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La reprogramación del metabolismo de la energía celular es una de las características distintivas "emergentes" reconocidos de cáncer humano (Hanahan y Weinberg, 2011 ). Warburg primera observó que, en comparación con las células normales, las células cancerosas han aumentado conversión de glucosa a lactato ( Vander Heiden et al., 2009 ). Debido a que el metabolismo es una actividad fundamental que determina el destino celular, tremendo esfuerzo se ha hecho en las últimas 2 décadas para comprender los mecanismos moleculares que subyacen a su reprogramación en las células cancerosas (DeBerardinis y Thompson, 2012 ). Por ejemplo, el factor inducible por hipoxia 1 (HIF-1) media un interruptor metabólico que desvía metabolitos de glucosa fuera de la mitocondria ( Kim et al., 2006 ). HIF-1 regula la expresión de piruvato deshidrogenasa quinasa 1, que inactiva la piruvato deshidrogenasa, la enzima que cataliza la conversión de piruvato a acetil-CoA para la entrada en el ácido (TCA) ciclo tricarboxílico. La respiración mitocondrial en condiciones de hipoxia prolongada resultados en aumento de la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y muerte celular ( Kim et al., 2006 ). Por lo tanto, la reprogramación metabólica para limitar la actividad del ciclo TCA generación y acetil-CoA es una estrategia adaptativa para las células en el microambiente hipóxico que es característico de los cánceres avanzados. Sin embargo, mientras que la acetil-CoA también es generada por ácidos grasos β-oxidación (FAO), que sigue siendo poco conocida lo adaptaciones pueden ocurrir a la FAO durante la progresión del cáncer.
Se informó de HIF-1 para regular la expresión de la sintasa de ácidos grasos (FASN) y lipin 1 (LPIN1) ( Furuta et al., 2008 , Mylonis et al., 2012 ), que facilitan la síntesis de ácidos grasos (FAS) y el almacenamiento de lípidos, cuales son las respuestas metabólicas de adaptación a la hipoxia ( Menéndez y Lupu, 2007). La hipoxia también se informó a disminuir la FAO en los miocitos cardiacos cultivados ( Huss et al., 2001 ) y en los modelos de la hipertrofia cardiaca en una manera de HIF-1-dependiente ( Krishnan et al., 2009 ). Sin embargo, existe evidencia contradictoria respecto a las consecuencias del catabolismo de ácidos grasos, o la FAO, para la progresión del cáncer ( DeBerardinis et al., 2006 ,Zaugg et al., 2011 ). Obviamente, el papel beneficioso de la FAO para el crecimiento del cáncer puede ser dependiente de contexto, o el cáncer de tipo celular específico, y más amplias investigaciones están garantizados para comprender el efecto de la reprogramación metabólica del cáncer en la FAO.
En este estudio, hemos examinado las células humanas de carcinoma hepatocelular (CHC) para los genes que codifican las enzimas metabólicas de lípidos que están regulados por la hipoxia a través de HIF-1. Presentamos aquí un mecanismo previamente no apreciado por los que HIF-1 suprime la de cadena media (MCAD) y de cadena larga (LCAD) deshidrogenasas acil-CoA reductasa y la FAO para facilitar la progresión del cáncer de diafonía entre las vías metabólicas y de transducción de señales.
Resultados
Hipoxia Suprime la FAO en células de cáncer de Manera HIF-1-dependiente
En primer lugar, investigamos si el estrés hipóxico regula el metabolismo de los lípidos en las células de HCC humanos. Hemos cultivado células HepG2 Hep3B, SK-Hep-1, y bajo nonhypoxic (20% O 2 ) o hipoxia (1% de O 2 condiciones de 48 h). Tinción con rojo Nilo y los triglicéridos (TG) de medición en los lisados ​​celulares revelaron que el estrés hipóxico condujo a la acumulación de lípidos significativa en todas las tres líneas celulares de cáncer ( Figuras 1 A y 1B).Debido a HIF-1 juega un papel importante en la reprogramación inducida por hipoxia del metabolismo de la glucosa en las células cancerosas, el próximo explorado si HIFs están involucrados en el metabolismo lipídico alterado inducida por el estrés hipóxico. Establecimos células Hep 3B expresan de manera estable un control nontargeting (NTC) de ARN de horquilla corta (shRNA) o shRNA orientación HIF-1α, HIF-2α, o ambos (doble caída, DKD) ( Figura 1 C).Regulación a la baja de HIF-1α o HIF-2α o ambos acumulación atenuada la hipoxia inducida por lípidos ( Figuras 1 y 1E D), indicando que tanto HIF-1α y HIF-2α regulan el metabolismo de lípidos en células Hep 3B.
Para hacer frente a los mecanismos que subyacen a la acumulación de lípidos inducida por hipoxia en las células cancerosas, se utilizó una PCR matriz vía centrada en los genes que codifican las enzimas metabólicas de lípidos y de cDNA preparadas a partir de células Hep3B que se cultivaron en condiciones hipóxicas nonhypoxic o durante 36 horas. Basándose en los resultados de la matriz de PCR, se diseñaron cebadores y se realizó la transcripción inversa y PCR cuantitativa en tiempo real para confirmar la expresión de genes que son la hipoxia en el análisis de matriz. Es intrigante que varios genes principales responsables de la síntesis de lípidos y el catabolismo de los lípidos, o β-oxidación, se regula por la hipoxia ( Figura 1 F). Como se informó ( Furuta et al., 2008 , Mylonis et al., 2012 ), se observó la expresión inducida por hipoxia de varios genes que regulan la síntesis de lípidos, incluyendo FASN y LPIN1 .Curiosamente, varios genes del catabolismo de lípidos, especialmente MCAD yLCAD , se downregulated bajo condiciones de hipoxia en las células Hep3B (Figura 1 F), así como en HepG2 y células de cáncer de próstata PC3 ( S1 Figuras A y S1B). Debido MCAD y LCAD son enzimas clave catabolizante el primer paso de la FAO en la mitocondria, nuestra observación de que el estrés hipóxico inhibe dramáticamente MCAD y expresión LCAD sugiere que la FAO es suprimida en las células cancerosas hipóxicas, que podrían contribuir a la acumulación de lípidos inducida por hipoxia.
Para probar nuestra hipótesis, que mide la tasa de uso de la FAO [1- 14 C] ácido -palmitic o [1- 14 C] ácido -oleic en células Hep 3B. La tasa de conversión de ácido palmítico o ácido oleico en forma de metabolitos solubles en ácido (ASM) o CO 2 se midió en condiciones hipóxicas y nonhypoxic, o en presencia de etomoxir, un inhibidor de la FAO. Como era de esperar, etomoxir disminución de los niveles de ASM y CO 2 producidos a partir de [1- 14 C] de ácido -palmitic en células Hep 3B ( Figura 1 G). Curiosamente, los niveles de la ASM y el CO 2producido a partir de ya sea [1- 14 C] ácido -palmitic ( Figura 1 G) o [1- 14 C] ácido -oleic ( Figura 1 H) se inhiben de manera significativa en las células hipóxicas Hep3B. Se observaron resultados similares en SK-Hep-1 ( Figura S1C) y las células PC3 ( Figura S1 D), lo que sugiere que el estrés hipóxico inhibe la FAO en las células cancerosas. Otros estudios utilizando células que expresaban de forma estable Hep3B shRNAs HIFs dirigidos revelaron que, en caída HIF-1α o células DKD, pero desmontables células no HIF-2α, la inhibición inducida por hipoxia de [1- 14 C] ácido -palmitic o [1- 14 C] oxidación de los ácidos -oleic fue atenuada ( Figuras 1 I y 1J), indicando que HIF-1α, pero no HIF-2α, se requiere para la inhibición de la FAO en células Hep 3B hipóxicas.
HIF-1α Suprime la FAO mediante la inhibición de la expresión de MCAD y LCAD
A continuación pregunta si MCAD y LCAD son enzimas claves responsables de la regulación mediada por HIF-1 de la FAO y la reprogramación de los lípidos en las células cancerosas. MCAD y LCAD pertenecen a la familia deshidrogenasa acil-CoA, que también incluye de cadena corta (SCAD) y de cadena muy larga (VLCAD) acil-CoA deshidrogenasas ( Kunau et al., 1995 ). Entre los miembros de la familia, MCAD y LCAD los niveles de proteína se redujo significativamente en condiciones de hipoxia en todas las líneas celulares analizadas, incluyendo Hep3B, SK-Hep-1, y las células HepG2 de HCC, así como cáncer de próstata PC3 y células MCF-7 de cáncer de mama ( Figuras 2 A y S2 A). De la nota, la hipoxia no tienen algunos efectos en la expresión de CPT1A o CPT1c en líneas celulares tales como células MCF-7, comose informó anteriormente ( Zaugg et al., 2011 ). Sin embargo, no observamos esos efectos en las células Hep 3B (Figuras 2 A y S2 A). Por tanto, nos enfocamos en MCAD y LCAD en estudio.
El tratamiento de células Hep 3B con CoCl 2 o la deferoxamina, que son inductores químicos de la actividad de HIF, también inhibió la expresión de MCAD y LCAD de una manera dependiente del tiempo ( Figura S2 B).Desmontables de HIF-1α, pero no HIF-2α, la expresión atenúa el efecto inhibidor de la hipoxia sobre la expresión de MCAD y LCAD mRNA ( Figura 2 B) y la proteína ( Figura 2 C) en células Hep 3B. Derribo de expresión de HIF-1α en SK-Hep-1 o células PC3 tuvo el mismo efecto ( figuras S2 C y S2D). Además, la hipoxia no logró disminuir los niveles de MCAD y LCAD en HIF-1α nocaut fibroblastos embrionarios de ratón (KO-MEF) ( Figura S2 E), que proporcionaron más pruebas de que HIF-1α es fundamental para la regulación a la baja inducida por hipoxia de MCAD y expresión LCAD.
A continuación, se investigó el mecanismo por el que HIF-1α regula a la baja la expresión de MCAD y LCAD, que cataliza el primer paso de la FAO en la mitocondria. Curiosamente, encontramos que la hipoxia redujo significativamente la expresión de PGC-1β, un factor de transcripción que juega un papel crítico en la regulación de la función mitocondrial, en células Hep 3B, así como en HepG2 y células PC3 ( Figuras 2 D y S2 F). Cuando la expresión de PGC-1β fue derribado, MCAD y LCAD ARNm y la expresión de proteínas se suprimieron significativamente en Hep3B ( Figuras 2 E y 2F) y células PC3 ( Cifras S2 G y S2H), lo que sugiere que el PGC-1β está directamente implicada en la regulación transcripcional de MCAD y LCAD, lo cual es consistente con informes anteriores ( Lin et al., 2005 , Espinoza et al., 2010 ). Hemos documentado anteriormente que tanto HIF-1α y HIF-2α inhiben PGC-1β a través de la supresión de c-Myc en células de carcinoma renal RCC4-BVS null ( Zhang et al., 2007 ). Aquí, encontramos que el estrés hipóxico reprimida c-Myc y PGC-1β en Hep3B y células PC3 ( Figura S2 I). Por otra parte, los ensayos de transferencia de Western de células Hep 3B expresan HIF shRNAs revelaron que HIF-1α, pero no HIF-2α, reprimida c-Myc y la expresión de PGC-1β en condiciones de hipoxia (Figura 2 C), que es coherente con nuestra conclusión de que HIF-1α , pero no HIF-2α, MCAD y downregulated expresión LCAD en condiciones de hipoxia. Por otra parte, regulación a la baja de c-Myc por shRNA bloqueó la expresión de PGC-1β, MCAD, y LCAD, mientras que la expresión forzada de c-Myc mejorado su expresión en células Hep 3B ( Figura S2 J). Células P493 inducible por tetraciclina disminución de los niveles de ARNm y proteínas de PGC-1β, MCAD, y LCAD también se observaron en c-Myc-empobrecido ( Figuras S2 K y S2L), confirmando además que c-Myc regula la expresión de PGC-1β, que , a su vez, regula la expresión de MCAD y LCAD. La expresión forzada de c-Myc contrarresta la disminución inducida por hipoxia de PGC-1β, MCAD, y los niveles de proteína LCAD ( Figura 2 G), lo que sugiere que la supresión HIF-1α-mediada de la → eje PGC-1β c-Myc está involucrado en regulación hipóxica de MCAD y expresión LCAD.
Para investigar si MCAD y LCAD están involucrados en la supresión de la FAO HIF-1α-regulado en condiciones de hipoxia, las células Hep3B fueron transfectadas establemente con el control pSIN-GFP vector o vector de codificación MCAD o LCAD o ambos ( Figura 2 J). Análisis de la FAO utilizando [1- 14 C] ácido -palmitic, [1- 14 C] ácido -stearic, [1- 14 C] ácido -oleic, o [1- 14 C] ácido -linoleic reveló que la expresión forzada de MCAD se recuperó producción ASM hipoxia-inhibido de [1- 14 C] ácido -palmitic y [1- 14 C] ácido -stearic (Figuras 2 y H S2 M), mientras que la sobreexpresión LCAD recuperó la producción ASM-hipoxia inhibe de [1- 14 C] ácido -oleic y [1- 14 C] ácido -linoleic (Figuras 2 I y S2 N), proporcionando pruebas de que MCAD y LCAD son objetivos fundamentales para la represión inducida por hipoxia de la FAO. El ácido palmítico y ácido esteárico son ácidos grasos saturados, mientras que el ácido oleico y el ácido linoleico son los ácidos grasos insaturados. Nuestros resultados sugieren que MCAD y LCAD pueden funcionar en saturados e insaturados FAO, respectivamente. Para confirmar esta hipótesis, hemos generado células Hep 3B expresan de manera estable el control shRNA, o shRNAs dirigidos MCAD, LCAD, o ambos ( Figura 2 M). Análisis de la FAO demostró que MCAD caída reprimida principalmente el ácido palmítico y el ácido esteárico tasas de oxidación ( Figuras 2 y K S2 S), mientras que LCAD caída inhibe principalmente el ácido oleico y las tasas de oxidación del ácido linoleico (Figuras 2 L y  S2 P), que confirma nuestra observación que MCAD y LCAD median principalmente ácidos grasos saturados e insaturados de oxidación, respectivamente. Cabe señalar que LCAD caída parece reducir ligeramente ácidos grasos saturados de la oxidación, mientras que MCAD caída también reduce marginalmente insaturado oxidación de ácidos grasos, pero los efectos, obviamente, no son suficientes para alcanzar significación. Tinción con rojo Nilo y mediciones del contenido de TG mostraron que la inhibición de MCAD o LCAD condujo a la acumulación de lípidos ( Figuras S2 Q y S2R). La expresión forzada de ambos MCAD y LCAD disminuyó la acumulación inducida por hipoxia de los lípidos y los Grupos Temáticos en células Hep 3B ( Figuras S2 S y S2T), lo que sugiere que tanto MCAD- y LCAD dependiente de la FAO contribuyeron a la acumulación de lípidos inducida por hipoxia. Cabe señalar que la expresión forzada de MCAD, ya sea solos o LCAD sólo marginalmente reducida acumulación de lípidos inducida por hipoxia y la elevación contenido de TG (Figuras S2 S y S2T), lo que sugiere que la inhibición de tanto saturados e insaturados FAO mediada por MCAD y LCAD, respectivamente, está implicado en la acumulación de lípidos elevada bajo estrés hipóxico.
MCAD y LCAD regular la proliferación celular en la parte al alterar los niveles de ROS
Debido a que hemos confirmado que MCAD y LCAD regulan el metabolismo de los lípidos en las células cancerosas, el próximo investigó el efecto de MCAD o LCAD sobre la proliferación de células de cáncer. Nuestros resultados revelaron que MCAD- o de crecimiento específico de células de cáncer LCAD estimulada por shRNA comparación con el control nontargeting shRNA ( Figuras 3 A-3C).Además, las células que expresan LCAD shRNA parecía tener una mayor ventaja de crecimiento que los que expresan MCAD shRNA ( Figuras 3 B y 3C).Resultados similares se observaron en las células que expresan Hep3B otro shRNA para MCAD o LCAD (shMCAD-2 o shLCAD-2) ( Figura S3 A) y células SK-Hep-1 que expresan MCAD o LCAD shRNA ( figuras S3 B y S3C), lo que sugiere que MCAD y especialmente LCAD poseen efectos supresores de tumor.Sin embargo, la expresión forzada de MCAD, LCAD, o ambos en células Hep 3B no mostró ningún efecto evidente sobre el crecimiento celular bajo condiciones nonhypoxic ( Figura 3 D), mientras que, bajo condiciones de hipoxia, la expresión de LCAD crecimiento celular inhibió significativamente forzado en comparación con GFP-expresando Las células de control Hep3B ( Figuras 3 y E 3F). Aunque la sobreexpresión de MCAD no inhibió el crecimiento celular (Figura S3 D), la expresión simultánea de MCAD y LCAD manifiesta una inhibición más potente de crecimiento de las células que LCAD solo bajo la hipoxia ( Figuras 3 E y 3F).
En la mitocondria, la FAO genera acetil-CoA, que entra en el ciclo de Krebs para generar NADH, que dona electrones a la cadena de transporte de electrones (ETC) que con el tiempo se utilizan por el complejo IV para reducir O 2 a H 2 O.Para investigar si MCAD y LCAD afectar a la proliferación celular mediante la regulación de los niveles de ROS celulares, eliminadores de ROS N-acetil-cisteína (NAC, 5 mM) o glutatión (GSH, 5 mM) se añadieron al medio de cultivo de las células Hep 3B. NAC o GSH eliminan el efecto estimulante leve de MCAD shRNA sobre la proliferación celular( Figuras 3 B y 3C). Curiosamente, a pesar NAC o el tratamiento GSH reducido parcialmente la diferencia en la proliferación entre las células que expresan shLCAD y los que expresan NTC shRNA, las células que expresan shLCAD todavía mostró una ventaja de crecimiento, incluso en la presencia de NAC o GSH ( Figuras 3 B y 3C). Se observaron resultados similares en SK-Hep-1 células ( Figura S3 C). Bajo condiciones de hipoxia, la NAC o GSH también rescatados parcialmente la inhibición del crecimiento causado por la expresión forzada de LCAD ( Figuras 3 y E 3F).Medición celular ROS por diclorofluoresceína (DCF) y la tinción de citometría de flujo de los niveles de ROS reveladas reducida en MCAD o células LCAD desmontables en comparación con el grupo de control en células Hep 3B (figuras 3 G, 3H, y S3 E), así como en SK-HEp 1 células ( Figuras S3 F y S3G).La sobreexpresión de MCAD, LCAD, o ambos no condujo a cambios significativos en los niveles de ROS en condiciones nonhypoxic ( Figura 3 I). Sin embargo, en condiciones de hipoxia, los niveles de ROS se incrementaron significativamente en MCAD- o células que sobreexpresan LCAD, así como en células con coexpresión de MCAD y LCAD ( Figura 3 J). El tratamiento con etomoxir disminuyó los niveles de ROS en células Hep 3B ( Figura S3 E).Tomados en conjunto, estos datos indican que la inhibición de MCAD y LCAD disminuye los niveles de ROS celulares mediante la modulación de la FAO y la respiración mitocondrial. MCAD y LCAD modulan la proliferación celular, en parte, mediante la regulación de la producción de ROS. Las células que sobreexpresan LCAD mostraron una desventaja crecimiento significativo, incluso en la presencia de NAC, lo que sugiere que otros mecanismos más allá de ROS pueden estar involucrados en la regulación de la proliferación celular por LCAD.
Para explorar si MCAD y LCAD regulan la homeostasis energética, que mide el ATP en las células Hep 3B. Desmontables de MCAD o expresión LCAD no tuvo ningún efecto sobre los niveles celulares de ATP ya sea bajo condiciones normales o sin glutamina de cultivo ( Figuras S3 H y S3i). Sin embargo, los niveles de ATP fueron significativamente disminuidos en MCAD o LCAD desmontables células Hep 3B en condiciones libres de glucosa ( Figuras S3 H y S3i), lo que sugiere que la FAO podría llegar a ser una fuente importante de la producción de ATP en células de cáncer en ausencia de glucosa. Consistente con esta observación, cuando la FAO fue inhibida por etomoxir, o reprimida por pérdida de la función de MCAD y LCAD, la captación de glucosa y la producción de lactato aumentó ( Figuras S3 J y S3K), indicando que el metabolismo glicolítico en las células cancerosas se mejora cuando se inhibe la FAO . Por el contrario, la aceleración de la FAO por la co-overexpressing MCAD y LCAD atenúa la captación de glucosa inducida por la hipoxia y la producción de lactato ( figuras S3 y S3M L), lo que indica que aumentar la FAO inhibe el metabolismo glicolítico en las células cancerosas. La hipoxia induce aumento de la captación de glucosa y la producción de lactato por la regulación positiva de la expresión de genes glicolíticos, tales como transportador de glucosa 1 ( GLUT1 ) y lactato deshidrogenasa A ( LDHA ). Sin embargo, ni MCAD ni LCAD regula la expresión de GLUT1 o LDHA ( Figura S3 N; datos no mostrados). En lugar de ello, el ARNm y la expresión de proteínas de transportador de glucosa 2 ( GLUT2 ) aumentaron significativamente en células Hep 3B expresan shRNA MCAD o LCAD focalización ( Figuras S3 N y S3O), lo que sugiere que MCAD y LCAD pueden afectar a la captación de glucosa y el metabolismo glicolítico mediante la regulación de la expresión de GLUT2. Sin embargo, aunque nuestros datos que demuestran la regulación de GLUT2 por MCAD y LCAD podría proporcionar un mecanismo de retroalimentación para mejorar la captación de glucosa para la producción de ATP cuando se suprime la FAO, por desgracia, no podría explicar el efecto diferencial de MCAD frente LCAD sobre la proliferación de células de cáncer.
El agotamiento de LCAD promueve la progresión de las células cancerosas mediante la Reducción de PTEN
El efecto diferencial entre MCAD y LCAD sobre la proliferación de células de cáncer nos llevó a buscar más lejos para otros mecanismos más allá de ROS y ATP. Nuestros datos indicaron que MCAD media principalmente oxidación del ácido palmítico (C16: 0) y ácido esteárico (C18: 0) ( Figuras 2 H, 2K, S2 M, y S2O), mientras que LCAD media la oxidación del ácido oleico (C18: 1) y el ácido linoleico (C18: 2) ( Figuras 2 I, 2L, S2 N, y S2P). Se ha informado de que los ácidos grasos insaturados, incluyendo el ácido oleico y el ácido linoleico, facilitan la proliferación celular mediante la inhibición de la transcripción de laPTEN gen supresor de tumor en HCC ( Vinciguerra et al., 2009 ). Derribo de LCAD, pero no MCAD, disminuyó significativamente ARNm PTEN y la expresión de proteínas en células Hep 3B ( Figuras 4 A y 4B). La fosforilación de la serina 473 (S473) en la AKT fue significativamente mayor de desmontables de LCAD, pero sólo aumentó marginalmente por MCAD desmontables ( Figura 4 B), lo que indica que AKT fue activado por la represión PTEN en las células con la pérdida de la función LCAD. Para abordar adicionalmente si PTEN está implicado en la proliferación de células de cáncer LCAD regulada, overexpressed PTEN en LCAD desmontables células, que tienen bajos niveles de PTEN endógeno (Figura 4 C). La expresión forzada de PTEN disminuyó la ventaja de crecimiento de las células desmontables LCAD ( Figura 4 D), lo que demuestra que se requiere para la represión PTEN aumento de la proliferación en las células con pérdida de expresión LCAD.
Dado que el estrés hipóxico inhibe la expresión LCAD e induce la acumulación de lípidos (que incluyen tanto ácidos grasos saturados e insaturados), A continuación analizaron la expresión de PTEN y la activación de AKT bajo estrés hipóxico. Los resultados mostraron que la hipoxia conduce a la supresión de la expresión de PTEN y la activación de la fosforilación de AKT S473, que se invierte por la expresión forzada de LCAD ( Figura 4 E). Para confirmar aún más que la vía de PTEN está implicado en la inhibición inducida por LCAD-de la proliferación celular, derribaron PTEN en LCAD-overexpressing células Hep 3B (Figura 4 F). Western blot resultados demostraron que la regulación a la baja de PTEN contrarrestado el efecto inhibidor de la fosforilación de AKT en LCAD en condiciones de hipoxia ( Figura 4 F). Más importante aún, derribando PTEN disminuye el efecto inhibidor de LCAD sobre la proliferación celular bajo estrés hipóxico ( Figura 4 G), demostrando además que PTEN es necesario para la regulación de la proliferación celular por LCAD. La adición de ácido oleico, pero no el ácido palmítico, en medios de cultivo celular inhibieron la expresión de PTEN y mejorados S473 fosforilación de AKT en las células Hep 3B hipóxicas (Figura 4 F). La adición de ácido oleico también contrarresta el efecto inhibidor de LCAD sobre la proliferación celular ( Figura 4 H), lo que sugiere que la disminución de los niveles de ácido oleico son responsables de la inhibición del crecimiento celular en células con sobreexpresión LCAD. Puesto que el ácido oleico y ácido palmítico difieren tanto con respecto a la saturación y la longitud de la cadena de carbono, hemos diseñado experimentos para determinar si la saturación o la longitud de cadena de los ácidos grasos afecta a la expresión de PTEN y el crecimiento celular. Ambos blot y el crecimiento celular curvas occidentales mostraron que los ácidos grasos insaturados sólo tales como ácido oleico (C18: 1) y ácido palmitoleico (C16: 1) de ácido esteárico, pero no saturado (C18: 0) o ácido palmítico (16: 0), PTEN expresión inhibida y estimuló el crecimiento celular en células Hep 3B ( S4 Figuras A y S4b). Tomados en conjunto, nuestros resultados indican que, además de ROS, LCAD, pero no MCAD, también inhibe la proliferación celular en condiciones de hipoxia a través de aumentode la expresión de PTEN.
LCAD suprime el crecimiento tumoral in vivo
Análisis de xenoinjertos de ratón utilizando células Hep 3B que expresa de forma estable shRNA orientación LCAD o MCAD mostró que desmontables de LCAD, pero no MCAD, el volumen del tumor significativamente mayor ( Figuras 5 A y 5B) y la masa ( Figura S5 A) en comparación con el grupo de control nontargeting . Consistente con los datos in vitro, lisados ​​de tejidos tumorales reveló que los tumores generados a partir de células LCAD caída, pero no los de desmontables células MCAD, tenían una menor expresión de PTEN y elevado la fosforilación de AKT en S473 ( Figura 5 C). Por otro lado, la expresión de LCAD forzado, pero no MCAD, el volumen del tumor marcadamente reducida ( Figuras 5 F y 5G) y la masa ( Figura S5 B), lo que indica que LCAD, pero no MCAD, es crítica para la regulación del crecimiento tumoral. Expresión de PTEN mejorada y reducido la fosforilación de AKT se observaron en los tumores generados a partir de células que sobreexpresan LCAD ( Figura 5 H). Tinción de aceite rojo O de secciones congeladas y TG medición del contenido en lisados ​​de tejido reveló que downregulation de MCAD- o la acumulación de lípidos LCAD estimulada ( Figuras 5 D y 5E), mientras que la sobreexpresión de MCAD o LCAD disminuyeron el almacenamiento de lípidos en comparación con el grupo de control ( Figuras 5 I y 5J), que son consistentes con los datos de los experimentos in vitro. Además, estos datos son consistentes con los informes de que los ratones previamente MCAD- o LCAD deficientes tienen acumulación anormal de lípidos en el hígado ( Kurtz et al., 1998 , Tolwani et al., 2005 ).
Expresión Disminución LCAD en HCC predice la mortalidad de los pacientes
Análisis de la proliferación celular y el crecimiento in vitro del tumor in vivo indicado que LCAD tiene un efecto supresor de tumor. Para investigar la importancia fisiológica de esta vía de reglamentación, la expresión LCAD también se estudió en 20 pares de lesiones HCC y muestras de tejidos no cancerosos adyacentes. Entre las deshidrogenasas-acil-CoA reductasa, sóloLCAD niveles de mRNA se redujeron en las lesiones de HCC, en comparación con el tejido normal adyacente (significativamente la Figura 6 A). Aunque MCADexpresión está disminuida por el estrés hipóxico en células cultivadas, no observamos ninguna diferencia significativa en la expresión de ARNm entre las lesiones de CHC y el tejido normal adyacente ( Figura 6 A). Además, ensayos de Western blot mostraron disminución de PGC-1β, LCAD, los niveles de proteína PTEN y aumento de los niveles de HIF-1α y la fosforilación de AKT en el tejido HCC, en comparación con el tejido normal adyacente ( Figura 6 B).
A continuación, se utilizó la inmunohistoquímica (IHC) para analizar la expresión LCAD en una cohorte retrospectiva de 158 casos de CHC clínicopatológicamente caracterizadas, incluyendo diez casos de estadio I (6,3%), 106 casos de la etapa II (67,1%), 33 casos de estadio III ( 20.9%), y nueve casos de la etapa IV (5,7%) de cáncer de hígado, con base en la estadificación TNM ( Tabla S1 ). IHC resultados revelaron que la proteína LCAD se expresa abundantemente en el hígado normal, débilmente expresado en las primeras etapas de HCC (estadios TNM I y II) y apenas detectable en la fase tardía de HCC (TNM estadios III y IV) ( Figura 6 C). Análisis de la imagen de la IHC reveló que la expresión LCAD en tumores primarios en estadio I-IV clínicos se redujo significativamente en comparación con el hígado normal ( Figura 6 D).Por otra parte, LCAD se downregulated drásticamente en la última etapa de HCC (estadios III y IV), en comparación con las primeras etapas de HCC (estadios I y II) ( Figura 6 D; Tabla S2 ), lo que sugiere que la expresión LCAD fue gradualmente disminuyó a medida que avanzó a HCC una etapa clínica superior.Además, el análisis de Spearman reveló correlaciones entre la expresión y las características clínico-patológicas LCAD pacientes, incluyendo el tiempo de supervivencia, el estado vital, estadio clínico, y el tamaño del tumor ( Tabla S3), lo que sugiere, además, una fuerte asociación de la expresión LCAD con HCC estadificación clínica y la supervivencia del paciente. El análisis univariado reveló que, junto con el estadio TNM y el tamaño del tumor, el nivel LCAD es un factor pronóstico importante. El análisis multivariado demostró también que la expresión LCAD y estadificación TNM clínica son predictivos de la supervivencia global de los pacientes con HCC ( Tabla S4 ). Por último, la prueba de Kaplan-Meier indicó que la expresión LCAD en pacientes con HCC se asoció significativamente con el tiempo de supervivencia, con los pacientes que expresan altos LCAD en sus lesiones HCC sobrevivir mucho más tiempo que aquellos con baja expresión LCAD ( Figura 6 E), lo que sugiere que la proteína puede representar LCAD un biomarcador de pronóstico prometedor en HCC.
Discusión
Hay un reconocimiento creciente de que las células del cáncer generalmente se someten a la reprogramación metabólica completa, que por lo general permite un rápido crecimiento y permitir la adaptación al microambiente tumoral (DeBerardinis et al., 2008 ). HIFs han sido intensamente investigado por su participación en la reprogramación metabólica ( Semenza, 2010 ). Sin embargo, mientras que la regulación hipoxia y HIF-dependiente de la glucólisis, glutaminolysis, y la síntesis de lípidos se ha demostrado ( Kim et al., 2006 ,Furuta et al., 2008 , Metallo et al., 2012 ), el efecto de la hipoxia y HIFs en la FAO en las células de cáncer no había sido claramente dilucidado. En este sentido, es importante que establezcamos aquí un mecanismo previamente no apreciado por los que HIF-1 suprime deshidrogenasas acil-CoA reductasa y la FAO en las células hipóxicas para facilitar la progresión del cáncer. Es interesante observar que, mientras que se observó un papel similar para ambos HIF-1 y HIF-2 en la causa de la acumulación de lípidos en las células cancerosas hipóxicas ( figuras 1 D y 1e), sólo HIF-1 suprime la expresión de la acil-CoA deshidrogenasas y FAO ( Figuras 1 I, 1J, y 2 C), destacando la superposición pero diferencial roles para HIF-1 y HIF-2 en la regulación de metabolismo de los lípidos de las células cancerosas.
Se ha documentado recientemente que la síntesis de lípidos está regulada por el estrés hipoxia en las células cancerosas ( Anastasiou y Cantley, 2012 ).También se observó el aumento de la expresión de genes para FAS en células de HCC ( Figura 1 F). La proliferación de las células cancerosas requieren para la síntesis de los lípidos de la membrana celular y otras funciones esenciales.Las células cancerosas generalmente adoptan una estrategia de síntesis de lípidos de novo en lugar de uso de lípidos almacenados, y, como resultado, la acumulación de gotitas de lípidos se observa comúnmente en las células cancerosas ( Kuhajda, 2000 ). Por lo tanto, sería de esperar una reducción del catabolismo de los lípidos en las células cancerosas para mantener la proliferación celular rápida. Sin embargo, los últimos resultados de varios grupos no parecían estar de acuerdo con esta expectativa. En contraste, los roles prosurvival se han reportado para la FAO en diversas condiciones ( DeBerardinis et al., 2006 , Zaugg et al., 2011 ). Es interesante que nos demuestran que, mientras que la FAO mejorada en condiciones de normoxia no afecta el crecimiento de células cancerosas, es perjudicial en condiciones de hipoxia. Por lo tanto, suponemos que las observaciones anteriores de la FAO como beneficiosos para la proliferación del cáncer pueden ser dependientes del contexto o tipo de célula específica del cáncer, como se ha demostrado por diferentes consecuencias de la alteración de la FAO reportados por diferentes grupos ( DeBerardinis et al., 2006 , Zaugg et al., 2011 ). Es importante destacar que, al menos en las múltiples líneas celulares de cáncer estudiados aquí, aportar pruebas claras que demuestran que la supresión mediada por HIF-1α de la FAO es beneficioso parala proliferación del cáncer a través de reducción de la producción de ROS, la expresión mejorada Glut2 y la glucólisis, y la activación de la señalización de cáncer prosupervivencia ( la Figura 7 ).
Fue sorprendente que la expresión de LCAD pero no MCAD era supresora de crecimiento del cáncer. LCAD y MCAD tanto catabolizan el primer paso de la FAO en la mitocondria, pero difieren, de acuerdo con las definiciones originales, en la longitud de la cadena de sus sustratos de ácidos grasos. Sin embargo, LCAD también se conoce para mediar en la oxidación de ácidos grasos insaturados, mientras que MCAD prefiere saturado ácidos grasos como sustratos. Como resultado, sólo la pérdida de LCAD, pero no MCAD, dará lugar a la acumulación de ácidos grasos insaturados. Kidwell et al. informado de los requisitos de ácidos grasos insaturados para el crecimiento y la supervivencia de una rata línea celular tumoral mamaria ( Kidwell et al., 1978 ). Los animales alimentados con una dieta alta en ácidos grasos insaturados se encontraron a ser más susceptibles al desarrollo del cáncer ( Bartsch et al., 1999 ). Los ácidos grasos insaturados inhiben PTEN a través de miR-21 la regulación al alza en los hepatocitos ( Vinciguerra et al., 2009 ). Esto nos llevó a formular la hipótesis de que la pérdida de LCAD, pero no MCAD, condujo a la acumulación de ácidos grasos insaturados, que, a su vez, suprimen PTEN, lo que resulta en la progresión del cáncer. De hecho, nuestros resultados confirmaron que sólo los ácidos grasos insaturados ácido oleico y ácido palmitoleico romos expresión PTEN en células cultivadas ( Figura S4 A). Es importante destacar que nuestros resultados in vivo en modelos de xenoinjerto de tumor de ratón demostraron que la pérdida de LCAD, pero no MCAD, dieron como resultado la supresión de PTEN in vivo y el crecimiento tumoral mejorado ( Figuras 5 A-5C). Nuestro descubrimiento establece un mecanismo por el cual reprogramado metabolismo de los lípidos en las células cancerosas promueve la proliferación por la diafonía con vías de transducción de señal.
La acumulación de evidencia clínica sugiere que los trastornos de lípidos están correlacionadas con la incidencia de cáncer. Calle et al. informó que hasta el 20% de todas las muertes por cáncer están relacionadas con la obesidad ( Calle et al., 2003 ). De hecho, las alteraciones de muchos genes relacionados con el metabolismo, tales como IDH1 , IDH2 , FH , SDH , y PKM2 , se han identificado para causar tumores malignos humanos ( Thompson, 2009 ). Por lo tanto, es muy interesante observar que la disminución de la expresión de LCAD llevado a la supresión de PTEN, cuya eliminación o expresión disminuida en el CHC se asoció con un pronóstico pobre ( Vinciguerra y Foti, 2008 ), lo que sugiere un papel supresor de tumores malignos en LCAD humanos. Entre los miembros de la familia de acil-CoA deshidrogenasa, mientras SCAD, MCAD, y VLCAD están implicados en los trastornos humanos heredado de la oxidación de ácidos grasos ( Lea et al., 2000 ), no hay ningún informe similar que implica LCAD en cualquier enfermedades humanas, al menos a lo mejor de nuestro conocimiento.Es de destacar que una búsqueda exhaustiva y el análisis de conjuntos de datos disponibles al público nos llevó al descubrimiento de un conjunto de datos Oncomine (enlace de datos: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc = GSE14520 ), en el que la expresión de LCAD fue suprimida exhaustivamente en los cánceres de hígado humano ( Roessler et al., 2010 ). Sin embargo, esas alteraciones nunca habían sido estudiados específicamente. En este sentido, es muy interesante que, además de los resultados de las líneas celulares de cáncer y modelos tumorales de ratón para demostrar el papel de la supresión mediada por HIF-1 de LCAD en la progresión del cáncer, hemos identificado en 158 muestras clínicas de HCC que la pérdida de LCAD se correlaciona con mal pronóstico clínico de HCC. Por lo tanto, nuestro descubrimiento en este estudio es de gran importancia para los cánceres humanos. A pesar de que más esfuerzos están en curso para determinar si las alteraciones en la expresión y actividad LCAD en los hepatocitos son marcadores pronósticos fiables para HCC, es seguro predecir que la comprensión de los mecanismos moleculares que regulan el metabolismo de los lípidos en las células cancerosas y su conexión con las vías de transducción de señales activadas que promueven proliferación de las células del cáncer y la supervivencia proporcionarán oportunidades para diseñar nuevas estrategias terapéuticas para aprovechar tumores malignos humanos.
Agradecimientos
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La reprogramación del metabolismo de la energía celular es una de las características distintivas 
"emergentes" reconocidos de cáncer humano (
Hanahan y Weinberg, 2011
 
).
 
Warburg primera 
observó que, en comparación con las células normales, las células cancerosas han aumentado 
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Vander Heiden et al., 2009
 
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reprogramación en las células cancerosas (
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Por ejemplo, el 
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1 para regular la expresiσn de la sintasa de αcidos grasos (FASN) y lipin 1 
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respecto a las consecuencias del catabolismo de αcidos grasos, o la FAO, para la progresiσn del 
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Obviamente, el papel beneficioso de la 
FAO para el crecimiento del cαncer puede ser dependiente de contexto, o el cαncer de tipo celular 
especνfico, y mαs amplias investigaciones estαn garantizados para comprend
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La reprogramación del metabolismo de la energía celular es una de las características distintivas 
"emergentes" reconocidos de cáncer humano (Hanahan y Weinberg, 2011 ). Warburg primera 
observó que, en comparación con las células normales, las células cancerosas han aumentado 
conversión de glucosa a lactato ( Vander Heiden et al., 2009 ). Debido a que el metabolismo es 
una actividadfundamental que determina el destino celular, tremendo esfuerzo se ha hecho en las 
últimas 2 décadas para comprender los mecanismos moleculares que subyacen a su 
reprogramación en las células cancerosas (DeBerardinis y Thompson, 2012 ). Por ejemplo, el 
factor inducible por hipoxia 1 (HIF-1) media un interruptor metabólico que desvía metabolitos de 
glucosa fuera de la mitocondria ( Kim et al., 2006 ). HIF-1 regula la expresión de piruvato 
deshidrogenasa quinasa 1, que inactiva la piruvato deshidrogenasa, la enzima que cataliza la 
conversión de piruvato a acetil-CoA para la entrada en el ácido (TCA) ciclo tricarboxílico. La 
respiración mitocondrial en condiciones de hipoxia prolongada resultados en aumento de la 
generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y muerte celular ( Kim et al., 2006 ). Por lo 
tanto, la reprogramación metabólica para limitar la actividad del ciclo TCA generación y acetil-CoA 
es una estrategia adaptativa para las células en el microambiente hipóxico que es característico de 
los cánceres avanzados. Sin embargo, mientras que la acetil-CoA también es generada por ácidos 
grasos β-oxidación (FAO), que sigue siendo poco conocida lo adaptaciones pueden ocurrir a la 
FAO durante la progresión del cáncer. 
Se informó de HIF-1 para regular la expresión de la sintasa de ácidos grasos (FASN) y lipin 1 
(LPIN1) ( Furuta et al., 2008 , Mylonis et al., 2012 ), que facilitan la síntesis de ácidos grasos (FAS) 
y el almacenamiento de lípidos, cuales son las respuestas metabólicas de adaptación a la hipoxia 
( Menéndez y Lupu, 2007). La hipoxia también se informó a disminuir la FAO en los miocitos 
cardiacos cultivados ( Huss et al., 2001 ) y en los modelos de la hipertrofia cardiaca en una manera 
de HIF-1-dependiente ( Krishnan et al., 2009 ). Sin embargo, existe evidencia contradictoria 
respecto a las consecuencias del catabolismo de ácidos grasos, o la FAO, para la progresión del 
cáncer ( DeBerardinis et al., 2006 ,Zaugg et al., 2011 ). Obviamente, el papel beneficioso de la 
FAO para el crecimiento del cáncer puede ser dependiente de contexto, o el cáncer de tipo celular 
específico, y más amplias investigaciones están garantizados para comprender el efecto de la 
reprogramación metabólica del cáncer en la FAO.