul se puede dar por hidrólisis del sustrato dentro del círculo
azul (por ejemplo, Lactobacillus, Listeria, etc.)
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Prueba de Sensibilidad a la Bacitracina
 
1. Inocular la mitad de una placa de agar sangre (5%) con un cultivo puro de la cepa problema.
2. Colocar un disco con 0.04 U de bacitracina en el centro de la zona sembrada.
3. Incubar en aerobiosis o con 5-10 Incubar durante 18-24 horas a 35°C en 5-10% de CO2  y observar
la presencia de un halo de inhibición alrededor del disco.
4. La presencia de un halo de cualquier tamaño indica sensibilidad a la bacitracina.
Prueba  de la Sal Tolerancia
 
Preparación del medio
[13]
:
25 grs. caldo infusión de corazón
65 grs ClNa
Prueba de sal to leran c ia
A. B adaman
In o cu lac ió n e incubación
N o s a ( t o le r a n te - L l rn e tlio no v ira a l a m a r ilfo ni s e o b s e rv a l i i rh id e z .
S a l T o le i a n te P a tró n A E I ni e dio n o v ira a l a m a r illa p aro s e o b s e rv o tu rb id o í .
S a l T o le r a n te P o tró n B El m e d io v i ía al a m a r illo .
1 gr dextrosa
1 ml de indicador (1.6 gr de púpura de bromocresol en 100 ml de etanol)
1000 ml de agua destilada
Se mezcla y se calienta para disolver. Se reparte y se esteriliza en autoclave.
Procedimiento:
Se inocula cepa problema y se observa a las 24, 48 y 72 hrs. Se considera prueba positiva el cambio de
indicador o la observación de turbidez.
Prueba de oxidación-fermentación (OF)
Preparación del medio
[15]
:
2 gr. peptona o tripona
5 gr de cloruro de sodio
2.5 gr de agar
0.3 gr de fostato dipotásico
0.03 gr de azul de bromotimol
1000 ml de agua destilada
Disolver todos los componentes. Ajustar el pH a 7.1 y fraccionar en frascos más pequeños con un
volumen conocido. Por ejemplo, si se desea preparar glucosa, maltosa, sacarosa, lactosa y manitol OF en
cinco frascos colocando 200  ml en cada uno. Esterilizar.
 
 
Voges Proskauer
[16]
 
Los microorganismos que utilizan la glucosa pueden producir formato y acetato a partir del piruvato o
pueden metabolizar los compuestos carbonados dando acetoína y butanediol.
Algunos microorganismos no pueden producir suficientes ácidos estables para disminuir el pH del medio.
Para estos microorganismos los productos principales del metabolismo de la glucosa son acetoína y 2,3-
butanediol
 
 
Preparación del medio:
Pueden venir tubos con el medio (peptonas, glucosa y buffer) o prepararse a partir del medio en polvo.
Es el mismo medio utilizado para efectuar la prueba de rojo de metilo.
Reactivo Barritt A:
5 gr. alfa natfol
100 ml. alcohol etílico
Disolver al alfa naftol en un pequeño volumen de alcohol etílico y llevar el volumen a 100 ml en un
matraz o probeta. Conservar en una botella oscura en el refrigerador.
Reactivo Barritt B:
40 gr. hidróxido de potasio
100 ml. agua destilada
Conservar en frasco de polietileno.
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Procedimiento:
Se incuban a 37°C durante un mínimo de 48 horas.
Agregar 6 gotas del reactivo A y luego 2 gotas del reactivo B. Agitar suavemente el tubo y dejar
reposar durante unos 15 minutos.
Observar la aparición de un color rosa a rojo que indica la presencia de acetoína (reacción positiva) En
una reacción negativa el medio permanecerá incoloro o amarillo.
 
 
 
[1]
 Microbiología Oral - Liébana
[2]
 Adaptación: Bailey/Scott y Pedreira.
[3]
 Adaptación: Bailey/Scott.
[4]
 Adaptación: Pedreira.
[5]
 Koneman E.W, Alle S.D, Janda W.M, Schreckenberger P.C, Winn, W.C;
 Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology
 
[6]
 Slidex Staph Plusâ es una marca registrada de bioMérieux sa
La técnica descripta en este manual está basada en las instrucciones incluídas en el kit
[7]
 Bailey/Scott.
 
[8]
 Bailey/Scott.
 
[9]
 Pedreira
[10]
 Bailey/Scott.
 
[11]
 Scott/Bailey
[12]
 Visi-Spotâ es una marca registrada de J&S Medical Associates, Inc.
La técnica descripta en este manual está basada en las instrucciones incluídas en el kit.
 
[13]
 Pedreira
[14]
 Bailey/Scott
[15]
 Bailey/Scott
[16]
 Adaptación: Bailey/Scott.