Tesis Doctoral Burgan, Julia Estudio de fagos codificantes de toxina Shiga

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Doctorado en Ciencia Animal 
 
Tesis 
 
Estudio de fagos codificantes de toxina Shiga subtipo 2a 
presentes en aislamientos nativos de Escherichia coli 
 
Por: Julia Burgán 
 
Facultad 
de 
Ciencias Veterinarias 
U.N.C.P.B.A. 
 
2019
Doctorado en Ciencia Animal 
 
Tesis 
 
Estudio de fagos codificantes de toxina Shiga subtipo 2a 
presentes en aislamientos nativos de Escherichia coli 
 
Por: Julia Burgán 
 
Facultad de Ciencias Veterinarias 
U.N.C.P.B.A. 
Director: 
Dra. Paula M.A. Lucchesi 
Codirector: 
Dra. Alejandra Krüger 
 
Miembros de jurado: 
Dra. Maria T. Muniesa Pérez 
Dr. Raúl R. Raya 
Dra. Sandra E. Peréz 
 
 
 
 
Tandil, julio de 2019
Agradecimientos 
Llegó el momento de los agradecimientos y pienso… ¡Qué lindo es tener motivos para dar 
las gracias! Es la clara evidencia de que no estamos solos. Y sin dudas, son muchas las personas 
que me han estado acompañando a lo largo de estos casi 5 años. Algunas desde cerca, otras 
desde más lejos, cada una desde su lugar y a su manera, pero todas tan importantes y necesarias. 
Gracias a la Facultad de Ciencias Veterinarias (UNCPBA), a la Comisión de Doctorado y 
la Secretaría de Posgrado por brindarme el lugar de trabajo. Gracias a las entidades que 
financiaron el desarrollo de esta tesis y mi beca doctoral: CONICET, FONCYT, SECAT-
UNCPBA, CIVETAN. 
Gracias a Federico Prada, que fue quien me contactó con mi directora. Gracias por esas 
clases alucinantes en las que demostrabas vocación por tu trabajo, transmitías y contagiabas 
entusiasmo por la investigación. 
Gracias a mis directoras, Paula y Alejandra, que desde el principio confiaron en mí sin 
conocerme. Gracias por la enseñanza y la dedicación. Gracias por todo su apoyo, tanto en lo 
profesional como en lo personal, y por su calidez humana y su acompañamiento dentro y fuera 
del ámbito académico. 
Gracias a todo el grupo del Laboratorio de Inmunoquímica y Biotecnología, gracias por 
todo lo compartido y por hacer que el laboratorio funcione. Gracias, en especial, a “las pibas del 
lab”, para ellas va dedicado un párrafo aparte. Gracias a la gente de “boxes” y abrazo de gol para 
las chicas de fútbol. 
A “las pibas del lab”, Jime, Juli G., Juli R., Ro y Vicky, definitivamente no imagino estos 5 
años sin ustedes. Totalmente agradecida de que la vida nos haya puesto en el mismo camino. 
Muchas gracias amigas por todo lo vivido: las risas y los llantos, el trabajo y las juntadas extra 
laborables, los chistes y el mal humor, las peleas y las reconciliaciones, la felicidad y los 
corazones rotos. Gracias Jime por escucharme siempre, por tu comprensión y por tus mates que 
reconfortan. Gracias Juli G. por esas charlas mágicas y los abrazos que reinician. Gracias Juli R. 
por los viajes, las salidas y los partidos compartidos. Gracias Ro por tus consejos de hermana 
mayor y por tus “vamos a comprar caramelos”, muy necesarios para remontar las tardes. Y 
gracias Vicky, por tu buen humor, desde tempranito camino al campus cantando bien arriba y 
siguiéndome en todas las pavadas. 
Gracias a mis amigos de toda la vida, “el surtido” como nos autodenominamos. Gracias 
por las llamadas, que pueden durar desde unos pocos segundos hasta vaaaarios minutos, por los 
mensajes a cualquier hora, por las palabras justas en los momentos indicados. Gracias, porque a 
pesar de la distancia, siempre encontramos la manera de estar cerca. 
Gracias a mi familia. Gracias a mis abuelas y a mis tías, por todo su cariño y por 
malcriarme más que nadie. Gracias a mi hermano, por sus consejos y opiniones tan importantes 
para mí. Una vez me dijiste “Gorda, vos vas a lograr cualquier cosa que te propongas”… y yo te 
creí, ¡gracias mi gordu! Y por último, gracias infinitas a mis viejos, por ellos soy quien soy. 
Gracias por darme siempre la libertad para elegir y apoyarme incondicionalmente en todas mis 
decisiones. 
Resumen 
Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) es un microorganismo que coloniza el 
tracto intestinal de los animales y causa en el hombre diarreas y graves enfermedades, entre ellas, 
el síndrome urémico hemolítico (SUH). El SUH es una afección severa que afecta con mayor 
frecuencia a niños menores de 5 años. En niños y adolescentes representa una de las principales 
causas de insuficiencia renal aguda y crónica, y es el responsable de una importante proporción 
de los trasplantes de riñón. Es una enfermedad para la cual no existe tratamiento específico y, en 
los casos más graves, puede derivar en la muerte del paciente. Argentina presenta la mayor 
incidencia de SUH a nivel mundial. 
El ganado bovino es reconocido como el principal reservorio de STEC, y el consumo de 
alimentos derivados contaminados, como la principal vía de transmisión a humanos. El contacto 
directo con animales portadores, y su entorno, y el contacto persona a persona son otras fuentes 
importantes de contagio. 
Varios factores de virulencia han sido descriptos para estas bacterias, pero no se conocen 
cuáles son las características que definen con certeza a una cepa STEC con capacidad de 
producir enfermedad grave. El mecanismo de patogenicidad común a todas y que juega un papel 
esencial en el desarrollo de SUH, es la producción de toxina Shiga (Stx). Diversos subtipos de 
Stx han sido descriptos y asociados a distintos riesgos de desarrollar enfermedades. El subtipo 
Stx2a es el mayormente asociado a SUH. 
Dentro del genoma bacteriano, los genes stx se encuentran codificados en bacteriófagos 
temperados, denominados fagos Stx. Estos fagos, que muestran una gran diversidad, desempeñan 
un rol fundamental en la patogénesis de STEC: influyen en la expresión de stx, y durante la lisis 
bacteriana, producto de la inducción de los profagos, se produce la liberación de estas toxinas. 
Estos fagos también desarrollan un importante papel en la propagación y transferencia de 
genes de virulencia y, como consecuencia, en la formación de cepas patógenas emergentes. 
Se han identificado más de 400 serotipos de STEC y alrededor de 100 han sido asociados a 
enfermedad en humanos. En la mayoría de las infecciones el serotipo involucrado es O157:H7. 
Sin embargo, en la actualidad existen a nivel mundial muchos casos de enfermedad causados por 
cepas de otros serotipos. 
El objetivo general de esta tesis fue caracterizar los fagos codificantes de stx2a presentes en 
cepas STEC de distintos serotipos aisladas en Argentina. Para ello se propuso resubtipificar las 
cepas, caracterizar regiones involucradas en la regulación del ciclo lítico de los fagos, cuantificar 
los niveles de expresión y de inducción de profagos Stx2a y comparar los resultados obtenidos 
de acuerdo a distintas particularidades de los fagos y de las cepas portadoras. También se evaluó 
el comportamiento de un mismo fago en diferentes entornos bacterianos. 
En cuanto a la resubtipificación, todas las cepas previamente caracterizadas como 
portadoras del subtipo vt2EDL933 fueron positivas para stx2a. Las cepas que además portaban el/los 
subtipo/s vt2vha y/o vt2vhb se resubtipificaron como positivas para stx2c y las cepas que presentaban 
el subtipo vt1EDL933, fueron positivas para stx1a. 
En la mayoría de las cepas se confirmó la proximidad del gen ninG a stx2 y la presencia del 
alelo q933, solo o en combinación con el alelo q21. De las cepas negativas para ninG, una fue 
positiva para el alelo qO111 y el resto negativas para los 3 alelos de q estudiados. En general, las 
cepas que presentaron el alelo q933 portaban el subtipo stx2a y las positivas para los alelos q933 y 
q21, portaban stx2a y stx2c. Si bien esta asociación entre subtipos de stx y alelos de q ya ha sido 
observada en otros trabajos, no es una asociación exclusiva. En cuanto al alelo qO111, se encontró 
en una cepa genotipo stx1a/stx2a. 
Los niveles de expresión de stx2a detectados entre las cepas fueron heterogéneos, tanto en 
condiciones basales como inducidascon mitomicina C, y se encontraban dentro de los órdenes 
de magnitud reportados por otros grupos de trabajo. Sólo en una de las cepas O145:H- de origen 
humano no se detectó expresión en ninguna de las condiciones. En la mayoría de las cepas 
tratadas con mitomicina C la expresión de stx2a fue mayor respecto a la expresión basal, con la 
excepción de una cepa O91:H21 y la O113:H21, ambas aisladas de alimentos, que mostraron una 
expresión similar en ambas condiciones. 
Mediante el método de la capa doble de agar se detectó producción de partículas infectivas 
de fagos en la mayoría de las cepas analizadas. Los títulos de fagos con mitomicina C 
aumentaron en un rango de entre 1 y 3 órdenes de magnitud con respecto a los títulos fagos 
inducidos de manera espontánea Algunos fagos produjeron placas de lisis turbias, difíciles de ver 
y poco definidas. En una cepa O26:H11 y en dos O157:H7, se evidenciaron por hibridación 
placas de lisis no detectadas visualmente. Por qPCR, los niveles de inducción de fagos Stx2a 
fueron variables y se encontraban dentro de los órdenes de magnitud reportados por otros 
investigadores. El aumento en la producción de fagos Stx2a con mitomicina C también se 
evidenció en la mayoría de las cepas, en un rango de 1 a 2,5 logs. Las excepciones fueron una 
cepa O91:H21 de bovino, que produjo similares cantidades fagos en ambos estados, y dos cepas 
que no produjeron partículas detectables de fagos Stx2a: otra cepa O91:H21 y la O145:H- que 
tampoco presentó expresión de stx2a. 
En cuanto a la comparación de los resultados teniendo en cuenta diferentes variables, se 
observaron: a) mayor expresión basal de stx2a en las cepas O157:H7 que en las O26:H11, pero en 
respuesta a mitomicina C, mayor incremento en las cepas O26:H11 que en las O145:H- y 
O157:H7; b) mayor incremento de la expresión de stx2a con mitomicina C en las cepas aisladas 
de bovino que en las aisladas de humanos; c) niveles basales de expresión de stx2a inferiores en 
las cepas positivas para q933 que en las positivas para q933 y q21, y en las cepas ninG negativas 
con respecto a las ninG positivas; d) un mayor aumento en la producción de fagos con 
mitomicina C en las cepas que portaban sólo el subtipo stx2a con respecto a las que portaban 
tanto stx2a como stx2c. Por otra parte, se observó una correlación positiva moderada entre los 
niveles de expresión basales e inducidos. Dado que en la bibliografía no se ha observado una 
única tendencia en la asociación entre los niveles de expresión de stx2a y de producción de fagos 
con las distintas características de las cepas, los resultados obtenidos son, en algunos casos, 
similares a los reportados por otros investigadores. 
Tanto en condiciones basales como inducidas con mitomicina C, en los lisógenos 
generados se detectó expresión de stx2a, placas de lisis y producción de Stx. Comparado con los 
resultados obtenidos en cada ensayo con la cepa wild type correspondiente, los niveles de 
expresión estuvieron dentro del mismo orden, la producción de fagos de los lisógenos fue mayor 
y la cantidad de Stx presente en sus sobrenadantes fue igual o ligeramente menor. 
En resumen, se encontró que la mayoría de las cepas, independientemente del serotipo y el 
origen, portaron fagos Stx2a inducibles, mostraron expresión basal de stx2a y aumento en la 
expresión e inducción de profagos por efecto del agregado de mitomicina C. Además, los 
lisógenos obtenidos se comportaron de manera similar a las cepas wild type. Estos resultados 
sugieren que los fagos estudiados aportan características asociadas a una alta virulencia a las 
cepas que los portan, las cuales, en consecuencia y sin importar su serotipo, representan un 
potencial riesgo para la salud humana. Las características observadas de los fagos Stx2a 
presentes en las cepas circulantes en nuestra región, aisladas tanto de bovinos como de humanos, 
podrían contribuir a la alta incidencia de enfermedad observada. 
 
Abstract 
Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) is a pathogenic microorganism that can 
colonize the gastrointestinal tract of animals, causing diarrhea and severe diseases such as 
hemolytic uremic syndrome (HUS) in humans. HUS is a severe condition that mainly affects 
children under 5 years old. In children and teenagers it is the most important cause of acute and 
chronic renal failure, and is responsible for a significant percent of kidney transplants. There is 
no specific therapy for this disease and in some cases it can lead to death. Argentina has the 
highest incidence of HUS worldwide. 
Cattle are the main reservoir of STEC, and bovine-derived products are the main source of 
infection. Contact with animals carrying STEC, and their environment and person-to-person 
contact are other important modes of transmission. 
Several virulence factors have been described for these bacteria, but the characteristics that 
certainly define a STEC strain able to produce severe disease are not known. The pathogenicity 
mechanism common to all STEC, which is directly related with the development of HUS, is 
Shiga toxin (Stx) production. Several subtypes of Stx have been described and associated with 
different risks of disease development. Stx2a is subtype the most frequently associated with 
HUS. 
The stx genes are generally carried by phages whose genomes are integrated into the 
bacterial chromosome. These phages, called Stx phages, play an important role in the 
pathogenesis of STEC not only because stx expression is under the control of phage promoters, 
but also because of toxins release takes place during bacterial lysis caused by phage. 
These phages also play an important role in the spread of stx genes among bacteria and, as 
a consequence, in the generation of emerging pathogenic strains. 
More than 400 STEC serotypes have been identified and around 100 have been associated 
with disease in humans. In most infections the serotype involved is O157:H7. However, there are 
currently many cases of disease caused by strains of other serotypes worldwide. 
The general objective of this thesis was to characterize Stx2a phages present in STEC 
strains of different serotypes isolated from Argentina. For this, it was proposed to re-subtype the 
strains, to characterize regions involved in the regulation of the lytic cycle of phages, to quantify 
stx2a expression and phage production levels and to compare the results obtained according to 
different characteristics of phages and STEC strains. The behavior of one phage in different 
bacterial environments was also evaluated. 
Regarding the re-subtyping, all the strains previously characterized as subtype vt2EDL933, 
were positive for stx2a. The strains that also carried the subtype vt2vha and/or vt2vhb were re-
subtyped as positive for stx2c and the strains that presented the subtype vt1EDL933, were positive 
for stx1a. 
In most of the strains the proximity of the ninG gene to stx2 and the presence of the q933 
allele were confirmed, alone or in combination with the q21 allele. Between the ninG-negative 
strains, one was positive for the qO111 allele and the others were negative for the 3 q alleles 
studied. In general, the strains that presented the q933 allele carried the subtype stx2a and those 
positive for both q933 and q21, carried stx2a and stx2c. Although this association between subtypes 
of stx and q alleles has already been observed in other works, it is not an exclusive association. 
Regarding qO111 allele, it was found in a strain harboring stx1a/stx2a genotype. 
Heterogeneous levels of stx2a expression were detected among the strains, both in induced 
and non-induced conditions, and were in the orders of magnitude reported by other researchers. 
Only one O145:H- strain from human origin did not show detectable stx2a expression in either 
condition. Most strains increased stx2a expression under mitomycin C treatment, with the 
exception of2 strains isolated from food, one O91:H21 and one O113:H21, that showed a 
similar expression both in inducing and non-inducing conditions. 
The presence of phage particles in culture supernatants was detected by the double-agar-
layer method either by visual inspection or hybridization in most of the strains. The phage titers 
increased in the range of 1 to 3 logs under mitomycin C treatment. Some phages produced turbid 
lysis plaques, difficult to see and poorly defined. In one strain serotype O26:H11/O26:H11 and 
in 2 O157:H7 strains, lysis plaques had not been visually detected, but were evidenced by 
hybridization. For qPCR, Stx2a phage induction/production levels were variable and were in the 
orders of magnitude reported by other researchers. The increase of Stx2a phage production with 
mitomycin C was also evident in most of the strains, in a range of 1 to 2.5 logs. The exceptions 
were the O91:H21 cattle strain in which the amount of Stx2a phage particles was practically the 
same in both states, and two strains that did not produce qPCR-detectable Stx2a phage particles: 
another O91:H21, and the O145:H- strain, that had not showed detectable stx2a expression in 
either condition. 
Taking into account the different variables, statistical comparisons revealed: a) basal stx2a 
expression higher in O157:H7 strains than in O26:H11, however, the response to mitomycin C 
was higher in O26:H11 strains than in O145:H- and O157:H7 strains; b) a higher response to 
induction in strains from cattle than in those from humans; c) basal stx2a expression lower in q933-
positive and ninG-negative strains than q933/q21- and ninG-positive strains, respectively; d) 
strains that carried only the subtype stx2a had an increase in the production of phages with 
mitomycin C than those that carried both stx2a and stx2c. Furthermore, Pearson’s coefficient 
between basal and mitomycin C induced stx2a expression levels indicated a moderate positive 
correlation. Due that in the literature it has not been observed a single trend in the association 
between the levels of stx2a expression and phage production according the different 
characteristics of the strains, the results obtained are, in some cases, similar to those reported by 
others researchers. 
Both in basal and with mitomycin C induced conditions, laboratory lysogens expressed 
stx2a and produced lysis plaques and Stx. Comparing the results obtained in each test with its 
corresponding wild type strain, the expression levels were in the same order, the phage 
production of the lysogens was higher and the amount of Stx present in their supernatants was 
equal or slightly lower. 
In conclusion, it was found that most of the strains, regardless serotype and origin, carried 
inducible Stx2a phages, showed basal stx2a expression and increased it expression and phage 
production due to the effect of mitomycin C treatment. In addition, the lysogens obtained 
behaved similarly to the wild type strains. These results suggest that the phages studied can 
contribute to characteristics associated with a high virulence of the strains that carry them, 
which, consequently and regardless of their serotype, represent a potential risk to human health. 
The features observed in these Stx2a phages carried by native strains, isolated from both cattle 
and humans, could contribute to the highest incidence of disease in our region. 
 
 
 
 
Palabras claves 
Escherichia coli productor de toxina Shiga; síndrome urémico hemolítico; expresión de 
stx2a; profagos Stx2a; ciclo lítico. 
Abreviaturas 
° C: grado centígrado 
µg: microgramo 
µl: microlitro 
µm: micrómetro 
µM: micromolar 
ADN: ácido desoxirribonucleico 
ADNc: ácido desoxirribonucleico copia 
ADNdc: ácido desoxirribonucleico doble cadena 
ADNg: ácido desoxirribonucleico genómico 
ADNsc: ácido desoxirribonucleico simple cadena 
ARN: ácido ribonucleico 
ARNdc: ácido ribonucleico doble cadena 
ARNm: ácido ribonucleico mensajero 
ARNsc: ácido ribonucleico simple cadena 
CaCl2: cloruro de calcio 
dNTPs: deoxirribonucleótidos trifosfato 
EDTA: ácido etilendiaminotetraacético 
ELISA: ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas 
g: gramo 
g: fuerza de gravedad centrífuga 
Gb: globotriaosilceramida 
h: hora 
H3BO3: ácido bórico 
HCl: ácido clorhídrico 
kpb: kilopares de bases 
LB: medio de cultivo Luria-Bertani 
M: molar 
mg: miligramo 
MgCl2: cloruro de magnesio 
min: minuto 
ml: mililitro 
mM: milimolar 
N: normal 
NaCl: cloruro de sodio 
NaOH: hidróxido de sodio 
nM: nanomolar 
p/v: peso en volumen 
pb: pares de bases 
PCR: reacción en cadena de la polimerasa 
PEG: polietilenglicol 
qPCR: reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa 
RFLP: polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción 
rpm: revoluciones por minuto 
s: segundo 
SDS: dodecilsulfato sódico 
SOC: caldo súper óptimo con represión por catabolito 
SSC: citrato de sodio salino 
TBE: Tris-Borato-EDTA 
Tris: tris(hidroximetil)aminometano 
U: unidad de actividad enzimática 
UV: ultravioleta 
v/v: volumen en volumen 
 
 
TABLA DE CONTENIDOS 
CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN ....................................................................................... 20 
1.1 Escherichia coli .............................................................................................................. 21 
1.1.1 Escherichia coli productor de toxina Shiga ............................................................ 21 
1.1.1.1 Síndrome urémico hemolítico .......................................................................... 22 
1.1.1.2 Reservorio y transmisión.................................................................................. 22 
1.1.1.3 Serotipos ........................................................................................................... 24 
1.1.1.4 Factores de virulencia ...................................................................................... 25 
1.1.1.4.1 Toxina Shiga ............................................................................................. 25 
1.2 Bacteriófagos.................................................................................................................. 28 
1.2.1 Biología de los fagos ............................................................................................... 28 
1.2.1.1 Estructura ......................................................................................................... 28 
1.2.1.2 Ciclos de vida ................................................................................................... 29 
1.2.1.2.1 Ciclo lítico ................................................................................................. 30 
1.2.1.2.2 Ciclo lisogénico ......................................................................................... 31 
1.2.1.3 Decisión lisis-lisogenia .................................................................................... 31 
1.2.1.3.1 Inducción del profago ................................................................................... 33 
1.2.2 Fagos Stx ................................................................................................................. 33 
1.2.2.1 Inducción de profagos y producción de Stx ..................................................... 34 
1.2.3 Fagos como vectores de virulencia ......................................................................... 36 
1.3 OBJETIVOS .................................................................................................................. 37 
1.3.1 Objetivo general ...................................................................................................... 37 
1.3.2 Objetivos particulares .......................................................................................... 37 
CAPÍTULO II: DISEÑO EXPERIMENTAL ......................................................................39 
2.1 Cepas bacterianas ........................................................................................................... 40 
2.1.1 Cepas de estudio ...................................................................................................... 40 
2.1.2 Cepas hospedadoras ................................................................................................ 40 
 
2.1.3 Cepas de referencia ................................................................................................. 40 
2.1.4 Conservación de las cepas ....................................................................................... 41 
2.2 Identificación de subtipos de stx .................................................................................... 42 
2.2.1 Resubtipificación de cepas ...................................................................................... 42 
2.2.1.1 Condiciones de reacción .................................................................................. 43 
2.3 Caracterización de las regiones de regulación flanqueantes a stx2 ................................ 48 
2.3.1 Condiciones de reacción ......................................................................................... 49 
2.4 Cuantificación relativa de los niveles de expresión de stx2a .......................................... 53 
2.4.1 Condiciones de crecimiento de las cepas ................................................................ 53 
2.4.2 Extracción de ARN ................................................................................................. 53 
2.4.3 Obtención de ADNc ................................................................................................ 53 
2.4.4 Condiciones de qPCR ............................................................................................. 54 
2.4.5 Análisis de los resultados ........................................................................................ 54 
2.4.5.1 Confección de curvas estándares ..................................................................... 54 
2.5 Cuantificación de los niveles de inducción de profagos ................................................ 55 
2.5.1 Condiciones de crecimiento de la cepa hospedadora .............................................. 55 
2.5.2 Condiciones de crecimiento de cepas STEC ........................................................... 55 
2.5.3 Obtención de suspensiones de fagos ....................................................................... 55 
2.5.4 Método de cuantificación en doble capa de agar .................................................... 55 
2.5.5 Detección de fagos Stx2 .......................................................................................... 56 
2.5.5.1 Síntesis de la sonda complementaria a stx2 ...................................................... 56 
2.5.5.2 Transferencia de ADN, hibridación y detección de la sonda ........................... 57 
2.5.6 Cuantificación de fagos Stx2a por qPCR ................................................................ 58 
2.5.6.1 Obtención de ADN fágico ................................................................................ 58 
2.5.6.2 Condiciones de qPCR ...................................................................................... 58 
2.5.6.3 Confección de la curva estándar ...................................................................... 59 
2.5.6.4 Análisis de los resultados ................................................................................. 59 
 
2.5.7 Curvas de crecimiento ............................................................................................. 59 
2.6 Evaluación de un mismo fago en distintas cepas de E. coli ........................................... 60 
2.6.1 Generación de lisógenos ......................................................................................... 60 
2.6.2 Producción extracelular de Stx................................................................................ 60 
2.7 Comparación de los resultados....................................................................................... 62 
CAPÍTULO III: RESULTADOS ......................................................................................... 63 
3.1 Selección y resubtipificación de las cepas de estudio .................................................... 64 
3.2 Características de las regiones flanqueantes a stx2 ......................................................... 68 
3.3 Cuantificación relativa de los niveles de expresión de stx2a .......................................... 70 
3.3.1 Curvas estándares y análisis de los datos ................................................................ 70 
3.3.2 Expresión de stx2a .................................................................................................... 70 
3.3.2.1 Expresión basal ................................................................................................ 70 
3.3.2.2 Expresión inducida por mitomicina C.............................................................. 71 
3.4 Cuantificación de los niveles de inducción de profagos ................................................ 73 
3.4.1 Ensayos en doble capa de agar ................................................................................ 73 
3.4.1.1 Detección de fagos Stx2 ................................................................................... 73 
3.4.2 Cuantificación de fagos Stx2a por qPCR ................................................................ 75 
3.4.2.1 Curva estándar y análisis de los datos .............................................................. 75 
3.4.2.2 Niveles de profagos Stx2a inducidos con mitomicina C ................................. 76 
3.4.3 Curvas de crecimiento ............................................................................................. 77 
3.5 Evaluación de un mismo fago en distintas cepas de E. coli ........................................... 79 
3.5.1 Obtención de lisógenos ........................................................................................... 79 
3.5.1.1 Expresión de stx ............................................................................................... 80 
3.5.1.2 Inducción de profagos ...................................................................................... 80 
3.5.1.3 Producción extracelular de Stx......................................................................... 80 
3.6 Comparación de los resultados....................................................................................... 81 
3.6.1 Niveles de expresión de stx2a .................................................................................. 81 
 
3.6.2 Niveles de inducción de profagos/producción de fagos .......................................... 85 
3.6.3 Expresión de stx2a y producción de fagos por inducción con mitomicina C ........... 86 
CAPÍTULO IV: DISCUSIÓN ............................................................................................. 88 
4.1 Resubtipificación de las cepas ....................................................................................... 89 
4.2 Alelos del gen q .............................................................................................................. 90 
4.3. Producción de fagos y expresión de stx2a ...................................................................... 90 
4.3.1 Serotipo ................................................................................................................... 91 
4.3.2 Origen ...................................................................................................................... 91 
4.3.3 Subtipos de stx2 ....................................................................................................... 92 
4.3.4 Alelos del gen q .......................................................................................................93 
4.3.5 Asociación entre niveles de expresión de stx2 y producción de fagos .................... 94 
4.4 Evaluación de los lisógenos ........................................................................................... 95 
CAPÍTULO V: CONCLUSIONES...................................................................................... 97 
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................... 100 
ANEXO I: Obtención del plásmido recombinante ............................................................ 117 
ANEXO II: Composición de medios y soluciones ............................................................ 120 
ANEXO III: Publicaciones y comunicaciones a congresos ............................................... 123 
 
LISTA DE FIGURAS 
Figura 1. Mapa conceptual que ilustra las posibles vías de transmisión de STEC .............. 24 
Figura 2. Representación esquemática de los fagos Caudovirales ...................................... 29 
Figura 3. Modelo del mapa genético del profago λ ............................................................. 32 
Figura 4. Micrografías electrónicas de fagos Stx de distintas familias ................................ 34 
Figura 5. Esquema de los ciclos lítico y lisogénico de fagos Stx ........................................ 35 
Figura 6. Esquema de regulación de la expresión de stx en los ciclos lítico y lisogénico ... 36 
Figura 7. Esquemas de trabajo para la selección y resubtipificación de las cepas............... 43 
Figura 8. Esquema de localización de primers usados en el análisis de regiones de 
regulación ............................................................................................................................. 48 
Figura 9. Curvas estándares ................................................................................................. 70 
 
Figura 10. Niveles de expresión basal de stx2a ..................................................................... 72 
Figura 11. Niveles de expresión en condiciones de inducción con mitomicina C de stx2a .. 72 
Figura 12. Fotografías de placas de lisis .............................................................................. 74 
Figura 13. Fotografías de la hibridación .............................................................................. 74 
Figura 14. Curva estándar .................................................................................................... 76 
Figura 15. Niveles de inducción de profagos con mitomicina C ......................................... 77 
Figura 16. Curvas de crecimiento en ausencia de mitomicina C ......................................... 78 
Figura 17. Curvas de crecimiento en presencia de mitomicina C ........................................ 78 
Figura 18. Gráfico del ANOVA y prueba de Duncan para la variable serotipo, condición 
basal...................................................................................................................................... 83 
Figura 19. Gráfico del ANOVA y prueba de Duncan para la variable serotipo, condición 
inducida con mitomicina C .................................................................................................. 83 
Figura 20. Gráfico del ANOVA para la variable origen, condición inducida ..................... 84 
Figura 21. Gráfico del ANOVA para la variable genotipo q, condición basal .................... 84 
Figura 22. Gráfico del ANOVA para la variable amplímero ninG-stx2, condición basal .... 85 
Figura 23. Diagrama de dispersión: expresión basal vs expresión inducida ........................ 85 
Figura 24. Gráfico del ANOVA para la variable genotipo stx ............................................. 87 
Figura 25. Diagrama de dispersión: expresión de stx2a vs producción de fagos por respuesta 
a inducción con mitomicina C.............................................................................................. 87 
 
LISTA DE TABLAS 
Tabla 1. Primers utilizados para la identificación de los subtipos de stx ............................ 44 
Tabla 2. Cóctel de PCR para la identificación de stx1a, stx1c y stx1d .................................... 45 
Tabla 3. Cóctel de PCR para la identificación de stx2a ........................................................ 45 
Tabla 4. Cóctel de PCR para la identificación de stx2b ........................................................ 45 
Tabla 5. Cóctel de PCR para la identificación de stx2c y stx2e ............................................. 46 
Tabla 6. Cóctel de PCR para la identificación de stx2d ........................................................ 46 
Tabla 7. Cóctel de PCR para la identificación de stx2f ......................................................... 46 
Tabla 8. Cóctel de PCR para la identificación de stx2g ........................................................ 47 
Tabla 9. Programa de termociclado para la identificación de los subtipos stx1a, stx1c, stx1d, 
stx2a, stx2b, stx2c, stx2d, stx2e y stx2g ......................................................................................... 47 
Tabla 10. Programa de termociclado para la identificación del subtipo stx2f ...................... 47 
Tabla 11. Primers utilizados para la caracterización de las regiones flanqueantes a stx2 .... 49 
 
Tabla 12. Cóctel de PCR para evaluar la proximidad del gen ninG a stx2 ........................... 49 
Tabla 13. Cóctel de PCR para la identificación del gen q933 ............................................... 50 
Tabla 14. Cóctel de PCR para evaluar cercanía del gen q933 a stx2 ...................................... 50 
Tabla 15. Cóctel de PCR para la identificación del gen q21 y evaluar su cercanía a stx2 ..... 50 
Tabla 16. Cóctel de PCR para la identificación del gen qO111 ............................................. 51 
Tabla 17. Cóctel de PCR para evaluar cercanía del gen qO111 a stx2 .................................... 51 
Tabla 18. Programa de termociclado para los pares de primers NinG-526/595 y Q-stx-
f/595 ..................................................................................................................................... 51 
Tabla 19. Programa de termociclado para el par de primers Q-ATG-5’/Q-3’ ..................... 52 
Tabla 20. Programa de termociclado para el par de primers Q21/595 ................................ 52 
Tabla 21. Programa de termociclado para el par de primers SF1-F/SF1-R y SF1-F/595 .... 52 
Tabla 22. Primers utilizados para la cuantificación relativa de la expresión de stx2a .......... 54 
Tabla 23. Primers utilizados para sintetizar la sonda complementaria a stx2 ...................... 56 
Tabla 24. Cóctel de PCR para sintetizar la sonda complementaria a stx2 ............................ 56 
Tabla 25. Programa de termociclado utilizado para sintetizar la sonda complementaria a 
stx2 ........................................................................................................................................ 57 
Tabla 26. Resultados de resubtipificación de cepas ............................................................. 64 
Tabla 27. Resultados de la caracterización de las regiones regulatorias upstream de stx2a . 68 
Tabla 28. Resultados de los ensayos en doble capa de agar e hibridación .......................... 74 
Tabla 29. Resultados de la obtención de lisógenos .............................................................. 79 
Tabla 30. Niveles de producción de toxinas Shiga
a
 ............................................................. 80 
Tabla 31. Comparaciones de los niveles de expresión de stx2a ............................................ 81 
Tabla 32. Comparaciones de los niveles de inducción de profagos ..................................... 86 
 
20 
 
CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN 
21 
 
1.1 Escherichia coli 
Escherichia coli (E. coli) es un bacilo gram negativo, anaerobio facultativo,descripto por 
primera vez en 1885 por el pediatra alemán Theodor Escherich (1857-1911) quien lo aisló de 
heces de niños y lo denominó Bacterium coli commune. Posteriormente recibió el nombre 
Escherichia coli en honor a su descubridor (Kaper, 2005). Taxonómicamente pertenece al orden 
Eubacteriales, familia Enterobacteriaceae, tribu Eschericheae, género Escherichia (Scheutz y 
Strockbine, 2005). 
Es la especie bacteriana predominante de la microbiota normal del aparato digestivo de los 
animales de sangre caliente, incluido el hombre. En los humanos, E. coli coloniza el tracto 
gastrointestinal en las primeras horas de vida y, a partir de entonces, permanece adherida a las 
mucosa del intestino grueso manteniendo una relación de mutuo beneficio con el hospedador 
(Allocati et al., 2013). 
Además de la existencia de E. coli comensales, ciertas cepas de esta especie han adquirido 
factores de virulencia transformándose así en bacterias capaces de causar un amplio espectro de 
enfermedades y trastornos intestinales (Croxen y Finlay, 2010; Kaper et al., 2004). E. coli es de 
esta manera uno de los agentes patógenos más comunes tanto en el hombre como en animales. 
De acuerdo a los factores de virulencia que presentan y los mecanismos por los cuales 
causan infección, estas cepas se clasifican en patotipos. Se han identificado al menos seis 
patotipos asociados con infecciones gastrointestinales: E. coli enteropatogénica (EPEC); E. coli 
enterotoxigénica (ETEC); E. coli productor de toxina Shiga (STEC); E. coli enteroinvasiva 
(EIEC); E. coli enteroagregativa (EAEC) y E. coli de adherencia difusa (DAEC) (Bettelheim, 
2007). Dada la constante evolución de E. coli, nuevos patotipos han emergido, tales como E. coli 
adherente invasiva (AIEC) y E. coli enteroagregativa productor de toxina Shiga (STEAEC o 
EAEC-STEC) (Clements et al., 2012), denominado también E. coli enterohemorrágico 
enteroagregativo (EAHEC) por Brzuszkiewicz et al. (2011). 
 
1.1.1 Escherichia coli productor de toxina Shiga 
El patotipo STEC (o también conocido como VTEC, E. coli productor de verotoxina) se 
caracteriza por su capacidad de producir al menos un tipo de toxina Shiga (Stx). Estas toxinas se 
denominan así debido a la similitud que presentan con las sintetizadas por Shigella dysenteriae, o 
22 
 
también como verotoxinas (VT), porque presentan actividad citotóxica sobre las células de la 
línea Vero (Nataro y Kaper, 1998). 
Dentro del organismo, STEC puede colonizar el tracto intestinal y causar diarreas y graves 
enfermedades tales como colitis hemorrágica (CH) y síndrome urémico hemolítico (SUH) 
(Karmali et al., 1985). 
 
1.1.1.1 Síndrome urémico hemolítico 
El SUH es una afección severa caracterizada por anemia hemolítica, insuficiencia renal 
aguda y trombocitopenia. Esta enfermedad, cuya población más susceptible corresponde a niños 
menores de 5 años y para la cual no existe tratamiento específico, está asociada en la mayoría de 
los casos a infecciones por STEC (Boyer y Niaudet, 2011). La frecuencia de pacientes que 
mueren durante la fase aguda de la infección es del 1-2 % (Mele et al., 2014) y alrededor del 30 
% de los pacientes desarrollan daño renal a largo plazo (Spinale et al., 2013). 
En Argentina el SUH es una enfermedad endémica y la incidencia es la más alta reportada 
a nivel mundial. Según el Boletín Integrado de Vigilancia N° 395 (enero de 2018), para el 
período 2010-2017 se notificaron anualmente entre 300 y 400 casos y la incidencia anual osciló 
entre 6 y 9 casos cada 100.000 niños menores de 5 años de edad. Si bien es una enfermedad de 
notificación obligatoria, se asume que existe un subregistro. La cantidad de casos varía entre las 
diferentes regiones del país y la época del año: la frecuencia es mayor en las provincias del centro y 
sur y aumenta en los meses cálidos (Rivas et al., 2010). El SUH es la principal causa de 
insuficiencia renal aguda y la segunda de insuficiencia renal crónica en pacientes en edad 
pediátrica y el responsable de aproximadamente el 20 % de los trasplantes de riñón en niños 
(Eymann et al., 2016). 
 
1.1.1.2 Reservorio y transmisión 
El ganado bovino es reconocido como el principal reservorio de STEC. La prevalencia de 
STEC en bovinos es muy variable: se han informado prevalencias globales que van de 0 a 71 % 
(Persad y LeJeune, 2014) y en Argentina, de 22 a 67 % (Chinen et al., 2003; Etcheverría et al., 
2016; Etcheverría et al., 2010; Fernández et al., 2009; Masana et al., 2010; Meichtri et al., 2004; 
Mercado et al., 2004; Notario et al., 2000; Padola et al., 2004; Parma et al., 2000; Rivas et al., 
2006; Sanz et al., 1998). Otros rumiantes como ovejas, cabras y ciervos son considerados 
reservorios menores. También hay reportes de aislamientos de STEC de más especies animales, 
23 
 
como cerdos, pollos, conejos, perros, gatos, paloma, entre otros. Sin embargo, si bien estos 
animales son susceptibles a la colonización por STEC, no la mantienen cuando ya no están 
expuestos a una fuente de estas bacterias (Amézquita-López et al., 2014; Colello et al., 2016; 
Persad y LeJeune, 2014). 
Los animales portadores generalmente no presentan síntomas y eliminan la bacteria a 
través de sus heces. De esta forma, la materia fecal se convierte en una importante fuente de 
propagación de STEC tanto en la cadena alimentaria como en el medio ambiente (Fig. 1). La 
bacteria puede llegar a la superficie de las carnes por contaminación con materia fecal durante el 
proceso de faena o su posterior manipulación; la leche cruda puede contaminarse durante el 
ordeñe; las frutas y verduras, por contacto con las heces usada como abono, por riego con aguas 
servidas, por contaminación cruzada durante el almacenamiento o la preparación de los alimentos. 
Así, el consumo de alimentos contaminados es la principal vía de transmisión de este patógeno a 
humanos (Blanco, 2012; Coia et al., 1998; Gyles, 2007; Rivero et al., 2004; Solomon et al., 
2002; Trevena et al., 1999). Por otro lado, el contacto directo con animales portadores y su 
entorno y el contacto persona a persona son otras fuentes importantes de contagio (Gyles, 2007). 
También se han reportado infecciones asociadas al uso de aguas recreativas (Launders et al., 
2013; Luna-Gierke et al., 2014). Además, STEC tiene la capacidad de replicarse y sobrevivir 
prolongadamente en nichos ambientales, aumentando la probabilidad de exposición de la 
población (García et al., 2010). Cabe mencionar que este patógeno presenta una dosis infectiva 
muy baja, de 10 a 100 bacterias por gramo de alimento, lo que propicia la transmisión (Paton et 
al., 1996). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
24 
 
Figura 1. Mapa conceptual que ilustra las posibles vías de transmisión de STEC 
 
Modificado de García et al. (2010) 
 
1.1.1.3 Serotipos 
La técnica gold standar para la clasificación serológica de E. coli es la propuesta por 
Kauffman y se basa en la determinación de los antígenos somáticos de superficie (O), antígenos 
flagelares (H) y antígenos capsulares (K). En la actualidad, este esquema incluye 179 serogrupos 
(definidos por el antígeno O) y un total de 53 antígenos H (Piazza et al., 2010). Los aislamientos 
no móviles (NM) no presentan antígeno flagelar (H-). 
Se han identificado más de 400 serotipos de STEC pero sólo alrededor de 100 han sido 
asociados a enfermedad en humanos (NACMCF, 2017), a este subgrupo se los denomina 
serotipos enterohemorrágicos. Debido a que en la mayoría de las infecciones el serotipo 
involucrado es O157:H7, las cepas suelen clasificarse como O157 o no-O157 (Gyles, 2007). 
Otra clasificación propone agrupar los serotipos de STEC, de acuerdo con la incidencia relativa, 
la frecuencia de asociación con brotes y la asociación con enfermedad severa, en 5 categorías 
denominadas seropatotipos. El seropatotipo A incluye los serotipos considerados más virulentos, 
25 
 
O157:H7 y O157:H-; el B comprendeserotipos causantes de enfermedad grave y brotes, pero 
con menor frecuencia: O26:H11, O103:H2, O111:NM, O121:H19 y O145:NM; el C está 
compuesto por serotipos que con frecuencia son implicados con casos esporádicos de SUH pero 
no asociados con brotes, entre ellos O91:H21 y O113:H21; el D abarca numerosos serotipos 
aislados de casos esporádicos de diarrea y colitis hemorrágica, pero no asociados a SUH y el E 
contiene los serotipos aislados de animales, alimentos, ambiente, no implicados en enfermedades en 
humanos. Es importante tener en cuenta que esta clasificación, si bien es un enfoque útil para 
intentar comprender mejor las diferencias aparentes de virulencia entre serotipos, tiene sus 
limitaciones y debe ser actualizada constantemente (Karmali et al., 2003). Asimismo debe 
tenerse en cuenta que dentro de cada serotipo existe diversidad de combinaciones de factores de 
virulencia. 
En Argentina, el principal serotipo asociado epidemiológicamente a SUH es O157:H7. Sin 
embargo, la frecuencia de otros serogrupos no-O157, como O145, O121 y O26, es también 
importante (Rivas et al., 2010; Zotta et al., 2014). 
 
1.1.1.4 Factores de virulencia 
La virulencia de las cepas STEC es un fenómeno multifactorial y el desarrollo de la 
enfermedad depende de la interacción de diferentes factores de la bacteria, del huésped y del 
ambiente intestinal, pero aún no se conocen con certeza cuáles son los factores e interacciones 
necesarios y suficientes. La comprensión de lo que define a una cepa STEC como patógena para 
los seres humanos ha evolucionado, al igual que los organismos mismos (Kaper y O'Brien, 
2014). Varios factores de virulencia han sido descriptos para STEC. La mayoría de ellos se 
encuentran codificados en elementos genéticos móviles que contribuyen a la variabilidad 
genética de las cepas, como por ejemplo, islas de patogenicidad, plásmidos y profagos (Croxen y 
Finlay, 2010). No obstante, el mecanismo de patogenicidad común a todas las STEC, y que juega 
un papel esencial en el desarrollo de SUH, es la producción de Stx (Kaper y O'Brien, 2014). 
 
1.1.1.4.1 Toxina Shiga 
El estudio en simultáneo de STEC por varios investigadores en diferentes partes del mundo 
derivó en el uso de dos nombres diferentes para las toxinas producidas por estas bacterias. En 
1977, Konowalchuk y sus colegas encontraron que ciertas cepas diarreogénicas de E. coli 
producen una citotoxina que puede matar las células Vero y la denominaron verotoxina (VT). El 
26 
 
mismo año, O'Brien y sus colegas determinaron que ciertas cepas de E. coli producen una 
citotoxina que puede neutralizarse con el mismo suero que se neutralizan las toxinas producidas 
por S. dysenteriae. Esta observación explica el origen de la nomenclatura toxina de tipo Shiga 
(SLT, Shiga-like toxin), en la actualidad, toxina Shiga (Stx). En 1983 se fusionaron los caminos 
de investigación sobre Stx y VT. El grupo de O'Brien informó que la cepa de E. coli O157:H7 
que había provocado un brote de CH en los Estados Unidos, producía una Stx y que era la misma 
VT producida por E. coli O157:H7 observada por otro equipo de investigación. Además, ese 
mismo año Karmali y colaboradores propusieron que la verotoxina producida por estos 
organismos estaba vinculada epidemiológicamente al desarrollo de SUH (Kaper y O'Brien, 2014; 
Scheutz et al., 2012). 
La familia de las Stx comprende un grupo de toxinas que comparten similares estructuras y 
actividad biológica. Son proteínas de estructura AB5: tienen una subunidad A, cuyo dominio A1 
presenta actividad enzimática, y 5 subunidades B idénticas que interactúan específicamente con 
un receptor glicolipídico (Gb3 o Gb4) en las células blanco para la internalización de A1. Este 
domino tiene función de ARN N-glicosidasa, actúa sobre la subunidad 60S del ARN y, en 
consecuencia, inhibe la síntesis de proteínas y puede inducir la apoptosis. Las lesiones renales 
asociadas a SUH se deben a la apoptosis de las células endoteliales (Scheutz et al., 2012; Smith 
et al., 2014). 
Antigénicamente la familia de Stx se divide en dos tipos principales: Stx1 y Stx2. Dentro 
de cada uno de estos dos grupos, diversos subtipos y variantes genéticas han sido descriptos y 
asociados a distintos riesgos de desarrollar enfermedades (Friedrich et al., 2002; Friedrich et al., 
2003; Gyles, 2007; Persson et al., 2007). Stx1 es altamente conservada, muy similar a Stx tipo 1 
producidas por S. dysenteriae y comprende pocos subtipos descriptos en E. coli: Stx1a, Stx1c y 
Stx1d. Stx2 incluye los subtipos Stx2a, Stx2b, Stx2c, Stx2d, Stx2e, Stx2f y Stx2g (Scheutz et al., 
2012). Recientemente, Bai et al. (2018) reportaron la identificación de un nuevo subtipo en cepas 
de E. coli O102:H18 aisladas de marmotas salvajes del Himalaya y lo denominaron Stx2h. 
Epidemiológicamente, Stx2 parece ser más importante en el desarrollo de SUH y se ha 
observado que este grupo tiene un efecto tóxico mayor que Stx1, tanto in vitro sobre células del 
endotelio renal humano, como in vivo en modelos animales (Bielaszewska et al., 2006; Friedrich 
et al., 2002; Fuller et al., 2011; Nakao y Takeda, 2000; Persson et al., 2007). En particular, 
varios estudios sugieren que el subtipo Stx2a se asocia fuertemente a mayor riesgo de desarrollo 
de SUH (Beutin y Martin, 2012; Bielaszewska et al., 2013; De Rauw et al., 2018; Soborg et al., 
2013). 
27 
 
El subtipo stx2a se encuentra con una alta frecuencia en cepas aisladas de pacientes tanto a 
nivel mundial como en Argentina. Se lo ha encontrado presente en cepas de diferentes serotipos 
además de O157:H7, solo o en combinación con otros subtipos (Chui et al., 2015; Friedrich et 
al., 2002; Orth et al., 2007; Persson et al., 2007; Pianciola et al., 2014; Rivas et al., 2006; Tostes 
et al., 2017). En Argentina, Krüger et al. (2011) observaron que las cepas STEC nativas, aisladas 
de bovinos y alimentos, portadoras de este subtipo mostraron los mayores títulos de citotoxicidad 
in vitro, tanto en condiciones basales como inducidos con mitomicina C. 
Tanto para Stx1 como Stx2, sus genes se encuentran codificados en bacteriófagos temperados 
o profagos, generalmente llamados fagos Stx, cuyo genoma se encuentra integrado al genoma 
bacteriano (Kaper et al., 2004; Krüger y Lucchesi, 2015; Lim et al., 2010). 
 
28 
 
1.2 Bacteriófagos 
 Los bacteriófagos, o fagos, son virus que infectan bacterias. El comienzo de la 
investigación de fagos se atribuye a una observación hecha por el inglés Frederick William 
Twort, seguida del trabajo del científico franco-canadiense Félix d’Herelle. En 1915, Twort 
descubrió un pequeño agente que infectaba y mataba las bacterias y sugirió, entre otras opciones, 
que la muerte de las bacterias se debía a un virus que crecía y las destruía. En 1917 d'Herelle 
anunció que había descubierto un microbio invisible y antagónico del bacilo de la disentería, que 
lisaba a las bacterias en el cultivo líquido y, en el medio sólido, generaba placas sobre el agar 
sembrado con bacterias. D’Herelle concibió a estos microbios invisibles como "ultravirus" que 
se propagaban a expensas de las bacterias y por eso los denominó virus bacteriófagos: “que come 
bacterias”. Fue también el primer científico en reconocer el potencial uso terapéutico de estos 
virus (Summers, 2005). 
Los fagos se encuentran en todos los hábitats del mundo donde proliferan bacterias, siendo 
las entidades biológicas más extensamente distribuidas y de mayor diversidad en la biosfera 
(Hendrix, 2003). Estudios hasta la fecha han revelado que los fagos son increíblemente variables 
en propiedades como el rango de hospedadores que infectan, el contenido genético, los 
mecanismos de regulación y efectos fisiológicos. De hecho, la mayoría de sus genes no muestran 
similitud con los disponibles actualmente en las bases de datos. Además, debido al rol que 
desempeñan como diseminadores de información genética, los bacteriófagoscontribuyen 
notablemente a la evolución y diversificación de las poblaciones microbianas, y esto impacta 
directamente sobre la ecología del planeta (McAuliffe et al., 2007). 
 
1.2.1 Biología de los fagos 
1.2.1.1 Estructura 
Los fagos son un grupo heterogéneo. Cada partícula de fago (virión) está compuesta por su 
genoma, en mayor medida almacenado en forma de ADNdc, pero también puede ser ADNsc, 
ARNsc o ARNdc, y de tamaños diversos, abarcan desde apenas 4 kpb hasta 600 kpb. El material 
genético, que puede encontrarse circularizado, linearizado o segmentado, generalmente está 
encapsulado en una cápside proteica o lipoproteica, aunque también existen fagos con envoltura 
de membrana. La morfología de los viriones es variable: pueden ser poliédricos, filamentosos o 
pleomórficos. Los fagos con cápside poliédrica a menudo tienen una cola, que puede ser larga o 
29 
 
corta, contráctil o no contráctil, recta o curva y presentar accesorios, como filamentos o fibras 
(Ackermann, 2006; Brüssow y Hendrix, 2002; Calendar y Inman, 2005; Guttman et al., 2005). 
La gran mayoría de los fagos descriptos pertenecen al género Caudovirales, son fagos con 
cola y ADNdc. Este género incluye tres familias principales: Siphoviridae, con colas largas no 
contráctiles; Myoviridae, con colas contráctiles largas y Podoviridae, con colas cortas no 
contráctiles (Fig. 2). Miembros de las tres familias han sido aislados de E. coli (Ackermann, 
2005; Hatfull y Hendrix, 2011). 
 
Figura 2. Representación esquemática de los fagos Caudovirales 
 
Modificado de Orlova (2012). 
 
1.2.1.2 Ciclos de vida 
Una característica común a todos los fagos es que, si bien sus genomas contienen la 
información requerida para conducir su propia multiplicación, necesitan la energía y la 
maquinaria de biosíntesis proteica de la bacteria hospedadora, por lo tanto, son parásitos 
obligados. En el caso de los Caudovirales, la cápside protege el material genético del fago contra 
el daño ambiental, mientras que la parte distal de la cola provee un mecanismo específico 
requerido para reconocer posibles hospedadores. La infección comienza cuando se encuentran un 
30 
 
fago y un hospedador apropiado. En este proceso de reconocimiento, llamado adsorción, 
proteínas de la cola del fago se unen a receptores ubicados en la superficie del hospedador. Estos 
receptores pueden ser proteínas, lipopolisacáridos o azúcares anclados a la membrana (o pared) 
celular. Luego de la unión, sobreviene una rápida reorganización de la membrana del huésped y 
de la estructura del fago, con la consecuente translocación del genoma del fago al citoplasma de 
la bacteria. Terminada la fase de penetración, el fago se convierte en un parásito intracelular 
activo y, sujeto a su información genética y al estado fisiológico del hospedador en el momento 
de la infección¸ puede continuar el ciclo lítico o el ciclo lisogénico (Edmond y Moineau, 2007). 
El ciclo lítico resulta en la lisis del hospedador y simultánea liberación de nuevas partículas de 
fagos. En cambio, el ciclo lisogénico conlleva a la integración del genoma del fago al genoma 
del hospedador o la conservación del ácido nucleico viral como un plásmido circular 
autorreplicativo en el citoplasma del huésped (Little, 2005). 
Los fagos se clasifican en virulentos o temperados. Los primeros solo pueden reproducirse 
a través del ciclo lítico, mientras que los temperados, son capaces de propagarse por ambos 
ciclos (Guttman et al., 2005). Se ha descrito también, principalmente para fagos filamentosos de 
E. coli, un ciclo de infección crónico que resulta en liberaciones continuas de progenies de fagos 
sin lisar al hospedador (Edmond y Moineau, 2007). 
 
1.2.1.2.1 Ciclo lítico 
Luego de la inyección del ADN fágico al interior celular, el hospedador experimenta 
importantes cambios fisiológicos. Ocurre una cascada sincronizada de eventos secuenciales 
dirigida por el fago e impulsada hacia la producción de progenie de fagos. La mayoría de los 
procesos celulares de la célula hospedadora son interrumpidos, a excepción de aquellos 
requeridos para la producción de viriones. El ADN del fago es replicado masivamente y sus 
genes comienzan a transcribirse y traducirse en proteínas estructurales y de regulación. Los 
componentes estructurales del virus comienzan a ensamblarse irreversiblemente en polímeros 
precursores, formando gradualmente partículas maduras de fagos. Estas nuevas partículas son 
liberadas a medida que la pared celular del hospedador es disgregada por la acción del sistema de 
lisis codificado por el fago. En condiciones donde los huéspedes susceptibles son abundantes y 
crecen activamente, la población de fagos virulentos prolifera a velocidades muy rápidas. En la 
mayoría de los casos, el ciclo lítico tarda entre 30 y 60 min en completarse y cada bacteria 
31 
 
infectada libera una progenie de fago que va desde 10 hasta 500 viriones (Edmond y Moineau, 
2007). 
 
1.2.1.2.2 Ciclo lisogénico 
Después de la infección y translocación del ADN al citoplasma del hospedador, los fagos 
temperados pueden proseguir con el ciclo lítico o con el lisogénico. Si continúa con el ciclo 
lítico, la cascada de eventos descripta anteriormente para fagos virulentos es llevada a cabo. Si, 
por el contrario, el fago sigue el ciclo lisogénico, éste entra en un estado de latencia, establece 
una relación estable con el hospedador y la bacteria se convierte en un lisógeno. En la mayoría 
de los casos, la formación de un lisógeno incluye la integración del genoma del fago al 
cromosoma del hospedador. En este proceso de recombinación interviene, entre otras, la proteína 
NinG (Tarkowski et al., 2002). El genoma integrado del fago, también llamado profago, es 
replicado con el cromosoma bacteriano y transmitido a las células hijas en cada división celular. 
Alternativamente, algunos fagos temperados se mantienen como plásmidos autorreplicativos en 
el citoplasma del hospedador. Los profagos son extremadamente estables y pueden mantenerse 
indefinidamente en este estado. Sin embargo, cambios epigenéticos pueden desencadenar un 
proceso denominado inducción del profago que confluye en el ciclo lítico (Edmond y Moineau, 
2007) 
1.2.1.3 Decisión lisis-lisogenia 
La expresión de los genes necesarios para el establecimiento de ciclo lítico o lisogénico y 
para la conversión de uno a otro, está modulada por un mecanismo que involucra distintas 
proteínas regulatorias del fago y regiones de ADN que codifican operadores (Ptashne, 2004). 
A continuación se describe a modo de ejemplo el sistema de regulación del fago Lambda 
(λ), un fago temperado, que pertenece a la familia Siphoviridae y que infecta principalmente a 
enterobacterias (Ackermann, 2006). En el genoma de λ se organizan, por un lado, los genes no 
estructurales, implicados en la recombinación, la replicación y la lisis bacteriana. Por otro lado, 
los genes estructurales que codifican para proteínas de la cápside y de la cola del virus. Y en otro 
sector, se encuentran ubicados los genes involucrados en regulación de los ciclos de vida 
(Hendrix y Casjens, 2006) (Fig. 3). 
En el ciclo lítico se expresan primero los genes que se encuentran bajo el control de los 
promotores tempranos: PL y PR. En cambio, el estado de lisogenia es estabilizado por la acción 
32 
 
de la proteína CI, también llamada proteína represora. CI se une a los operadores OR y OL y en 
consecuencia, bloquea PR y PL, lo cual impide la expresión de genes líticos, y activa PRM, de esta 
forma estimula su propia expresión (Little, 2007). La proteína CII, un fuerte activador de la 
transcripción, es crítica para establecer el estado de lisogenia. Altos niveles de CII activan, entre 
otros, al promotor PRE (Kobiler et al., 2005; Little, 2005) a partir del cual se transcribe cI. Si bien 
PRE y PRM conducen a la síntesis de CI, la función de PRE es establecer el estado lisogénico, 
mientras quela de PRM es mantener este estado (Little, 2007). La expresión de cII, está bajo el 
control de PR. Es una proteína muy inestable (Kobiler et al., 2002) y es degradada por una 
proteasa del hospedador (Ito y Akiyama, 2005). Otra proteína represora involucrada en la 
regulación es Cro. Ésta se sintetiza a partir de PR, se une al operador OR, bloquea PRM y, de esta 
forma, inhibe la producción de CI. Por lo tanto, después de la infección de λ, lo que determina 
qué ciclo que va seguir el fago, es un balance entre la expresión de ciertos genes. Si hay altos 
niveles de CII, la síntesis de CI estará activa y bloqueará a los promotores PR y PL. Se establece 
así el estado de lisogenia. En cambio, si los niveles de Cro son altos, se inhibe la expresión de cI, 
los promotores PR y PL permanecen activos y se lleva a cabo el ciclo lítico que culmina con la 
lisis del hospedador y la liberación de nuevas partículas de fagos (Little, 2007). A partir de PR se 
sintetiza también la proteína Q, la cual es requerida para la transcripción de los genes tardíos 
(Kobiler et al., 2005). 
 
Figura 3. Modelo del mapa genético del profago λ 
 
En la parte superior se observan los genes estructurales y no estructurales. En la parte inferior, los genes involucrados en 
regulación de los ciclos de vida. Los promotores tempranos PR y PL son responsables de la transcripción de los genes que 
se encuentran hacia la derecha (PR) y hacia la izquierda (PL). A partir PRE y PRM se sintetiza CI. 
 
33 
 
1.2.1.3.1 Inducción del profago 
Un cambio epigenético en la regulación de genes conduce de un estado de lisogenia a un 
estado lítico. Este proceso generalmente sucede a una velocidad lenta por distintas causas, pero 
es extremadamente eficiente cuando se activa el sistema de regulación de la célula hospedadora 
llamado SOS, como respuesta a daños en el ADN o inhibición de su replicación (Little, 2007). 
La respuesta SOS es controlada por dos proteínas regulatorias críticas: una represora, 
LexA y una activadora, RecA. Cuando se produce un daño en el ADN o se interrumpe su 
síntesis, RecA se activa y actúa como una co-proteasa que cataliza la autodegradración de LexA 
y así estimula el sistema SOS. LexA es homóloga al represor CI, por lo tanto, RecA media 
también la degradación de CI induciéndose así el ciclo lítico del fago (Little, 2007). 
 
1.2.2 Fagos Stx 
Por definición, todos los fagos portadores de un gen stx se consideran fagos Stx (Krüger y 
Lucchesi, 2014). Los fagos Stx descriptos hasta el momento son fagos temperados de ADNdc, 
que pertenecen principalmente a las familias Siphoviridae y Podoviridae y, en menor medida, a 
Myoviridae (Beutin et al., 2012; Bonanno et al., 2016; Muniesa et al., 2004a; Muniesa et al., 
2004b; Yan et al., 2011) (Fig. 4). Se los denomina fagos lamboides, debido a que su ciclo de 
vida, morfología y disposición del genoma son similares a λ. No obstante, los fagos Stx son un 
grupo muy heterogéneo (Karama y Gyles, 2008; Krüger y Lucchesi, 2015; Muniesa y Schmidt, 
2014; Schmidt, 2001). 
La diversidad de estos fagos se ve reflejada, por ejemplo, en diferentes morfologías, en el 
rango de hospedadores que pueden infectar, en el tamaño de los genomas (varían entre de 29,7 y 
68,7 kpb), en variabilidades genéticas (evidenciadas por RFLP, caracterización de múltiples 
locus por PCR, análisis de genomas secuenciados), en los sitios de inserción del ADN viral al 
cromosoma bacteriano, en los niveles de inducción de profagos y producción de Stx, entre otros 
(Krüger y Lucchesi, 2015; Muniesa y Schmidt, 2014). 
 
 
 
 
 
 
34 
 
Figura 4. Micrografías electrónicas de fagos Stx de distintas familias 
 
a. Podoviridae. b. Siphoviridae. c. Myoviridae. (Yan et al., 2011). 
 
1.2.2.1 Inducción de profagos y producción de Stx 
Los fagos Stx tienen una regulación del ciclo similar a λ (Fig. 5). En el estado lisogénico, 
el ADN del fago Stx se encuentra integrado al cromosoma de E. coli y la expresión de la mayoría 
de sus genes está inhibida. Gran parte de los lisógenos son estables, sin embargo, una pequeña 
proporción de profagos es inducida espontáneamente. Esta inducción espontánea es 
generalmente más elevada en los fagos Stx que en otros fagos lambdoides (Livny y Friedman, 
2004; Shimizu et al., 2009). Bajo ciertas condiciones, se activa el ciclo lítico, se expresan los 
genes de los fagos y se producen y liberan nuevas partículas virales. En la mayoría de las cepas 
STEC, el operón que codifica para las subunidades A y B de Stx está localizado entre los genes 
tardíos del fago, bajo el control del promotor tardío, PR', y la proteína antiterminadora Q. Por lo 
tanto, su expresión y liberación se encuentra asociada al ciclo lítico del mismo (Fig. 6). No 
obstante, la expresión de stx1 también está bajo el control de un promotor propio regulado por 
hierro (Krüger y Lucchesi, 2015; Muniesa y Schmidt, 2014; Scheutz, 2015). 
Ciertos agentes externos, como la radiación con luz UV o la exposición a mitomicina C, 
pueden inducir el ciclo lítico a través de la activación del sistema SOS (revisados por Krüger y 
Lucchesi (2015)). Es así como el uso de antibióticos no está recomendado en pacientes 
infectados con STEC, ya que podrían incrementar el riesgo de desarrollar SUH al inducir la 
expresión de stx (Wong et al., 2000) (Fig. 5). Se ha encontrado también que estos fagos podrían 
ser inducidos por compuestos quelantes, a través de mecanismos independientes a la respuesta 
SOS (Imamovic y Muniesa, 2012). 
Debido al importante rol que juega la proteína Q en la expresión de los genes tardíos, 
incluido stx, ésta podría estar relacionada con la patogenicidad de STEC (Krüger y Lucchesi, 
35 
 
2015). Distintos alelos de q asociados a fagos Stx han sido descriptos. Los más estudiados son 
los que se encuentran con frecuencia en las cepas O157: q933 y q21. Otro alelo menos 
caracterizado es qO111, hallado por primera vez en una cepa STEC O111:H- aislada en Japón 
(Ogura et al., 2009). Generalmente, el alelo q933 se encuentra asociado al subtipo stx2a y q21 a 
stx2c (Arthur et al., 2013; Franz et al., 2012; Pianciola et al., 2014), pero esta asociación no es 
exclusiva (Eppinger et al., 2011).Varios autores han relacionado diferencias en los niveles de 
expresión de stx o producción de la toxina con la presencia de distintos alelos de q (Ahmad y 
Zurek, 2006; Koitabashi et al., 2006; Lejeune et al., 2004; Mellor et al., 2012; Olavesen et al., 
2016; Steyert et al., 2012; Zhang et al., 2010). También los niveles de inducción de profagos se 
han asociado a Q (Tóth et al., 2009). La mayoría de estos trabajos se restringen solo al estudio de 
cepas del serogrupo O157. 
Estudios recientes sugieren que otro factor que determina el nivel de inducción de toxinas 
es la secuencia de la región entre los genes q y stx, en la cual se ubica el promotor PR' (Zhang et 
al., 2018). 
 
Figura 5. Esquema de los ciclos lítico y lisogénico de fagos Stx 
 
1. Adhesión del fago a la célula huésped e inyección del ADN. 2. Circularización del ADN viral y decisión lisis-lisogenia. 
3A. Síntesis de proteínas del fago, incluidas Stx y ensamblado de viriones. 4A. Lisis celular y liberación de fagos y Stx. 3B. 
Inserción del ADN viral al cromosoma bacteriano. El fago se convierte en profago y E. coli en un lisógeno codificante de 
Stx (STEC). 4B. Multiplicación del lisógeno. 5. Escisión del ADN viral del cromosoma bacteriano e inicio del ciclo lítico. 
Modificado de Tortora et al. (2010). 
 
 
36 
 
Figura 6. Esquema de regulación de la expresión de stx en los ciclos lítico y lisogénico 
 
Ciclo lisogénico: CI se une a los operadores OL y OR e inhibe la transcripción de los genes bajo el control de PL y PR. En 
consecuencia, no se sintetiza la proteína Q y PR'permanece inactivo. Ciclo lítico: Si se activa la respuesta de SOS, RecA 
escinde CI, se des-reprime PR y se expresa q. Este antiterminador se une a PR’ y se activala transcripción de stx. 
Modificado de Pacheco y Sperandio (2012). 
 
1.2.3 Fagos como vectores de virulencia 
Los fagos juegan un rol importante en la propagación de genes de virulencia. Está probado 
que, tanto experimentalmente con cultivos in vitro como dentro del intestino de los mamíferos y 
en el ambiente, los fagos codificantes de Stx pueden formar lisógenos en E. coli y en otras 
bacterias de la familia Enterobacteriaceae (Döpfer et al., 2010; Imamovic et al., 2009; 
Mellmann et al., 2008; Schmidt et al., 1999; Tóth et al., 2003) y algunos autores sugieren que las 
cepas STEC emergentes se forman principalmente dentro del intestino bovino (Kroeger et al., 
2003). Por lo tanto, cepas consideradas no patógenas pueden adquirir los genes stx 
convirtiéndose en cepas STEC virulentas para los humanos. Beutin et al. (2013) presentaron 
evidencia experimental de que cepas EAEC O104:H4 negativas para los genes stx han 
evolucionado a cepas EAEC-STEC mediante la transferencia de fagos portadores de stx2a en el 
reservorio bovino. Debido a la movilidad de los fagos Stx y a la asociación de diferentes 
serotipos con enfermedad en humanos, es indispensable incluir en los análisis no sólo 
aislamientos de humanos sino también de otros orígenes y no focalizarse solo en cepas O157:H7, 
sino ampliar el estudio hacia otros serotipos de STEC. 
37 
 
1.3 OBJETIVOS 
Dado que: 
 Argentina posee la mayor incidencia a nivel mundial de SUH, cuyo principal 
agente etiológico es STEC; 
 el principal factor de virulencia de STEC es la producción de Stx; 
 las Stx son codificadas por un grupo heterogéneo de fagos que regulan su 
expresión; 
 el subtipo stx2a se encuentra frecuentemente en cepas aisladas de pacientes y se 
asocia a mayor riesgo de desarrollo de SUH; 
 los fagos juegan un rol importante en la propagación de genes de virulencia; 
 los casos de SUH causados por STEC no-O157 han tomado mayor importancia; 
 la virulencia de STEC no está esclarecida con certeza. 
Resulta fundamental profundizar la caracterización de factores relacionados a la virulencia 
de STEC y el conocimiento de los mecanismos que regulan la inducción de profagos y la 
producción de Stx. 
Los objetivos planteados para este trabajo fueron los siguientes: 
 
1.3.1 Objetivo general 
Se postuló como objetivo general caracterizar los fagos codificantes de stx2a presentes en 
cepas STEC de distintos serotipos aisladas en Argentina. 
 
1.3.2 Objetivos particulares 
A partir de una selección de cepas STEC nativas de distintos serotipos, aisladas de 
diferentes orígenes y portadoras de profagos Stx2a, se propuso: 
 Caracterizar las regiones de regulación flanqueantes a stx2 en cepas STEC nativas 
de Argentina. 
 Cuantificar los niveles de expresión de stx2a en estas cepas. 
 Cuantificar los niveles de inducción de profagos Stx2a en las mismas. 
 Evaluar ambos niveles en lisógenos obtenidos con un mismo profago en distintas 
cepas de E. coli. 
38 
 
 Comparar los resultados obtenidos de acuerdo al serotipo, al origen y a 
características genotípicas de las cepas. 
39 
 
CAPÍTULO II: DISEÑO EXPERIMENTAL 
40 
 
2.1 Cepas bacterianas 
2.1.1 Cepas de estudio 
El Laboratorio de Inmunoquímica y Biotecnología de la Facultad de Ciencias Veterinarias 
de la Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires cuenta con una amplia 
colección de cepas STEC aisladas de diferentes orígenes. Los serotipos de estas cepas, así como 
características genéticas de relevancia, entre ellas la presencia de diversos factores de virulencia 
y de subtipos de stx, han sido determinados en estudios previos (Alonso et al., 2016; Krüger et 
al., 2011; Krüger et al., 2015; Padola et al., 2004; Parma et al., 2000; Rivero et al., 2010; Sanz et 
al., 2007). 
A partir de dicha colección, se seleccionaron para su estudio las cepas portadoras del 
subtipo vt2EDL933, solo o en combinación con otro subtipo, y las cepas que, analizadas por 
microarray, fueron positivas para la sonda stx2a,c,d. 
 
2.1.2 Cepas hospedadoras 
Para la cuantificación de fagos por el método de doble capa de agar se utilizó como 
hospedadora la cepa E. coli DH5α derivada de la cepa comensal E. coli K-12. En cambio, para 
los ensayos de obtención de lisógenos, las cepas derivadas de K-12 utilizadas fueron E. coli 
Y1090 y E. coli HB101. La cepa E. coli TOP10 fue utilizada en la clonación de un plásmido 
recombinante. 
 
2.1.3 Cepas de referencia 
Las cepas STEC usadas como controles para la determinación de los subtipos de stx 
fueron: E. coli EDL933 (stx1a y stx2a), E. coli DG131/3 (stx1c), E. coli MHI813 (stx1d), E. coli 
EH250 (stx2b), E. coli F35790 (stx2c), E. coli 1112R15035 (stx2d), E. coli S1191 (stx2e), E. coli 
T4/97 (stx2f) y E. coli 7V (stx2g). La cepa E. coli EDL933 y el ADN de E. coli B2F2 se usaron 
como controles positivos para las PCR de caracterización de las regiones flanqueantes a stx2. 
Estos materiales (cepas/ADN) fueron gentilmente cedidas por A. B. Bentancor (Facultad de 
Ciencias Veterinarias, Universidad de Buenos Aires, Argentina), P. H. M. Leung (Hospital 
Queen Mary, Universidad de Hong Kong, China), J. Blanco (Laboratorio de Referencia de E. 
coli, España) y A.W. Friedrich (Hospital Universitario de Münster, Alemania). 
41 
 
2.1.4 Conservación de las cepas 
Tanto las cepas de estudio como las cepas hospedadoras y las de referencia se encontraban 
conservadas en viales a -80 °C en caldo LB con glicerol al 20 % v/v. A partir de estos viales se 
generaron stocks de uso para este trabajo: se cultivó cada cepa en caldo LB, a 37 °C con 
agitación durante toda la noche, y luego, se tomó una alícuota y se guardó a -80 °C con glicerol 
al 20 % v/v. 
 
42 
 
2.2 Identificación de subtipos de stx 
2.2.1 Resubtipificación de cepas 
Si bien los subtipos de stx portados por las cepas de estudio seleccionadas ya habían sido 
previamente identificados, esta caracterización estaba realizada, para la mayoría de las cepas, 
mediante PCR-RFLP (Krüger et al., 2011), una metodología anterior a la expuesta por Scheutz et 
al. (2012). En este trabajo, los autores proponen un esquema de subtipificación por PCR con 
primers específicos para cada subtipo. Dado que es importante adoptar este protocolo para 
estandarizar y facilitar las comparaciones interlaboratorios, el mismo fue puesto a punto al inicio 
de esta tesis y se implementó para resubtipificar las cepas de estudio. Para su adaptación, se 
ensayaron distintos escenarios para las temperaturas de annealing y para las concentraciones de 
primers, de ADN polimerasa y de MgCl2, hasta lograr una correcta optimización. 
Concretamente, se cotejó que las cepas portadoras del subtipo vt2EDL933 fueran positivas 
para stx2a. Entre estas cepas, las que además presentaban otro subtipo identificado por PCR-
RFLP fueron analizadas con el protocolo estandarizado para detectar el resto de los subtipos 
(Fig. 7a). 
En el caso de la gran mayoría de las cepas O26, los subtipos de stx2 estaban determinadas 
con un microarray que detecta los subtipos acorde a lo descripto por Scheutz et al. (2012), pero 
no discrimina entre stx2a, stx2c y stx2d (Krüger et al., 2015). Por lo tanto, las cepas positivas para 
la sonda stx2a,c,d se seleccionaron para precisar entre estos subtipos y analizar también la 
presencia de subtipos de stx1 (Fig. 7b). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
43 
 
Figura 7. Esquemas de trabajo para la selección y resubtipificación de las cepas 
a. 
 
b. 
 
a. Selección y resubtipificación de cepas caracterizadas previamente por PCR-RFLP. b. Selección y resubtipificación de 
cepas caracterizadas previamente por microarray. 
 
2.2.1.1 Condiciones de reacción 
El protocolo de subtipificación descripto por Scheutz et al. (2012) se desarrolló en base a 
secuencias genéticas de las stx. Consiste en utilizar la técnica PCR (en monoplex y multiplex), 
empleando primers (Tabla 1) específicos