Tesis Doctoral Colello, Rocio Deteccion y caracterizacion molecular de bacterias implicadas en enfermedades

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Doctorado en Ciencia Animal
Tesis
Detección y caracterización molecular de bacterias implicadas en enfermedades transmitidas por alimentos en la cadena productiva porcina
Por: Rocío Colello
Facultad de Ciencias Veterinarias
U.N.C.P.B.A
Directora: Dra. Analía Inés Etcheverría
Co-directora: Dra. Nora Lía Padola 
Miembros del Jurado: 
Dr. Gerardo A. Leotta
Dra. Cristina L. De Antoni
ÍNDICE
Agradecimientos	1
Resumen	3
Summary	5
Palabras claves.	7
Abreviaturas	7
CAPÍTULO I	9
1.1 Introducción General	10
1.2 Bacterias resistentes a antibióticos transmitidas por alimentos	12
1.2.1 Integrones	13
1.2.1.1 Integrón de clase 1	14
1.2.1.2 Integrón de clase 2	14
1.2.1.3 Genes Casetes	15
1.3 Bacterias productoras de ETA	16
1.3.1 Detección de bacterias productoras de ETA	16
1.3.2 Prevención	17
1.3.2.1 Estrategias de prevención	18
1.4 Consumo de carne de cerdo en Argentina	20
1.5 Hipótesis	22
1.6 Objetivo general	22
CAPÍTULO II	23
2.1. Diseño	24
2.2 Manejo de las granjas y de los animales	24
2.3 Manejo de las canales hasta la boca de expendio	25
2.3 Total de muestras tomadas	25
2.3.1 Criadero	25
2.3.2 Frigorífico	27
2.3.3 Desposte	27
2.3.4 Boca de expendio	28
CAPÍTULO III	29
3.1 Escherichia coli	30
3.1.1 Características generales	30
3.1.2 Patotipos	31
3.1.3 E. coli verocitotoxigénica (VTEC)	31
3.1.4 Seropatotipos	32
3.1.5 Fisiopatogénesis y Factores de virulencia	33
3.1.5.1 Locus LEE	33
3.1.5.2 Verocitotoxinas (VTs)	34
3.1.5.3 pO157	36
3.1.5.4 pO113	36
3.1.6 Cepas Locus LEE-negativas	37
3.1.7 Manifestaciones clínicas	38
3.1.8 Epidemiología	39
3.1.9 Vías de transmisión	41
3.1.10 Reservorios y Prevalencia	42
3.2 Objetivos específicos	44
3.3 Materiales y métodos	45
3.3.1 Detección de Factores de virulencia de VTEC por PCR	45
3.3.1.1 Procesamiento de las muestras	45
3.3.1.2 Detección de genes de virulencia y aislamiento de colonias individuales	45
3.3.1.3 Cepas de referencia de E. coli	45
3.3.1.4 Cepas de referencia Integrones +	46
3.3.1.5 Condiciones del ensayo para los genes estudiados	46
3.3.1.6 Condiciones de termociclado empleadas en la detección de genes estudiados	47
Condiciones de termociclado para vt1, vt2, eae, ehxA, saa	47
Condiciones de termociclado para vt2e	47
Condiciones de termociclado para intll, intl2	48
Condiciones de termociclado para 3´CS (qacE1- sul1)	48
3.3.1.7 Primers empleados y tamaño de fragmentos amplificados	49
3.3.2 Determinación de serotipos de E. coli verocitotoxigénicos	50
3.3.2.1 Determinación de serogrupos	50
3.3.2.2 Determinación del antígeno H (serotipificación)	51
3.3.3 Ensayo de susceptibilidad a antibióticos	52
3.3.3.1 Procedimiento de Bauer-Kirby	52
3.3.3.2 Interpretación de los resultados	52
3.3.3.3 Discos de antibióticos utilizados	52
3.3.4 Tipificación de los aislamientos mediante ERIC-PCR	54
3.3.4.1 Condiciones de termociclado para ERIC	54
3.3.4.2 Primers empleados	54
3.3.4.3 Condiciones del ensayo	54
3.3.4.4 Análisis de datos	55
3.3.4.5 Poder discriminatorio	55
3.4 Resultados	56
3.4.1 Prevalencia total de VTEC	56
3.4.2 Prevalencia para cada punto muestreado	57
3.4.2.1 Criadero	57
3.4.2.2 Frigorífico	57
3.4.2.3 Desposte	57
3.4.2.4 Boca de expendio	57
3.4.3 Aislamiento y caracterización	58
3.4.3.1 Detección de genes de virulencia	58
3.4.3.2 Serotipo	60
3.4.3.3 Resistencia a Antibióticos	62
3.4.3.3.1 Integrones	62
3.4.3.3.2 Caracterización fenotípica	62
3.4.4 Tipificación de los aislamientos mediante ERIC-PCR	63
3.5 Discusión	65
3.6 Conclusiones	71
CAPÍTULO IV	72
4.1 Salmonella	73
4.1.1 Características generales	73
4.1.2 Serotipos	74
4.1.3 Fisiopatogénesis y factores de virulencia	74
4.1.3.1 Islas de patogenicidad (IPS)	75
4.1.3.2 Islotes de patogenicidad y genes sueltos	77
4.1.4 Manifestaciones clínicas	77
4.1.5 Epidemiología	78
4.1.6 Vías de transmisión	80
4.1.7 Reservorios y Prevalencia	80
4.1.8 Salmonella en cerdos	82
4.2 Objetivos específicos	83
4.3 Materiales y Métodos	85
4.3.1 Procesamiento y Aislamiento de Salmonella spp.	85
4.3.1.1 Preenriquecimiento en medio líquido no selectivo	85
4.3.1.2 Enriquecimiento en medios líquidos	85
4.3.1.3 Siembra en medio sólido	85
4.3.1.4 Confirmación	85
4.3.1.5 Pruebas bioquímicas	86
4.3.2 Amplificación por PCR	86
4.3.2.1 Cepas de referencia de Salmonella	86
4.3.2.2 Cepas de referencia Integrones +	86
4.3.2.3 Condiciones del ensayo	87
4.3.2.4 Condiciones de termociclado empleadas en la detección de genes estudiados	87
Condiciones de termociclado para invA	87
Condiciones de termociclado para intll, intl2	87
Condiciones de termociclado para 3´CS (qacE1- sul1)	88
4.3.2.5 Primers empleados y tamaño de fragmentos amplificados	88
4.3.3 Ensayo de susceptibilidad a antibióticos	89
4.3.3.1 Procedimiento de Bauer-Kirby	89
4.3.3.2 Interpretación de los resultados	90
4.3.3.3 Discos de antibióticos utilizados	90
4.3.4 Tipificación de los aislamientos mediante ERIC-PCR	91
4.3.4.1 Preparación del ADN	91
4.3.4.2 Condiciones de termociclado para ERIC	91
4.3.4.3 Primers empleados	91
4.3.4.4 Condiciones del ensayo	92
4.3.4.5 Análisis de datos	92
4.3.4.6 Poder discriminatorio	92
4.4 Resultados	93
4.4.3 Prevalencia total de Salmonella spp.	93
4.3.4 Prevalencia por cada punto muestreado	94
4.3.4.1 Criadero	94
4.3.4.2 Frigorífico	94
4.3.4.3 Desposte	94
4.3.4.4 Boca de Expendio	95
4.3.5 Aislamiento y caracterización	95
4.3.6 Resistencia a Antibióticos	95
4.3.6.1 Caracterización fenotípica	95
4.3.6.2 Integrones	100
4.3.7 Tipificación de los aislamientos mediante ERIC-PCR	100
4.4 Discusión	102
4.5 Conclusiones	108
CAPÍTULO V	109
5.1 Staphylococcus aureus	110
5.1.2 Fisiopatogénesis y factores de virulencia	111
5.1.2.1 Componentes de la pared celular	111
5.1.2.2 Exoenzimas	112
5.1.2.3 Toxinas	112
5.1.2.4 Enterotoxinas	113
5.1.3 Manifestaciones clínicas	114
5.1.4 Epidemiología	115
5.1.5 Vías de transmisión, reservorios y prevalencia en alimentos	116
5.2 Objetivos específicos	118
5.3 Materiales y Métodos	119
5.3.1 Aislamiento de Staphylococcus aureus	119
5.3.2 Confirmación	119
5.3.2.1 Producción de coagulasa	119
5.3.2.2 Tinción de Gram	119
5.3.3 Amplificación por PCR	120
5.3.3.1 Extracción de ADN	120
5.3.3.2 Cepas de referencia de Staphylococcus aureus	120
5.3.3.3 Condiciones del ensayo para los genes estudiados	120
5.3.3.4 Condiciones de termociclado empleadas en la detección de genes estudiados	121
Condiciones de termociclado para sea, seb, sec	121
5.3.3.5 Primers empleados y tamaño de fragmentos amplificados	121
5.2 Resultados	123
5.4.1 Prevalencia total de Staphyococcus aureus	123
5.4.2 Aislamiento y Caracterización	124
5.4.2.1 Detección de enterotoxinas	124
5.5 Discusión	126
5.6 Conclusiones	129
CAPÍTULO VI	130
6.1 Discusión y conclusión general	131
6.2 Referencias bibliográficas	133
ANEXO I. Composición de medios de cultivo, soluciones, buffer y geles 
ANEXO II. Publicaciones y comunicaciones a Congresos surgidos de esta Tesis
Agradecimientos 
Recuerdo el momento que empecé a realizar mi tesis de grado y le pregunte a Analía si me podía quedar y me dijo que sí, estaba tan contenta. Pedimos mis primeras becas y de a poco entre en este mundo, creía muy lejano este momento, pero finalmente llego. Llego el momento de escribir y finalizar LA Tesis y ahora estoy escribiendo los agradecimientos, obvio ya estoy llorando y espero no olvidarme a nadie que ha compartido conmigo esta etapa.
Gracias a la Comisión de Doctorado, Evaluadores externos, Autoridades de la Facultad de Ciencias Veterinarias, UNCPBA y a las entidades que financiaron este proyecto: CONICET, FONCYT, SECAT-UNCPBA.
Quiero agradecer a mis directoras de Tesis, Nora y Analía, por el apoyo incondicional, por la ayuda científica pero más que nada por el acompañamiento humano. En todo sentido estuvieron durante mi crecimiento desde lo profesional a mi vida personal, innumerables mates, charlas, algunas que otras peleas. Gracias de corazón.
A todos los que están, trabajan y hacen que funcione el Laboratorio de Inmunoquímica y Biotecnología: Paula, Ana, Mariel, Ale, Daniel, Marce, Ma. Rosa y especialmente a mi querido Guille, me has hecho reír y acompañado tanto en estos años quehaces que el día pase muy rápido.
A muchos que estuvieron en este trayecto de alguna u otra manera: Fer, Gina, Lau D.
A mis amigas de toda la vida, a mis amigas de la carrera y mis amigas “nuevas”. Yo siempre decía que el trabajo no daba amigos, pero por suerte me equivoque. Como me gusta decir a mis “J”, las Julis y Jime, que sin ustedes no sé cómo habría seguido en ciertos momentos de mi vida, les agradezco infinitamente. A mis amigas de boxes y no boxes: María, Ale, Lau y Juli que también me acompañan día a día con una charla, un mate, una cena, un chat, algo, siempre están incondicionalmente.
A mi familia, mi mamá y mi papá, que haría sin ustedes, su apoyo, sus valores enseñados, mucho de lo que soy hoy es por ustedes. Gracias por cuidar a Bauti con tanto amor en todos pero en todos los momentos que lo necesite. A mis hermanas Lore y Mari, mis hermanas viejitas que siempre van estar consintiendo los caprichos de la más chica, a mis sobris hermosos Lalo y Octi.
Agradecer a mi amor, gracias Vasco por comprender, entender y acompañar esto que elegí, siempre estando sin ningún reclamo. Y finalmente quiero agradecer a la personita que me hace feliz cada día de mi vida, no creí que existiría tanto amor para dar y recibir, te adoro mi enano hermoso, gracias Bauti, y también quiero dedicarle unos renglones a Sara, esta linda niña que viene en camino, que te quiero y adoro tanto desde el primer día que te vi.
GRACIAS!
Resumen
Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) constituyen un problema sanitario y económico de relevancia mundial y son el resultado de la ingestión de alimentos, productos alimenticios o agua contaminados. En la actualidad las ETA constituyen uno de los problemas sanitarios más relevantes en salud pública, la Argentina posee una alta incidencia de casos de ETA a nivel mundial y uno de los países con mayor cantidad de niños afectados, los principales reservorios de las bacterias causantes de ETA son los animales de sangre caliente y el ambiente, siendo su principal vía de transmisión los alimentos contaminados. Por esto nos plateamos como objetivo, detectar por métodos moleculares bacterias implicadas en enfermedades transmitidas por alimentos e identificar puntos de contaminación en la cadena de producción y comercialización porcina como herramienta para dirigir estrategias de prevención tendientes a disminuir los riesgos en salud pública. 
En este trabajo de Tesis nos propusimos detectar la prevalencia a lo largo de la cadena productiva porcina de Escherichia coli verocitotoxigénica (VTEC), Salmonella spp. y Staphylococcus aureus a nivel de boca de expendio. La presente Tesis para su mejor comprensión se organiza en capítulos para cada una de las bacterias estudiadas.
Para ello se tomaron 764 muestras de dos Empresas que contaban con todos los niveles de la cadena productiva porcina (criadero, frigorífico, desposte y boca de expendio) denominadas A y B. Una vez procesadas las muestras caracterizamos los aislamientos en base a genes de virulencia, genes de resistencia a antibióticos y características fenotípicas tales como serotipado, resistencia a antibióticos y pruebas de enzimas de los aislamientos.
Se utilizó la técnica ERIC-PCR para analizar las relaciones entre los aislamientos obtenidos, con el fin de comprender la dinámica de VTEC y Salmonella spp. en la cadena productiva porcina así como la importancia relativa de las diferentes fuentes de contaminación
Los resultados obtenidos en esta Tesis nos permiten concluir que los porcinos son reservorios de VTEC, Salmonella spp. y Staphylococcus aureus y nos permite especular que la contaminación por los patógenos estudiados originada en las granjas se transfiere de los cerdos a las canales y con el procesamiento de las mismas en el desposte aumenta en los diferentes cortes de carne, llegando a la boca de expendio. Con estos resultados se podrán elaborar estrategias de control, prevención, educación en todas las etapas de la cadena de producción hacia las empresas, los manipuladores y la población en general. 
Summary 
Foodborne diseases constitute a relevant sanitary and economic worldwide problem being the result of consumption of contaminated food, food products or water. Currently Foodborne Diseases are one of the most considerable sanitary problems in Argentinian Public Health. Argentina has one of the highest incidences of Foodborne Diseases around the world and one of the countries with higher number of affected children. The main reservoirs of pathogens causing Foodborne Diseases are warm-blooded animals and their environment being directly or indirectly contaminated through foods. This is the reason why we focus on detecting, through molecular methods, bacteria involved in foodborne diseases and identifying contamination sources in pig production and commercialization chain as a tool to conduct prevention strategies leading to decrease risks in public health.
The objective of this Thesis is to determine the prevalence of Verocytotoxigénic Escherichia coli (VTEC), Salmonella spp. and Staphylococcus aureus throughout the pig production chain to retail level. This Thesis is organized in chapters to a better understanding of the studied bacteria.
Seven hundred sixty four samples were taken from two companies named A and B, which own all the pig production chain levels (breeding center, slaughterhouse, boning rooms, and retail). Once processed the samples the isolations were typified based on virulence genes, antibiotic resistant genes, and phenotypic characteristics such as serotyping, antibiotic resistance and enzyme trials of isolations.
We used the ERIC-PCR technique to analize the relation among obtained isolations to be able to understand the dynamics of VTEC and Salmonella spp. in pig production chain as well as the relative importance of different sources of contamination. 
The obtained results in this Thesis allow us to conclude that pigs are reservoir of VTEC, Salmonella spp. and Staphylococcus aureus, and also to speculate that the contamination through the studied pathogens originated in farms is transferred from pigs to the carcasses and their process during the boning increases on the different meat cuts, arriving to the retail store. Based on these results it will be possible to elaborate strategies of control, training for all the stages of the production chain to companies, their personnel, and the population in general. 
Palabras claves. Escherichia coli verocitotoxigénica, Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Cadena productiva porcina, Prevalencia, Aislamiento, Caracterización, PCR.
Abreviaturas
ADN		ácido desoxirribonucleico
ARN		ácido ribonucleico
ARNt		ácido ribonucleico de transferencia
aw		actividad de agua
CH		colitis hemorrágica
dNTP		desoxirribonucleósido 5-trifosfato
EDTA		ácido etilendiaminotetracetico 
EHEC		Escherichia coli Enterohemorrágica
ERIC		secuencias repetitivas intergénicas de consenso de las enterobacterias
ETA		Enfermedades Transmitidas por Alimentos
Gb3		globotriacilceramida
Gb4		globotetraosilceramida
H		antígeno flagelar
h		horas
IPS		Isla de patogenicidad de Salmonella
Kb		Kilobases
KDa		Kilodalton
LB		Luria Bertani
LEE		Locus de borrado del enterocito
LPS		lipoporisacárido
Min		minutos
ml		mililitros
mM		milimolar
NT		no tipificable
O		antígeno somático de la membrana 
ºC		grados centígrados
OMS		Organización Mundial de la Salud
pb		pares de bases
PCR		reacción en cadena de la polimerasa
pH		potencial hidrógeno
SE		enterotoxinas de Staphylococcus aureus 
SST3		Sistema de secreción tipo tres
SUH		síndrome urémico hemolítico
Tir		receptor de intimina translocado
TSST 1	Toxina del Síndrome de Shock Térmico
UFC		unidad formadora de colônia
µg		microgramos
µl		microlitros
µM		micromolar
VTEC		Escherichia coli verocitotoxigénica
VTs		Verocitotoxinas
CAPÍTULO I
1.1 Introducción General
Según la Organización Mundial de la Salud (OMS o en ingles WHO - World Health Organisation-) las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) constituyen un problema sanitarioy económico de relevancia mundial y son el resultado de la ingestión de alimentos, productos alimenticios o agua contaminados. En la actualidad se reconocen más de 250 ETA causadas por bacterias, virus, sustancias químicas y/o parásitos que contaminan los alimentos en distintos puntos de la producción de los mismos y afectan la salud de una persona o grupo de personas en forma aguda o crónica. Las manifestaciones clínicas más comunes de una ETA consisten en la aparición de síntomas gastrointestinales, pero también pueden dar lugar a síntomas neurológicos, ginecológicos, inmunológicos, insuficiencia multiorgánica hasta la muerte. 
El creciente comercio internacional, la migración y los viajes aceleran la propagación de bacterias productoras de ETA, los brotes locales tienden a convertirse en una potencial amenaza nivel mundial. En 1991, una epidemia de cólera, que se cree que comenzó con agua y alimentos marinos contaminados en Perú, se extendió rápidamente a través de América Latina, resultando aproximadamente en 400.000 casos y más de 4.000 muertes reportadas en varios países (Koo et al., 1996). A través de la globalización, de la comercialización y distribución de alimentos, los productos alimenticios contaminados pueden afectar a la salud de las personas en numerosos países al mismo tiempo. La identificación de un alimento contaminado puede dar lugar a la retirada de toneladas de alimentos y a pérdidas económicas considerables en la producción. A principios de 2008, un brote de gripe aviar en India dio lugar a la prohibición de importación de productos avícolas indios en el Medio Oriente, lo que resultó en pérdidas por un total de cientos de miles de dólares a la economía de la India (Tauxe et al., 2010).
La propagación de estas enfermedades depende de múltiples factores, tales como:
· rápido crecimiento de la población,
· un mercado cada vez más global de verduras, frutas, carnes, alimentos étnicos, e incluso los animales de granja, algunos de los cuales provienen de países sin procedimientos de bioseguridad adecuados,
· la mejora de la logística de transporte que permite a las bacterias sobrevivir en los productos alimenticios y llegar al consumidor en una forma viable,
· los cambios en los hábitos alimenticios, como el consumo de productos crudos o ligeramente cocidos, y la demanda de alimentos exóticos,
· los cambios en las prácticas agrícolas, por ejemplo la producción orgánica,
· la creciente intervención del hombre en hábitats silvestres nativos,
· el cambio climático (Newell et al., 2010).
En el comunicado de prensa de la OMS del 3 de diciembre de 2015 en Ginebra, se informó que casi un tercio (30%) de todas las muertes por enfermedades de transmisión alimentaria se producen en niños menores de 5 años, pese a que los niños de esa edad representan solo el 9% de la población mundial. Según el informe, en el cual se presenta una estimación de la carga de las enfermedades de ETA, cada año hasta 600 millones de personas (1 de cada 10) de todo el mundo enferman tras consumir alimentos contaminados. De estas personas, 420.000 mueren, incluidos 125.000 niños menores de 5 años. La diarrea, uno de los principales síntomas, suele deberse a la ingestión de carne y huevos crudos o mal cocidos, verduras y frutas mal lavadas, y productos lácteos, contaminados por Norovirus, Campylobacter spp., Salmonella no tifoidea y Escherichia coli patógena. Ciertas enfermedades, como las causadas por Salmonella no tifoidea, representan un problema de salud pública en todas las regiones del mundo y afectan a países de ingresos altos y bajos por igual. Otras enfermedades, como la fiebre tifoidea, el cólera transmitido por alimentos y las enfermedades causadas por E. coli patógena, son mucho más comunes en los países de bajos ingresos, mientras que Campylobacter spp. es un agente patógeno importante en los países de ingresos altos. El riesgo de padecer ETA es mayor en los países de ingresos bajos y medianos, y está vinculado a la preparación de alimentos con agua contaminada, la falta de higiene y condiciones inadecuadas en la producción y el almacenamiento de alimentos, el bajo nivel de alfabetismo y educación, y la insuficiencia de leyes en materia de inocuidad de los alimentos o su falta de aplicación (WHO, 2015).
Se estima que en América 77 millones de personas se enferman anualmente al consumir alimentos contaminados, y de esas personas mueren alrededor de 9.000 al año. De las personas que se enferman, 31 millones son menores de 5 años y de ellos mueren más de 2.000 al año. En esta región el 95% de los casos son producidos por Norovirus, Campylobacter spp., E. coli y Salmonella no tifoidea (WHO, 2015).
En Argentina, de acuerdo con las notificaciones de los años 2014 - 2016, se producen alrededor de 500.000 episodios de diarrea agudas, de los cuales entre el 40% y el 50% correspondieron a niños menores de 5 años (extracto del Boletín Integrado de Vigilancia N° 300). Cabe destacar que estas cifras representan solo una pequeña porción del número real de casos de ETA dado que para estas enfermedades existe un alto subreporte de casos pudiendo estimarse el número real en al menos diez veces el número de casos registrados.
1.2 Bacterias resistentes a antibióticos transmitidas por alimentos 
El desarrollo y utilización de antibióticos ha sido de suma importancia para la resolución de muchas infecciones. La presión de selección que estos ejercen sobre las poblaciones bacterianas, condujo a la aparición y diseminación de distintos mecanismos de resistencia a nivel mundial. El fenómeno de la resistencia a los antibióticos se ve impulsado por el uso de estas drogas en medicina veterinaria y humana y sobre todo en la producción de alimentos. Entre las consecuencias de la resistencia a los antimicrobianos figura la imposibilidad de tratar las infecciones de forma adecuada, lo que provoca enfermedades más graves o prolongadas, muertes, pérdidas de producción, entre otras. Los alimentos tienen importancia en el desarrollo y difusión de bacterias no solo patógenas, sino también resistentes a distintos antibióticos (Tauxe et al., 2010).
La OMS revela que la resistencia a los antibióticos ha dejado de ser una previsión para el futuro y ya es en todas las regiones del mundo una realidad que puede afectar a cualquier persona de cualquier edad. En América, la Organización Panamericana de la Salud (OPS), que actúa como Oficina Regional de la OMS, recopiló datos sobre la resistencia a los antibióticos en los hospitales y laboratorios de 21 países de la región. Los datos del informe muestran que hay una elevada resistencia de cepas E. coli a las cefalosporinas de tercera generación y a las fluoroquinolonas. La resistencia de Klebsiella pneumoniae a las cefalosporinas de tercera generación también es elevada y generalizada. En algunos entornos, hasta un 90% de las infecciones por Staphylococcus aureus son resistentes a la meticilina, lo cual significa que el tratamiento con los antibióticos habituales no funciona. Además, el informe revela que son muchos los países que carecen de instrumentos fundamentales para hacer frente a la resistencia a los antibióticos, tales como sistemas básicos de seguimiento y monitorización del problema, o en los que estos presentan grandes deficiencias (WHO, 2014).
La resistencia antibiótica en bacterias patógenas pueden transmitirse de los animales a los humanos, a través del consumo de alimentos, o bien por medio del contacto directo con animales (AalbæK et al., 1991). La adquisición de los distintos mecanismos de resistencia puede ser originada a través de mutaciones, que se transmiten verticalmente de células madres a células hijas o por la adquisición de material genético que codifica genes de resistencia y que puede ser difundida de una célula a otra (de la misma especie o no), esto contribuye a la difusión horizontal de la resistencia (Gómez-Lus, 2010). Sólo tras la optimización de los métodos de secuenciación y el advenimiento del análisis computacional fue posible reconocer la importancia denuevas plataformas genéticas (Di Conza y Gutkind, 2010). Se ha postulado que gran parte de la multiresistencia bacteriana se debería a la diseminación y adquisición de genes llamados integrones (Carattoli, 2001).
1.2.1 Integrones 
El término integrón o elemento de integración fue propuesto por Stokes y Hall (1989), aunque la definición fue introducida por Hall y Collis (1995) como un elemento dinámico que contiene los determinantes genéticos de los componentes de un sistema de recombinación específica de sitio que reconoce y captura genes en casete móviles.
La estructura mínima de un integrón incluye: 1- el gen para la integrasa (intI), 2- un sitio adyacente de recombinación (attI), y 3- al menos un promotor (Pc, P2), orientado para la expresión de los genes capturados. El gen intI contiene su propio promotor y, en general, se expresa en forma divergente a los genes capturados (Figura 1). La integrasa, que pertenece a la familia de las tirosina-recombinasas, cataliza la recombinación entre las secuencias específicas. Es por ello que las bacterias que poseen integrones tienen la posibilidad de incorporar genes que se encuentran en el citoplasma bacteriano bajo la forma de genes en casete. De esta manera, los integrones pueden adquirir nuevos determinantes de resistencia a antibióticos, lo cual le brinda a la bacteria hospedadora amplia versatilidad para adaptarse a nuevas condiciones de supervivencia (Hall y Collis, 1995, Boucher et al., 2007). 
Figura 1. Estructura básica de un integrón (Di Conza y Gutkind, 2010).
Los integrones no son elementos que presenten la maquinaria necesaria para movilizarse, es por ello que se asocian a secuencias de inserción, a transposones y/o a plásmidos conjugativos para poder movilizarse y diseminarse entre microorganismos de diferentes ambientes. Muchos aislamientos bacterianos, de genotipo no relacionado, poseen integrones cuya región variable es idéntica, lo que sugiere una transferencia de genes inter e intraespecie. Algunos integrones están inmersos en transposones tales como Tn1404, Tn1696 y Tn21 o Tn7, estos transposones se han localizado tanto en el cromosoma bacteriano como en plásmidos conjugativos. También se postula que algunos integrones están asociados a secuencias de inserción (IS) lo que ha facilitado dispersión de estos entre diferentes especies bacterianas (Di Conza y Gutkind, 2010).
Basados en la secuencia aminoacídica de la proteína Intl, existen hasta la fecha cinco clases de integrones que juegan un papel importante en la diseminación de genes de resistencia a antibióticos (Mazel, 2006, Cambray et al., 2010). Los integrones de clase 1 y 2 son los más prevalentes y han sido objeto de numerosos estudios (Ploy et al., 2000).
1.2.1.1 Integrón de clase 1
El integrón de clase 1 representa la estructura más común y se caracteriza por poseer 2 segmentos conservados, separados por una región variable, secuencia en donde se insertan los genes de resistencia a antibióticos en forma de casetes. La región conservada 5’ (5’-CS) contiene el gen intI, el gen attI y el promotor, la región conservada 3’ (3’-CS) comúnmente codifica para el gen sul1 (confiere resistencia a sulfonamidas), el gen qacEΔ1 (confiere resistencia a compuestos del amonio cuaternario) y un marco abierto de lectura con función desconocida, orf5. Esta región puede estar o no presente en un integrón (Stokes y Hall, 1989, Di Conza y Gutkind, 2010). 
1.2.1.2 Integrón de clase 2
El integrón de clase 2 está insertado en elementos transponibles de la familia del transposón Tn7. El gen que codifica la integrasa de clase 2 (intl2) está localizado en la región 5´-CS. Generalmente, el gen intI2 es interrumpido prematuramente por un codón de terminación. Esto lo convierte en un pseudogen, lo que explicaría los pocos arreglos que se encuentran, en comparación con el número de arreglos de los integrones clases 1. La secuencia de aminoácidos de IntI2 presenta una identidad del 40% con IntI1 (Recchia y Hall, 1995, Di Conza y Gutkind, 2010). La región 3´ usualmente contiene 5 genes envueltos en el tranposón Tn7 (tnsA, tnsB, tnsC, tnsD, tnsE) (Ploy et al., 2000).
1.2.1.3 Genes Casetes
Los casetes son elementos móviles que codifican para la resistencia a distintos antibióticos: aminoglicósidos, betalactámicos, cloranfenicol, trimetoprima, eritromicina, rifampicina, entre otros (Cambray et al., 2010). White et al. (2001) han reportado que la diseminación de genes de resistencia aumenta considerablemente cuando ellos forman parte de casetes, lo cual los habilitaría para su transferencia horizontal por varios mecanismos. Algunos incluyen la movilización de casetes entre integrones, mediada por la integrasa, en el caso de integrones que forman parte de un transposón, pueden transponerse desde el cromosoma hacia plásmidos y viceversa. Por su parte, los plásmidos conjugativos pueden transferirse de una bacteria a otra de la misma o de diferente especie.
Los casetes están formados por dos secciones: el gen estructural, encargado de codificar genes de resistencia a antibióticos y por secuencias palindrómicas no perfectas que participan activamente de la recombinación específica de sitio, denominada sitio attC (Ploy et al., 2000). La integración y escisión de los casetes depende de la proteína integrasa y de regiones de recombinación especificas ubicadas en el casete (Figura 2). La inserción de estos ocurre en la zona variable de los integrones. Los casetes se ensamblan en arreglos en tándem y se diseminan a través de las bacterias por mecanismos de transferencias horizontal (Hall y Collis, 1995). Estos genes carecen de promotor o región reguladora y es por ello que deben estar insertados en el integrón. Esta regulación de la transcripción está mediada por el promotor Pc localizado en la región 5’-CS del integrón (Di Conza y Gutkind, 2010).
Figura 2. Inserción de casete circularizado. Adaptado de Carattoli (2001).
1.3 Bacterias productoras de ETA
1.3.1 Detección de bacterias productoras de ETA
La investigación de este tipo de patógenos constituye un desafío para los sistemas de salud pública, ya que requiere obtener información y análisis de laboratorio de los restos de alimentos, de las materias primas empleadas en su elaboración y/o de las manos de las personas involucradas en la manipulación del alimento. Un alto porcentaje de los casos de ETA no puede asociarse con algún alimento en particular, el alimento implicado no está disponible o no es posible identificar al patógeno responsable, debido a que los resultados de los análisis microbiológicos en ciertos casos demoran tiempo. Esto sugiere la necesidad de establecer métodos rápidos de detección del agente (Flores y Herrera, 2005). 
Los métodos de detección se clasifican en dos grandes grupos: fenotípicos (basados en características fisiológicas o bioquímicas de los microorganismos) y genotípicos basados en el estudio del ADN, tales como la Reacción en Cadena de las Polimerasas (PCR) (Fernández-Cuenca, 2004). En los últimos años varias técnicas moleculares, como los métodos de subtipificación, basadas en el reconocimiento de porciones específicas de ADN han surgido para un reconocimiento más específico y una mejor caracterización de las ETA (Franz et al., 2014). 
Los métodos de subtipificación son esenciales en estudios de vigilancia y epidemiología de infecciones, particularmente en la investigación de brotes de ETA. Algunos métodos se pueden utilizar para demostrar si aislamientos individuales pueden, o no, estar epidemiológicamente relacionados (O’Sullivan et al., 2007), entre ellos podemos mencionar; RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis), REP-PCR (Repetitive Extragenic Palindromic PCR) AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), MLVA (Multiple-locus variable number of tándem-repeats analysis), ERIC-PCR (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus PCR) (Lindstedt et al., 2004, Fernández-Cuenca, 2004).
Las secuencias repetitivas intergénicas de consenso de las enterobacterias (ERIC) son regionesde 126 bp y están localizadas en regiones no codificantes de los integrantes de la familia Enterobacteriaceae. Las secuencias palindrómicas son clave para que los elementos ERIC presenten altos niveles de conservación. Poco se sabe sobre el origen, la evolución, el modo de generación, o la posible función de estos elementos. Se ha postulado que estas secuencias podrían actuar como sitios de unión de proteínas, incluyendo ADN polimerasa y ADN girasa (Wilson y Sharp, 2006). Estos elementos se pueden amplificar, utilizando uno o más pares de primers diseñados en función de las zonas ERIC. La variabilidad en los perfiles de bandas de ADN generados mediante ERIC viene determinada por el número de secuencias repetitivas y por la distancia que hay entre dichas secuencias, permitiendo generar un patrón de bandas electroforético basados en la frecuencia y orientación de secuencias ERIC del genoma bacteriano. Esta técnica tiene la ventaja de ser práctica, simple, rápida y económica (Hulton et al., 1991, Versalovic et al., 1991). 
1.3.2 Prevención
Las nuevas y rápidas formas de alimentación representan oportunidades para que los microorganismos contaminen los alimentos, y desafían continuamente a los responsables de mantener la seguridad alimentaria, por lo que las ETA constituyen un problema sanitario y económico de relevancia mundial (Parma, 2003). Para disminuir el riesgo de infección por patógenos se necesita un control microbiológico estricto en toda la cadena de producción de alimentos. El manejo de aquellos factores que impiden la persistencia de ETA en la cadena alimentaria ayuda a reducir los riesgos para la salud pública. La identificación de los puntos críticos de control, la aplicación de buenas prácticas de higiene, agricultura y manufactura, el control de parámetros críticos en la elaboración de alimentos como temperatura de cocción y almacenamiento, valor del pH y actividad de agua, mejoran la calidad higiénico-sanitaria de la cadena desde la granja al consumidor (Sofos, 2008).
1.3.2.1 Estrategias de prevención
Se han planteado numerosas estrategias para tratar de reducir la carga de bacterias patógenas que puedan transmitirse a través de los alimentos:
· la contaminación de las canales durante la faena es inevitable, la producción de carne libre de patógenos no se puede garantizar, es por ello que la decontaminación de canales puede mejorar la seguridad microbiológica. Para esta decontaminación se pueden utilizar ácidos orgánicos, biopreservadores, peróxido de hidrógeno, ozono o pasteurización de utensilios (Edwards y Fung, 2006).
· las estrategias de prevención para evitar la contaminación y proliferación de bacterias patógenas en los productos cárnicos no solo tienen que ser implementadas en la faena, deberían comenzar dentro del establecimiento productor. El uso de probióticos, la aplicación de mejoras en el manejo de los animales y el desarrollo de nuevas vacunas, son algunas de las estrategias propuestas para disminuir la incidencia de ETA a través del control en los animales. Teniendo en cuenta las diferentes vías por las cuales el hombre puede tomar contacto con materia fecal de los animales, las estrategias de intervención que se focalicen en el animal en pie, antes de la faena, serán de gran impacto en el mejoramiento de la seguridad de los alimentos (LeJeune y Wetzel, 2007, Sofos, 2008). 
· las frutas y hortalizas son un fuente de transmisión de patógenos, es por ello que se debe: evitar el uso de abono con materia fecal sin tratar, regar con agua segura, limitación del acceso de animales domésticos y silvestres a la zona de cultivo (Johannessen et al., 2004). Existen algunos métodos para transformar estos desechos y reducir los microorganismos patógenos, tales como los tratamientos activos o pasivos. Entre los tratamientos activos se encuentran la pasteurización, el secado por calor, la digestión anaeróbica, la estabilización con álcalis, la digestión aeróbica, o una combinación de estos. La conversión en abono es el proceso activo normalmente utilizado para reducir el riesgo microbiano en la materia fecal no tratada. Cuando dicha conversión se lleva a cabo bajo el debido control y se logran las condiciones necesarias, el riesgo de contaminación microbiana por la materia fecal animal convertido en abono es menor que la materia fecal no tratada. En los tratamientos pasivos, la materia fecal se almacena bajo condiciones ambientales naturales y se somete a variaciones de temperatura, humedad y radiaciones propias del sitio de almacenamiento. Antes de ser aplicada a los campos de cultivo, la materia fecal debe almacenarse por un tiempo suficientemente largo para lograr su descomposición y la depuración de microorganismos patógenos (FDA, 1998).
· el agua puede ser también vehículo para la transmisión de las ETA, por eso la utilización de agua potable para bebida y el tomar baños solo en aguas recreacionales habilitadas, son medidas fundamentales de prevención para los consumidores (Ashbolt, 2004).
· las 5 claves de inocuidad de los alimentos para los consumidores propuesta por la OMS son: - Mantenga la limpieza de la cocina. - Separe siempre los alimentos crudos de los cocidos y de los listos para comer (tanto alimentos como utensilios). -Cocine completamente los alimentos. - Mantenga los alimentos a temperaturas seguros.
Estos retos se vuelven más importantes debido a los cambios en la producción animal, procesamiento y distribución de alimentos y al aumento del comercio internacional. Las cambiantes necesidades de los consumidores por una mayor preferencia por los productos mínimamente procesados, constituyen una herramienta fundamental para la prevención de las enfermedades.
1.4 Consumo de carne de cerdo en Argentina 
El sector porcino tuvo su primer auge en la década del 20 en la cual el 80% de la producción se exportaba a Gran Bretaña. En esa época las amas de casa cocinaban con grasa animal y la elegida era la de cerdo, razón por la cual los cerdos que se producían tenían abundante grasa en su contextura. La aparición de los aceites vegetales a finales de los años 20 en la cocina, desplazó fuertemente a las grasas animales, produciendo una de las primeras crisis del sector. A mediados de la década del 40 del siglo pasado se registró la mayor cantidad de producción de cerdos y el mayor consumo per cápita. Esto sucedió debido a que la conformación de la población de nuestro país registraba un porcentaje muy grande de emigrantes, en su mayoría europeos, acostumbrados al consumo de carne porcina. Pero en esas épocas en nuestra región existía la posibilidad de consumir otra carne, que era rica y muy accesible económicamente, la del bovino. Esto relegó a la producción porcina y destinarse casi exclusivamente para la elaboración de productos. A finales de los 70 nuestro país comenzó nuevamente a exportar, la existencia de una enfermedad en el rodeo con más de 100 años como la Peste Porcina Clásica, empezó a dificultar los mercados para comercializar el cerdo y terminó con el cierre prácticamente todas las granjas. A principios de los 90 con la inclusión de Argentina en el mundo, la producción porcina nacional que estaba destinada a la producción de chacinados, se vio compitiendo con grandes productores, que por mejor eficiencia y volumen tenían precios más competitivos y la misma industria chacinadora comenzó a importar; esto fue el comienzo de uno de los desconciertos más importantes del sector. Entonces surgió la necesidad de abrir dos caminos, el primero fue abrir la exportación cerrada por 25 años y la erradicación la Peste Porcina Clásica. El segundo, fue promover el aumento en el consumo de carne fresca, en donde alcanzó a fines del 2010 un consumo de 7,8 kg. per cápita http://www.porcinos.org.ar/0026.htm.
Según la nota del diario La Nación de Diego Cabot de julio de 2015 “Buena época para la carne de cerdo”: “El asado argentino tiene cada vez más variedad de carnes. En los últimos diez años el consumo per cápita de carne de cerdo subió como pocos. En 2004 cada habitanteargentino consumía en promedio cuatro kilogramos de carne porcina. El año pasado, esa misma persona consumió 14 kilogramos de carne porcina. "Y en lo que va del año, hemos notado un crecimiento que dará en este 2015 un consumo per cápita de alrededor de 14,5 kilogramos de carne porcina por año", dice Juan Uccelli, presidente de la Asociación Argentina de Productores de Porcinos (AAPP). Según datos de los empresarios del sector, de esos 14,5 kilogramos que se consumen alrededor de 11,5 es carne fresca. "El resto son chacinados", Aquí se esconde el dato más ilustrativo de este verdadero boom de este producto. Cuando se desagrega el número se ve que lo que en realidad subió es el consumo de carne fresca. En 2004, por caso, de los cuatro kilos que se consumían tres se los llevaban los chacinados, históricos protagonistas de asados y picadas criollas. "Ese número está igual; de los 14,5 kilogramos los chacinados se mantienen en tres kilos", dijo Uccelli. Salvo una pequeña proporción, la Argentina produce la carne de cerdo que consume el mercado. En la Asociación explican que todo lo que se importa se consume en la producción de chacinados. Aproximadamente 300 gramos por kilo corresponde a carne importada. Los criadores de cerdo se entusiasman con las proyecciones: imaginan un crecimiento de 20% anual en la demanda, en los próximos años. Otro de los puntos que tiene el consumo de este tipo de carne es la estacionalidad. Asociada a los asados, los picos de demanda llegan en la primavera y el verano” http://www.lanacion.com.ar/1809506-buena-epoca-para-la-carne-de-cerdo
1.5 Hipótesis
Teniendo en cuenta que:
· las ETA constituyen uno de los problemas sanitarios más relevantes en salud pública, 
· Argentina es uno de los países con una alta incidencia de casos de ETA a nivel mundial y uno de los países con mayor cantidad de niños afectados. 
· los principales reservorios de las bacterias causantes de ETA son los animales de sangre caliente y el ambiente, siendo su principal vía de transmisión los alimentos contaminados, fundamentalmente los productos cárnicos. 
· en los últimos años en nuestro país se produjo un incremento en la producción y consumo de carne de cerdo y productos derivados, nos plateamos que:
“La contaminación por bacterias productoras de ETA (Escherichia coli verocitotoxigénica (VTEC), Salmonella spp. y Staphylococcus aureus) aumenta desde la granja hasta el punto de venta debido a la manipulación incorrecta de los alimentos”.
1.6 Objetivo general 
Detectar por métodos moleculares bacterias implicadas en enfermedades transmitidas por alimentos. Identificar puntos de contaminación en la cadena de producción y comercialización porcina como herramienta para dirigir estrategias de prevención tendientes a disminuir los riesgos en salud pública.
En la presente Tesis Doctoral, para su mejor comprensión, se organiza en capítulos para cada una de las bacterias estudiadas, donde se detallaran los objetivos específicos.
22
CAPÍTULO II
85
2.1. Diseño
Este estudio fue realizado en dos Empresas ubicadas en la provincia de Buenos Aires (Empresas A –B) que poseen el siguiente diagrama de producción:
CRIADERO
FRIGORÍFICO
DESPOSTE
BOCA DE EXPENDIO
	
2.2 Manejo de las granjas y de los animales
Ambas granjas estaban organizadas en sistemas intensivos y el manejo era similar. De acuerdo a las edades de las categorías se dividieron en: madres en gestación, madres en lactancia, lechones en lactancia, lechones de destete y recría y lechones de desarrollo y terminación. Las categorías se encontraban geográficamente separadas entre sí. Cuando los cerdos llegaban a 70 días de vida y a un peso aproximado de 35 kg eran transferidos al área de terminación. Cada recinto estaba dividido en habitaciones y cada habitación consistía en un número variable de animales, dependiendo del tamaño del grupo que variaba entre 10 y 30 cerdos. 
Los cerdos y los empleados se movían de un edificio a otro por medio de corredores aislados de tráfico externo.
2.3 Manejo de las canales hasta la boca de expendio
Los cerdos en etapa de terminación eran transportados al frigorífico. Después de la faena, las canales de cerdos se refrigeraban por 24 a 48 h.
En la empresa A las canales eran despostadas en una sala en el mismo lugar que el frigorífico y en la empresa B las canales eran enviadas a una sala de desposte en otra ciudad en camiones refrigerados.
En las salas de desposte, tanto en la empresa A como en la empresa B, las canales eran despostadas hasta corte de carnes, carne picada o subproductos, tales como chorizos.
Solo se logró obtener muestras de boca de expendio de la empresa B, ya que la empresa A vendía a varias carnicerías de otras ciudades, dato que no nos fue provisto.
2.3 Total de muestras tomadas
	LUGAR DE MUESTREO
	TOTAL MUESTREADOS
	Criadero
	348
	Frigorífico
	147
	Desposte
	182
	Boca de expendio
	87
	TOTAL
	764
Tabla 1. Total de muestras tomadas en la cadena productiva porcina.
2.3.1 Criadero
Trescientas cuarenta y ocho muestras fueron tomadas en los criaderos, de estas, 277 corresponden a hisopados rectales tomados al azar en las distintas categorías. Setenta y un muestras fueron recolectadas del medio ambiente de las granjas, de las cuales 51 pertenecían a materia fecal recolectada del piso, 10 a alimentos de todas las categorías y 5 a los bebederos de cada categoría.
Cálculo del tamaño muestral
Para calcular el tamaño muestral se consideró el escenario más desfavorable, según prevalencias supuestas de previos estudios y suponiendo que la proporción de positivos es del 50%, con un nivel de confianza del 95% y una certeza del 10%. Para el cálculo se utilizó la siguiente expresión:
Donde:
n' = tamaño de la muestra
z(1-) = valor de la distribución normal para un nivel de confianza del 95%
P= Proporción supuesta (50%)
D = Certeza ó precisión
Se estimó un tamaño muestral para cada categoría de animales el cual fue ajustado por el total de individuos que componen cada categoría (N) con la siguiente expresión:
	CATEGORÍAS
	CRIADERO A
	CRIADERO B
	MUESTREO
	Madres gestación
	370
	350
	42
	Madres lactancia
	50
	44
	21
	Lechones lactancia
	500
	440
	66
	Destete y recría
	1000
	980
	46
	Desarrollo y terminación
	2100
	1960
	102
	TOTAL
	4020
	3774
	277
Tabla 2. Número de animales en cada criadero de las empresas A y B y número de animales totales muestreados según cálculo de tamaño muestral.
2.3.2 Frigorífico
Ciento cuarenta y siete muestras fueron tomadas del frigorífico, de las cuales 22 pertenecían a hisopados rectales de cerdos post-faena, 85 a canales y 40 del medio ambiente del frigorífico (corresponden a toda la línea de producción que incluye desollado, escaldado, pelado con calor, evisceración, separado de canales, utensilios de los operarios y alrededores del mismo: corral de espera y tratamiento de efluentes).
Los hisopados de las canales fueron tomados de acuerdo con la Circular No 3496/02 del Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (SENASA, 2002). Se tomaron 5 áreas de 100 cm2 que cada una fue procesada separadamente, nombradas cabeza, cuarto trasero externo, cuarto trasero interno, cuarto delantero externo y cuarto delantero interno (Figura 3).
Figura 3. Sitios de muestreo según Circular No 3496/02.
2.3.3 Desposte
Ciento ochenta y dos muestras fueron tomadas de las salas de desposte y de la sala de elaboración de productos. Noventa y cinco hisopados de cuartos fueron muestreadas con igual procedimiento que frigorífico (SENASA, 2002). 
Se tomaron, también 24 muestras que pertenecían a cortes de carne, 23 a carne picada y 40 a muestras de medio ambiente (camión de transporte y superficie de contacto con la carne: tablas, cuchillos, maquinas amasadoras de carne y maquinas cortadoras de carne).
2.3.4 Boca de expendio
Se tomaron 87 muestras de boca de expendio solo de la empresa B. De estas muestras se tomaron mediante hisopados a 34 cortes de carne, 6 de carne picada, 9 carne picada para chorizos, 31 a muestras de instalaciones (tablas,mesadas, cuchillos, cortadoras de carne y heladeras) según Circular No 3496/02 del Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (SENASA, 2002). Además se recolectaron 7 muestras de 10 gr de carne picada, que se obtuvieron en bolsas individuales para su posterior procesamiento.
CAPÍTULO III
3.1 Escherichia coli
Escherichia coli pertenece al orden de las Eubacteriales, familia Enterobacteriaceae, tribu Escherichieae, género Escherichia, especie coli (Scheutz y Strockbine, 2005). Fue descripta por primera vez en 1885 por Theodore von Escherich, bacteriólogo alemán, quien la denominó Bacterium coli. Posteriormente se le adjudicó el nombre de Escherichia coli, en honor a su descubridor (Escherich, 1988). Esta bacteria forma parte de la flora normal del hombre y de los animales de sangre caliente, y es el habitante predominante del intestino manteniendo la fisiología del huésped (Kinnersley et al., 2009).
Figura 4. Escherichia coli a 1000 nm (Scheutz y Strockbine, 2005).
3.1.1 Características generales
Son bacilos, Gram negativos, rectos de 1,1-1,5 por 2,0-6,0 µm, pueden aparecer aislados o en pares, móviles o inmóviles, oxidasa negativos, no formadores de esporas y fermentadores de glucosa y lactosa. Puede vivir en presencia o ausencia de O2. En condiciones anaeróbicas puede crecer por medio de la fermentación, produciendo ácido y gas. Sin embargo, sino crecen en esta condiciones pueden utilizar nitrato y nitrito. En parte, esta versatilidad le otorga a E. coli la habilidad de adaptarse a vivir en el intestino o fuera del mismo. La temperatura óptima de crecimiento oscila entre los 35°C y 42°C, a 7°C reduce su crecimiento y a -20°C continúa siendo viable pero sin desarrollo. Necesita para sobrevivir una actividad de agua (aw) entre 0,95 y 0,99. Si bien su pH óptimo de crecimiento es entre 6,5 y 7, puede sobrevivir en pH tanto ácidos como alcalinos (rango de pH 2,5 a 9,0) (Scheutz y Strockbine, 2005, Shiloach et al., 2010).
3.1.2 Patotipos
La mayoría de las cepas de E. coli no son patógenas, aunque hay distintos tipos de E. coli que han adquirido factores de virulencia específicos, que le confieren la habilidad de adaptarse a nuevos nichos ecológicos y que causan un amplio espectro de enfermedades (Kaper et al., 2004). Se ha propuesto un esquema de clasificación basado en la presencia de factores de virulencia, donde las características que forman la base de este esquema incluyen: adhesión de las bacterias en las células huéspedes, efectos de esta adhesión en las células huéspedes, producción de toxinas y/o invasividad. Solo las combinaciones más exitosas pueden persistir y se denominan “patotipos”. De acuerdo con la enfermedad clínica que producen estos patotipos se han identificado al menos seis asociados con infecciones gastrointestinales: 
E. coli enteropatogénica (EPEC); 
E. coli enterotoxigénica (ETEC); 
E. coli verocitotoxigénica (VTEC); 
E. coli enteroinvasiva (EIEC); 
E. coli enteroagregativa (EAggEC) y 
E. coli de adherencia difusa (DAEC) (Nataro y Kaper, 1998).
3.1.3 E. coli verocitotoxigénica (VTEC)
Estas bacterias se llaman verocitotoxigénicas porque producen toxinas llamadas verocitotoxinas que tienen la propiedad de destruir in vitro las células de cultivos celulares Vero (Konowalchuk et al., 1977). También a estas toxinas se las conoce como Shiga toxinas (Stx) por su relación estructural e inmunológica con la toxina shiga producidas por las cepas de Shigella dysenteriae (O'Brien et al., 1982). El nombre VTEC (Escherichia coli verocitotoxigénica) y STEC (Escherichia coli productor de toxina Shiga) son equivalentes.
En los años ´70 se reportó por primera vez que cultivos filtrados de algunas cepas de E. coli obtenidos de niños con diarrea tenían efecto citotóxico en cultivos de células Vero (Konowalchuk et al., 1977). En EEUU, en al año 1982, después de llevar a cabo el análisis de dos brotes epidemiológicos, se encontró la asociación entre el serotipo O157:H7 y la ingestión de hamburguesas mal cocidas en una cadena de restaurantes de comida rápida (Riley et al., 1983). La evolución en el conocimiento de la virulencia de VTEC comenzó a aclararse cuando Karmali et al. (1983) observó que las toxinas producidas por VTEC eran responsables del síndrome urémico hemolítico (SUH).
3.1.4 Seropatotipos 
La diferenciación entre estas cepas se refiere a los marcadores antigénicos que se encuentran en su superficie, el antígeno somático “O” del lipoporisacárido de la pared celular y el antígeno flagelar “H” de cepas móviles. Existen más de 180 serogrupos y más de 60 antígenos H, dando más de 10.000 combinaciones posibles (Robins‐Browne y Hartland, 2002). 
Las cepas VTEC que causan infecciones en seres humanos pertenecen a un amplio abanico de serotipos. Dentro del grupo de VTEC existe un subgrupo denominado E. coli enterohemorrágico (EHEC) que incluye a todas las cepas que causan enfermedad en el hombre, donde el prototipo de este grupo es el serotipo O157:H7. Debido a la importancia del serotipo O157:H7 en la enfermedad del hombre, es común clasificar los serotipos de VTEC en dos categorías: O157 y no-O157 (Gyles, 2007).
Existe otra clasificación propuesta por Karmali et al. (2003), que divide a las cepas VTEC en 5 seropatotipos, según la incidencia y asociación de casos de SUH y brotes. El seropatotipo A incluye a cepas altamente virulentas de los serotipo O157:H7 y O157:H-. El seropatotipo B incluye los serotipos O26:H11, O103:H2, O111:H8/H-, O121:H19, O145:H-. El seropatotipo C incluye los serotipos O5:H-, O91:H21, O104:H21, O113:H21, O121:H-, O165:H25, entre otros. El seropatotipo D incluye serotipos que nunca se han asociado con SUH, pero que sí se han aislados de pacientes con diarrea y colitis hemorrágica, tales como O7:H4, O69:H11, O103:H25, O113:H4, O117:H7, O119:H25, O132:H-, O146:H21, O171:H2, O172:H-, O174:H8 entre otros. Por último, el seropatotipo E incluye serotipos aislados de animales, alimentos y del medioambiente no implicados nunca con casos clínicos en humanos. 
3.1.5 Fisiopatogénesis y Factores de virulencia
La patogenicidad de VTEC representa un complejo fenómeno que aún no está bien dilucidado. Los humanos son expuestos a una amplia variedad de cepas de VTEC, que se pueden encontrar en reservorios animales, alimentos o el medio ambiente. Pero estas cepas necesitan un conjunto de determinantes genéticos, como factores involucrados en la colonización, toxinas, entre otros para desarrollar patogenicidad (Imamovic et al., 2010).
El mecanismo de patogénesis de VTEC consiste en la colonización del intestino y producción de daño al hospedador debido a la producción de toxinas, que involucra múltiples procesos y una compleja interacción entre factores bacterianos y del hospedador. Luego de sobrepasar las barreras de defensa del hospedador, la bacteria alcanza el intestino donde se activan los genes de virulencia y VTEC se adhiere a los enterocitos sin invadirlos (Figura 5) (Kaper et al., 2004, Gyles, 2007).
3.1.5.1 Locus LEE 
Algunas cepas VTEC son capaces de colonizar la mucosa intestinal e inducen una lesión histopatológica definida como attaching and effacing (A/E) (Jerse y Kaper, 1991). La lesión A/E involucra cambios estructurales en la célula epitelial y una íntima adherencia de la bacteria a la membrana de la célula. Por debajo de la bacteria adherida, existe una acumulación de ciertos componentes del citoesqueleto, que contribuyen a la formación de un pedestal de actina polimerizada, incluyendo pérdidas de las microvellosidades (Gyles, 2007). Esta lesión es gobernada por una isla de patogeneicidad llamada Locus Enterocyte Effacement (LEE). El LEE es una isla que contiene 41 genes y está organizada en 5 operones (LEE 1 a LEE 5). Los productos de secreción del LEE son: 1) un aparato de secreción de tipo III (LEE 1 a LEE 3), 2) un sistema de translocación de proteínas (LEE 4) y 3) un sistema de adherencia que consiste en una proteína de membrana externa llamada intimina, codificada en el gen eae con su receptor translocado de intimina (Tir) (LEE5). Además LEE secreta otras proteínas que incluyen, EspF (proteína F secretada por Escherichia coli), EspP, EspI, entre otras que son necesarias para los eventos iniciales de transducción (Kaper et al., 2004). 
La proteína Tir es insertada por un sistema de secreción de tipo III (SST3) en la membrana de la célula huésped donde actúa como el receptor para la intimina de la membrana externa de la bacteria (Kenny y Finlay, 1995). La intimina media la adherencia de la bacteria a las células de epitelio intestinal. Se han identificado numerosos subtipos de intimina producidos por diferentes serotipos, entre ellos: α1, α2, β, , , , , , , , (Gyles, 2007).
3.1.5.2 Verocitotoxinas (VTs)
Las VTs son los determinantes de virulencia más importante de VTEC y están codificadas en profagos insertados en el genoma bacteriano (Paton y Paton, 1998). Los miembros de VTs son holotoxinas de tipo AB de 70 KDa aproximadamente y comprenden una subunidad A catalítica de 32 KDa y cinco subunidades B de 7,7 KDa, formando un pentámero, siendo esta última la responsable en la unión de la toxina al receptor glicolípido de la célula blanco (O'Brien y Holmes, 1987). Antigénicamente, las VTs se dividen en dos grupos principales: VT1 y VT2. Una cepa VTEC puede sintetizar sólo VT1, sólo VT2 o ambos y existen diferencias en citotoxicidad entre VT1 y VT2. Head et al. (1991) observaron que VT2 es 1000 veces más tóxica que VT1. El grupo VT1 consiste en VT1; VT1c (Friedrich et al., 2003) y VT1d (Kuczius et al., 2004). VT2 es un grupo más heterogéneo de toxinas con muchas variantes antigénicas: VT2, VT2c, VT2d, VT2e, VT2f y VT2g (Schmidt et al., 2000, Friedrich et al., 2002, Sonntag et al., 2005, Scheutz et al., 2012).
La subunidad A de la toxina posee una actividad enzimática que le permite cortar un residuo de adenina. Se generan entonces un fragmento N-terminal A1, y éste tiene actividad N-glicosídica sobre el ARN que le permite remover este residuo de adenina en la subunidad 28S del ribosoma, impidiendo la unión del aminoacil-ARNt a la subunidad ribosomal 60S y así, evitar la síntesis proteica en las células blanco (Paton y Paton, 1998). El grupo de subunidades B se une específicamente a un receptor glicolípido: globotriaocilceramida (Gb3). La variante VT2e utiliza como receptor preferencial una globotetraosilceramida (Gb4) (Sandvig et al., 1994). Luego de la unión, la subunidad A entra a la célula por un mecanismo de endocitosis receptor dependiente, la vesícula internalizada se fusiona con los lisosomas y es translocada al aparato de Golgi primero y luego al citosol (Sandvig y Van Deurs, 1996). Durante este proceso, la toxina producida en el intestino, pasa a la circulación sanguínea y el daño de los distintos órganos por la toxina circulante depende de la distribución de los receptores. En el riñón, particularmente a nivel cortical, las células endoteliales de los glomérulos se hinchan y desprenden de la membrana basal. Los trombos formados como consecuencia de las lesiones vasculares obstruyen el lumen capilar, y la consecuente reducción del flujo sanguíneo aumenta aún más la pérdida de la función renal. También se observan lesiones trombóticas, particularmente en la microvasculatura del intestino, cerebro y páncreas (Robins‐Browne y Hartland, 2002). 
En 1988 se reportó por primera vez el operón de la variante VT2e asociado a la enfermedad de los edemas del cerdo (Gyles et al., 1988). La secuencia de aminoácidos de la subunidad A de VT2e es de 1 de aminoácido más que la de VT2 y exhibe 94% de homología con la misma. La subunidad B de VT2e es 2 aminoácidos más corta que la de VT2, y con 87% de homología. Las variaciones en la subunidad B de VT2e con respecto a VT2 son responsables de la citotoxicidad reducida para células HeLa, que carecen del receptor Gb4 (receptor para la variante VT2e) (Weinstein et al., 1989). Esto podría explicar que la patogenicidad de cepas VTEC con esta variante toxigénica es menor, ya que si bien se han aislado de casos de SUH, en general se encuentran en individuos asintomáticos y/o pacientes con diarrea (Sonntag et al., 2005, Kaufmann et al., 2006, Trotz-Williams et al., 2012). VTEC provocan una amplia variedad de problemas intestinales en cerdos, por ejemplo, diarrea de los lechones (colibacilosis en neonatos y post–destete) y la enfermedad de los edemas. Esta enfermedad es una toxemia hiperaguda, caracterizada por necrosis vascular, edema, signos neurológicos y en algunos casos puede ser fatal (Niewerth et al., 2001). VTEC coloniza el intestino y luego produce la toxina VT2e. Esta toxina entra el torrente sanguíneo y se une al receptor específico, Gb4, que se localiza en las células epiteliales. Cepas de VTEC que producen enfermedad de los edemas en cerdos poseen otros factores de virulencia distintos a cepas aisladas de casos clínicos en humanos. Por ejemplo, la fimbria F18, esencial para la adherencia en el intestino (Sonntag et al., 2005, Tseng et al., 2014).
3.1.5.3 pO157
El plásmido fue descripto por Karch et al. (1987) y se detectó en una cepa de E. coli O157 causante de un brote de colitis hemorrágica (CH) y desde ese momento ha sido implicado en la patogénesis de las enfermedades asociadas a VTEC. Se denomina megaplásmido (60 MDa) o plásmido enterohemorrágico (pO157) y está presente en E. coli O157 y algunos serotipos no-O157 (Burland et al., 1998, Etcheverría y Padola, 2013). Contiene el gen ehxA, que codifica para una toxina denominada enterohemolisina, cuya función es liberar la hemoglobina presente en los glóbulos rojos, dándole a la bacteria una fuente de hierro (Schmidt et al., 1996). Otros factores de virulencia presentes en este plásmido comprenden una catalasa-peroxidasa y una serin-proteasa codificada por los genes katP y espP, respectivamente; el gen toxB, que estaría involucrado en la colonización del tracto gastrointestinal del huésped influenciando la expresión de proteínas del SST3 codificado en el LEE e inhibiendo la activación de los linfocitos del huésped, entre otros (Brunder et al., 1996, Tatsuno et al., 2001).
3.1.5.4 pO113
 En algunos serotipos de VTEC no-O157 se identificó un plásmido de secuencia similar al pO157, denominado megaplásmido pO113. Contiene los genes saa, lpf, sab y subAB. El gen saa codifica una adhesina autoaglutinante, asociada especialmente a cepas no-O157 LEE-negativas. Saa (del inglés, STEC autoagglutinating adhesin) se localiza en la membrana externa y es expuesta sobre la superficie celular, por lo cual tiene un rol importante en la adherencia bacteriana a la célula (Paton et al., 2001). El gen lpf codifica una fimbria polar larga que incrementa la adherencia, la habilidad de colonización y la persistencia de la infección de estas cepas (Farfan y Torres, 2012). El gen sab codifica una proteína que contribuye a la adherencia y a la formación de biofilm (Herold et al., 2009). Algunas cepas VTEC producen una toxina adicional (denominada citotoxina subtilasa), que también produce daño microvascular, trombosis y necrosis en varios órganos, incluyendo cerebro, riñones e hígado. La subunidad B, al igual que lo que ocurre con las VT, forma un pentámero que se une a receptores glicolipídicos ubicados sobre la superficie celular. Se ha postulado que cepas que poseen esta citotoxina son capaces de aumentar los efectos de VT2 causando una patología adicional (Wang et al., 2007). El prototipo de citotoxina subtilasa (SubAB) se detectó en la cepa VTEC O113:H21 LEE-negativa, responsable de un brote de SUH en Australia (Paton y Paton, 2005).
3.1.6 Cepas Locus LEE-negativas
No hay duda de que existe una fuerte asociación entre la presencia del Locus LEE y la capacidad de VTEC de causar enfermedad severa en el hombre. Pero la presencia de este locus no estaría absolutamente ligada a la enfermedad ya que existen un gran número de cepas que no contienen el gen eae codificado en LEE. Estas cepas se denominan VTEC LEE-negativas que son capaces de causar enfermedad severa, tales como los serotipos O91:H21, O113:H21 y O174:H21 que han sido aislados en brotesy casos esporádicos de SUH (Paton y Paton, 1998, Girardeau et al., 2009, Bielaszewska et al., 2011). Por lo tanto, en estas cepas, otros factores de adherencia adicionales estarían involucrados en la patogénesis, donde el mecanismo de colonización no está bien dilucidado y es probable que sea diferente entre ellas debido a que es un grupo genética y filogenéticamente diverso. Sin el locus LEE, las cepas VTEC LEE-negativas deben adherirse al epitelio intestinal por medios distintos al complejo intimina identificados en el genoma de las cepas LEE-positivas.
Figura 5. Fisiopatogénesis de VTEC adaptado de Vallés (2015).
3.1.7 Manifestaciones clínicas
Desde hace tres décadas, VTEC es considerado un patógeno emergente transmitido por alimentos asociado a casos esporádicos y brotes de diarrea, colitis hemorrágica (CH) y SUH (Rivas et al., 2010). El SUH fue descripto por primera vez por Gasser (1955) en Suiza. Sin embargo, Karmali et al. (1983) fue quien identificó la toxina producida por VTEC como un factor causante de SUH. En la Argentina, los primeros casos fueron descriptos por Gianantonio et al. (1964). 
Las manifestaciones clínicas comienzan con diarrea acuosa, dolor abdominal y, ocasionalmente, náuseas y vómitos. El 70% de los pacientes puede progresar a CH dentro de 1 a 2 días, con evidencia de edema y erosión de la mucosa del colón. La CH es una manifestación clínica caracterizada por dolores abdominales, presencia de sangre en las heces y, ocasionalmente, fiebre (Riley et al., 1983, Noris y Remuzzi, 2005). Aunque en la mayoría de los casos la diarrea por VTEC es autolimitante, entre el 5 y el 10% de los niños infectados evolucionan a SUH. La alta incidencia de SUH es reportada en niños menores de 5 años y posee un aumento estacional de casos en primavera y verano (Grisaru, 2014). El SUH es una entidad clínica y anatomopatológica que se caracteriza por insuficiencia renal aguda, anemia hemolítica microangiopática y trombocitopenia, de localización predominantemente renal (Gianantonio et al., 1964). Es una enfermedad sistémica que puede afectar varios órganos; sin embargo, las complicaciones más graves son del sistema nervioso central. Muchos pacientes presentan letargo, estupor, coma, así como accidentes cerebrales (Noris y Remuzzi, 2005, Grisaru, 2014). La insuficiencia renal aguda se caracteriza por una progresión a oliguria y desbalances de electrolitos, requiriendo terapia renal en el 50 a 70% de los pacientes. El 25% de los pacientes poseen secuelas permanentes como falla renal, hipertensión y neurológicas. El rango de mortalidad es del 2-10% (Nathanson et al., 2010). Hasta la fecha no existe tratamiento para esta enfermedad, solo terapia de sostén, que incluye medidas destinadas a corregir alteraciones hidroelectrolíticas, neurológicas y/o hipertensión arterial (Noris y Remuzzi, 2005). Agentes antiperistálticos y antibióticos podrían tener impactos negativos en el desarrollo de la enfermedad (Wong et al., 2000). 
3.1.8 Epidemiología
La mayoría de los grandes brotes ocasionados por VTEC se atribuyen a E. coli O157:H7; sin embargo, se han aislado otros serotipos diferentes de casos clínicos. El aumento de brotes y casos de SUH ocasionados por cepas de VTEC no-O157 generan en la actualidad gran preocupación a nivel mundial tanto por el número de personas afectadas, como por los vehículos de transmisión identificados. 
En Europa continental los serotipos más comunes son O103:H2, O26:H11, O117:H7, O91:H– , O145:H– , O63:H6, O128:H2, O111:H– y O146:H21, O104:H4 (Messens et al., 2015). Un total de 3.816 casos fueron reportados en el centro de Alemania entre el 21 y el 22 de mayo del 2011. Alrededor de 845 pacientes desarrollaron SUH. Este brote fue debido a VTEC O104:H4 asociado con el consumo de brotes de fenogrecos crudos (Frank et al., 2011). En Gran Bretaña 3.700 casos fueron reportados entre los años 2009 y 2012, y donde la incidencia es fue del 1,8 casos cada 100.000 habitantes por año (Byrne et al., 2015). 
En EEUU se estima que VTEC causa 265.000 de casos, 3.600 hospitalizados y 30 muertes por año. La mayoría de los brotes causados se debe al serogrupo O157, aunque se han reportado otros serogrupos como O26, O103, O111, O121, O145, entre otros (Scallan et al., 2011). En el año 2013 se estimó una incidencia de 1,9 casos cada 100.000 habitantes (Adams et al., 2014).
En Canadá, la incidencia de las infecciones por VTEC es de 0,7-8 casos cada 100.000 habitantes, donde los brotes se originan por consumo de carne molida mal cocida y agua contaminada, y por contacto directo con el ganado (Grisaru, 2014).
En América Latina el problema se concentra en los países del cono sur. En Brasil distintos estudios han demostrado que en los últimos años la incidencia de VTEC es relativamente baja (Cergole-Novella et al., 2006, Guth et al., 2010). En Chile, los serogrupos identificados con mayor frecuencia en casos clínicos durante el periodo 2007-2013 fueron O157 y O26. No obstante, estos son los serogrupos más buscados en ese país debido a la disponibilidad de antisueros por lo que no se puede restar importancia a otros serogrupos circulantes a nivel local (ISP, 2014). En Uruguay ocurren entre 10 y 15 casos nuevos por año, y la tasa de incidencia es de 4 a 5/100.000 niños menores de 5 años (Varela et al., 2007).
En Argentina, el SUH es endémico y constituye la primera causa de insuficiencia renal aguda y la segunda de insuficiencia renal crónica, y es responsable del 20% de los transplantes renales en niños y adolescentes (Mead y Griffin, 1998). Actualmente, nuestro país presenta el registro más alto de casos de SUH a nivel mundial, con aproximadamente 500 casos nuevos declarados anualmente y una incidencia de 17 casos cada 100.000 niños menores de 5 años de edad. La enfermedad está distribuida en todo el país con un importante subregistro, pero la frecuencia es mayor en las provincias del centro y sur durante los meses cálidos, aunque se registran casos durante todo el año (Rivas et al., 2010). Entre los años 2004 y 2008, un total de 846 casos de VTEC fueron confirmados, donde los serotipos más prevalentes fueron O157:H7 (635; 74,9%), O145:NM (113; 13,3%), O121 (19; 2,2%), O26 (15; 1,8%), O174 (9; 1,1%), O111 (5; 0,6%), O8 (4; O,5%), entre otros (Rivas et al., 2011).
El rol de VTEC no-O157 en muchos países se encuentra subestimado, ya que la mayoría de los laboratorios no realizan análisis de rutina para este tipo de cepas. Pero de acuerdo con previos estudios desde 1983 a 2002, alrededor del 70% de las infecciones por VTEC no-O157 fueron causados por 6 serotipos, incluyendo, O26, O45, O103, O111, O121 y O145 (Brooks et al., 2005). En 2011, el Departamento de Agricultura de EEUU (USDA) declaró a estos serotipos (ahora llamados Big Six) como adulterantes de carne y carnes molidas. Debajo de esta nueva reglamentación, las carnes que posean estos patógenos no podrán ser vendidas (Yoon et al., 2013). 
Figura 6. Incidencia (casos cada 100.000 niños menor de 5 años) de SUH en diferentes provincias Argentinas (Rivas et al., 2011).
3.1.9 Vías de transmisión 
La principal vía de contaminación la constituyen los alimentos. La bacteria puede contaminar la superficie de la canal durante el proceso de faena al tomar contacto con el contenido intestinal. Luego en el picado de la carne la contaminación bacteriana se transfiere de la superficie al interior del producto donde los microorganismos pueden resistir una cocción insuficiente (Erickson y Doyle, 2007). En la actualidad, un mayor número de productos alimenticios han sido involucrados en brotes y casos esporádicos tales como, leche no pasteurizada, yogur, quesos, helados, jugos de manzana no pasteurizados, agua, entre otros (Heiman et al., 2015, Gill y Oudit, 2015, Buvens et al., 2011). Estos microorganismos también se han encontrado en productos vegetales tales como lechuga, melones, alfalfa, soja y semillas de fenogreco. La contaminación de estos puede ser consecuencia del uso de materia fecal como abono (Blanco, 2012, Erickson y Doyle, 2007). VTEC se haaislado también en carne de cerdos y subproductos como embutidos fermentados (Bouvet et al., 2002, Trotz-Williams et al., 2012). La dosis infectiva de VTEC es sumamente baja, sólo 10 bacterias en el alimento puede producir enfermedad (Blanco et al., 1996). 
Se han informado varios brotes por el consumo de agua o por bañarse en aguas recreacionales contaminadas. En EEUU, en el año 1998 un brote por VTEC O157:H7 afectó a 157 personas y se asoció significativamente con la ingesta de agua municipal (Olsen et al., 2002). En Canadá en el año 2000 fue reportado el mayor brote registrado por el uso de aguas recreacionales contaminadas, se estimó 2300 casos siendo 7 fatales. Campylobacter jejuni y VTEC O157 fueron los patógenos identificados y en los casos fatales VTEC O157 (Heijnen y Medema, 2006). 
Otras formas de transmisión incluyen la contaminación cruzada durante la preparación de los alimentos, el contacto directo del hombre con los animales domésticos o silvestres en granjas educativas o zoológicos, y el contacto persona a persona por la vía fecal-oral (Gyles, 2007).
3.1.10 Reservorios y Prevalencia
En distintos países, entre los que se incluye a la Argentina, se realizaron numerosos estudios sobre la prevalencia de VTEC que permitieron confirmar el rol del ganado bovino como principal reservorio de este microorganismo (Parma et al., 2000a, Padola et al., 2004, Amézquita-López et al., 2014, Sanz et al., 1998). Estos microorganismos no se asocian con enfermedades en el ganado y no se consideran patógenos para el bovino, forman parte de la flora normal intestinal donde se comportan, en la mayor parte de los casos, como comensales (Padola et al., 2004). 
Aunque el bovino es considerado el principal reservorio de VTEC existen otros reservorios de tales como, cerdos, ovinos, perros, gatos, conejos, pollos, paloma, entre otros (Beutin et al., 1993, Trotz-Williams et al., 2012). Los cerdos son reservorios de VTEC y juegan un rol en la contaminación de carne de cerdo, habiéndose informado casos esporádicos por consumo de carne de cerdo contaminada con VTEC (Trotz-Williams et al., 2012).
Existen numerosos estudios que demuestran la prevalencia en granjas, cerdos de faena o terminación, frigoríficos y carnes de cerdos. Pero no existe ningún reporte que demuestre esta prevalencia a lo largo de la cadena productiva porcina. 
Las prevalencias en granjas de cerdos de distintas categorías varían en un rango del 0 al 20%. En Argentina se estudiaron 28 criaderos en la región central del país, en ningún animal se detectó cepas VTEC, pero si cepas que poseían factores de virulencia tanto para ETEC y VTEC, es decir que una misma cepa tenia ambos factores de virulencia (Parma et al., 2000b). En un estudio realizado en 11 granjas de producción porcina ubicadas en las provincias de Buenos Aires y Santa Fé, se analizaron 21 VTEC aisladas de cerdos sin manifestación clínica de diarrea. De las 21 VTEC analizadas, 7 presentaron al gen vt1 y 14 vt2. Entre los 14 aislamientos portadores del gen vt2, 12 presentaron el gen vt2e (Moredo, 2012). En Sudáfrica, la prevalencia fue del 0,9% (Mohlatlole et al., 2013), en China fue del 1,1% al 10,83% en diferentes regiones (Meng et al., 2014, Yan et al., 2011), en Japón fue 14% (Kijima‐Tanaka et al., 2005) y en Polonia 19% (Osek, 1999). En Gran Bretaña se observó una prevalencia del 0,3% de VTEC O157 (Milnes et al., 2009), en Brasil del 1,4% (Martins et al., 2010), en Bélgica del 7,9% (Botteldoorn et al., 2003) y en Suiza del 22% (Kaufmann et al., 2006). En cuanto a la prevalencia en hisopados de canales en frigoríficos varían en un rango de 0,2% a 26% en diferentes regiones del mundo (Leung et al., 2001, Bouvet et al., 2002, Bohaychuk et al., 2011, Koláčková et al., 2014). 
Diversos estudios demuestran la prevalencia en carnicerías, boca de expendio y mercados de cortes de carnes de distintas especies, y en donde la prevalencia de cortes de carne de cerdos en China fue del 4,4%, en EEUU del 50% (Magwedere et al., 2013), en Alemania del 14% (Martin y Beutin, 2011), en Korea del 15% (Lee et al., 2009). Esta proporción de VTEC tal vez se debería a una contaminación cruzada con las carnes de distintas especies durante la manipulación.
3.2 Objetivos específicos
· Determinar la presencia de VTEC en cerdos en las distintas etapas de producción y en el producto final a nivel de boca de expendio minorista.
· Caracterizar las cepas aisladas según sus características fenotípicas, genotípicas y por presencia de genes de resistencia a antimicrobianos de importancia en salud pública.
· Comparar aislamientos que compartan características feno-genotípicas por métodos moleculares de subtipificación.
3.3 Materiales y métodos 
3.3.1 Detección de Factores de virulencia de VTEC por PCR
3.3.1.1 Procesamiento de las muestras
Cada muestra se cultivó en 100 ml de caldo Luria Bertani (LB) por 24 h a 37ºC. Una alícuota del cultivo se sembró en agar MacConkey para obtener colonias aisladas y se incubó por 24h a 37ºC, posteriormente se realizaron pooles de 5 colonias y se colocaron en 500 µl de agua bidestilada, llevándose a ebullición durante 20 min para liberación de ADN.
3.3.1.2 Detección de genes de virulencia y aislamiento de colonias individuales
A cada tubo que contenía el ADN del pool se le realizó PCR multiplex para los genes codificantes de toxinas VT1 y/o VT2. Si el pool era positivo, cada colonia individual de la placa de agar MacConkey se cultivaba en 800 µl de caldo LB durante 18h a 37ºC con agitación. Se colocaron 20 µl de este cultivo en 500 µl de agua bidestilada. Llevándose a ebullición durante 20 min para liberación de ADN, realizándose PCR multiplex para la detección de los genes vt2, vt1, vt2e, ehxA, eae y saa. 
Se detectó por PCR la presencia de genes codificantes de integrasas para integrones clase 1, 2 y la región 3´CS de integrones de clase 1. 
Se analizaron entre 10 y 100 colonias por muestra. Las cepas se conservaron a -70ºC para sus posteriores caracterizaciones.
3.3.1.3 Cepas de referencia de E. coli
Para la detección de factores de virulencia de VTEC (vt1, vt2, vt2e, eae, ehxa, saa) se utilizaron las siguientes cepas de referencia: 
-EDL933 (E. coli O157:H7 vt1+, vt2+, eae+, ehxA+) proveniente del Servicio de Fisiopatogenia ANLIS- Malbrán, República Argentina.
- E. coli O91:H21 (vt1+, vt2+, ehxA+, saa +) del Laboratorio de Inmunoquímica y Biotecnología de la Fac. Cs. Vet. UNCPBA.
- E. coli O8 (vt2e+) del Laboratorio de Inmunoquímica y Biotecnología de la Fac. Cs. Vet. UNCPBA.
3.3.1.4 Cepas de referencia Integrones +
Enterobacter cloacae: intl1+, 3´CS+ (qacE1- sul1) del Laboratorio de Investigaciones de Mecanismos de Resistencia a Antibióticos, Facultad de Medicina, UBA.
Acinetobacter baumannii: intl2+ del Laboratorio de Investigaciones de Mecanismos de Resistencia a Antibióticos, Facultad de Medicina, UBA.
3.3.1.5 Condiciones del ensayo para los genes estudiados
Los cócteles de reacción de PCR se realizaron en una solución de KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM pH 9, Tritón X-100 al 0,1%, MgCl2 2 mM, 0,01% de gelatina, 0,2 mM de cada dNTP, 1 µM de cada primer, 1U de Taq DNA polimerasa (Highway®) y 5 µl de ADN. 
La presencia de genes de virulencia de VTEC se determinó mediante reacción de PCR multiplex que permite la detección simultánea de los genes vt1, vt2, eae, ehxA y saa (Paton y Paton, 1998, Paton y Paton, 2002) y la presencia del gen vt2e por PCR monoplex según metodología descripta por Woodward et al. (1992). La presencia de los genes intl1, intl2, qacE1, sul1 se realizó según la metodología descripta por Rosser y Young (1999), Orman et al. (2002), Ebner et al. (2004), respectivamente.
3.3.1.6 Condiciones de termociclado empleadas en la detección de genes estudiados
Condiciones de termociclado para vt1, vt2, eae, ehxA, saa
	
	95ºC 1 min
	ciclos 1 a 9
	65ºC 2 min
	
	72ºC 1,5 min
	
	
	
	95ºC 1 min
	ciclos 10 a 15
	65ºC a 60ºC 2 min (-1ºC/ciclo)
	
	72ºC 1,5 min
	
	
	
	95ºC 1 min
	ciclos 16 a 24
	60ºC 2 min
	
	72ºC 1,5 min