BioquimicaYBiologiaMolecularParaCienciasDeLaSalud-432

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La reacción consta de tres pasos, repetidos cíclicamente:
— Desnaturalización, a temperaturas del orden de 
95 °C, que separa las dos hebras del ADN diana.
— Hibridación de los cebadores, reduciendo la tempera-
tura hasta que se formen híbridos estables de cada
cebador con su diana.
— Elongación, a temperatura compatible con la acción
de la polimerasa, que cataliza la formación de una
monohebra complementaria de la diana, en sentido
5’→3’, a partir del cebador. Como consecuencia,
aparecen dos dobles hebras por cada molécula diana
inicial. Se emplean polimerasas termoestables,
obtenidas de microorganismos termófilos, que resis-
ten las elevadas temperaturas de la fase de desnatu-
ralización.
Los tres pasos descritos constituyen un ciclo. Una PCR típi-
ca suele constar de unos 30 ciclos consecutivos, en los que el
número de copias del ADN diana aumenta exponencialmen-
te. Aunque los últimos ciclos suelen tener un rendimiento
menor que los primeros, las cantidades de ADN obtenido
permiten normalmente la clonación del producto, o su análi-
sis directo por electroforesis o secuenciación.
23.6.2 Aplicaciones biomédicas de la PCR
La extraordinaria sensibilidad de la PCR unida a su relativa
sencillez ha impulsado su aplicación a numerosos problemas
biomédicos. En buena parte de estas aplicaciones, la PCR se
emplea acoplada a la síntesis de ADNc a partir del ARN
mensajero. Tras la obtención del ARN mensajero presente en
un determinado tejido, se sintetiza el ADNc mediante la
transcriptasa inversa. El ADNc se utiliza como diana en una
PCR convencional, empleando cebadores específicos para el
gen que se quiera estudiar. La presencia de un producto de
amplificación indica que el ARNm diana estaba presente en
la muestra inicial y, por tanto, que el tejido de partida expre-
sa el gen correspondiente. Esta variante, denominada RT-
PCR, permite detectar cantidades mínimas de mensajeros y
es la técnica más sensible de detección de la expresión de un
gen. Su sensibilidad es suficiente para poner de manifiesto la
presencia de algunas células tumorales en el torrente circula-
torio, durante el proceso de formación de metástasis. En este
caso, se analiza por RT-PCR la presencia en la sangre de los
ARNm correspondientes a genes que se expresen en el teji-
do de procedencia del tumor, pero que no se expresen por las
células sanguíneas. Un resultado negativo indica que la san-
gre no contiene células tumorales en tránsito.
Anális is molecular del genoma | 413
Recuadro 23-1.
APLICACIONES DE LA PCR A LA
DETECCIÓN DE MUTACIONES
La detección y caracterización de muta-
ciones permite confirmar el diagnóstico
de enfermedades genéticas hereditarias,
identificar portadores asintomáticos y
realizar un diagnóstico prenatal en
familias afectadas. En enfermedades
genéticas adquiridas, como el cáncer, la
identificación de la lesión molecular
ayuda a predecir la susceptibilidad del
tumor a la quimioterapia o la radiotera-
pia y a optimizar las pautas terapéuti-
cas.
El análisis más preciso de la estruc-
tura de un gen se obtiene mediante su
secuenciación, que es la técnica de elec-
ción para identificar mutaciones de natu-
raleza desconocida. Pero la secuencia-
ción masiva de genes en posibles
portadores de mutaciones sólo ha podido
abordarse gracias a la PCR, que permite
amplificar el gen sospechoso del posible
portador a partir de sangre periférica, o
de una biopsia de tejido. Normalmente
se obtiene suficiente cantidad del pro-
ducto de amplificación para proceder
directamente a su secuenciación, sin
necesidad de clonar el gen. Ello supone
un ahorro importante de recursos y tra-
bajo.
Una vez que la mutación se ha
caracterizado por secuenciación, exis-
ten métodos más rápidos, sencillos y
baratos para detectar portadores. Un
ejemplo es el uso de oligonucleótidos
específicos de alelo (OEA) en ensayos
de PCR. Puesto que la estructura del
gen normal y la del mutado deben ser
diferentes, al menos en una base, pue-
den diseñarse oligonucleótidos que
sean perfectamente complementarios
para el gen normal, pero no para el
mutado, o viceversa. Estos oligonucle-
ótidos, los OEA, se emplean en condi-
ciones en las que la imperfecta comple-
mentariedad para una de las formas del
gen hace que la hibridación del cebador
y la diana no se produzca de forma
estable, o que la polimerasa sea incapaz
de elongar el cebador imperfectamente
unido a la diana, de manera que al final
de la PCR no aparece un producto de
amplificación. Como cada individuo
posee dos alelos para la mayor parte de
los genes, una PCR con OEA para el
gen normal debería ser positiva para un
homocigoto sano, pero negativa cuando
los OEA correspondieran al gen muta-
do. En un homocigoto para la mutación
estudiada, la situación sería la inversa.
Un heterocigoto con uno de los alelos
mutados y el otro normal se detecta por
la aparición de productos de amplifica-
ción de los dos tipos de OEA. La reso-
lución de la técnica es suficiente para
detectar mutaciones puntuales, en las
que el defecto genético sea tan sutil
como el cambio de una única base.
Además, el tiempo necesario para reali-
zar el análisis completo, desde que se
obtiene la muestra de sangre, es menor
a un día. 
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	BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR (...)
	CONTENIDO
	PARTE II: BIOLOGÍA Y PATOLOGÍA MOLECULAR
	SECCIÓN V GENOMA, PATOLOGÍA MOLECULAR Y TERAPIA GÉNICA
	23 ANÁLISIS MOLECULAR DEL GENOMA
	23.6 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
	23.6.2 Aplicaciones biomédicas de la PCR