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Seminario 3er ERA | Sofía Yacovich 1 Técnicas inmunológicas OBJETIVOS DE LA SEROLOGÍA • Identificar problemas de salud • Determinar la distribución de una enfermedad • Determinar la incidencia y prevalencia de una enfermedad • Evaluar el sistema inmune del individuo • Programar calendarios de vacunación • Evaluar programas o campañas de vacunación Las respuestas inmunitarias contra la mayoría de los antígenos inducen la producción especifica de anticuerpos y linfocitos T efectores. En esto se basan las pruebas inmunológicas, en determinar la presencia de antígenos o anticuerpos o de linfocitos T efectores. Este reconocimiento entre el antígeno – anticuerpo o linfocito sienta las bases del diagnóstico inmunológico. El estudio de las inmunorreacciones se realiza mediante el empleo de técnicas inmunológicas basadas en la detección y evaluación de la respuesta humoral (anticuerpos y complemento) o de base celular (linfocitos T y fagocitos). La medición de las interacciones Ag- Ac con fines diagnósticos. Se realizan en 2 vías: DIAGNOSTICO DIRECTO: Utilización de Ac específicos para detectar Ag DIAGNOSTICO INDIRECTO: Utilización de Ag específicos para detectar Ac Características de la interacción Ag-Ac (cosas que se tienen que favorecer para realizar las pruebas) ➢ Específica ➢ Reversible ➢ Dependiente de pH ➢ Sensible a la Temperatura ➢ Sensible a la fuerza iónica Todo esto hace a la AFINIFAD y AVIDEZ del antígeno al anticuerpo y viceversa. Seminario 3er ERA | Sofía Yacovich 2 AFINIFAD Suma de todas las fuerzas atractivas y repulsivas entre un sitio de unión del Ac (paratopo) y el correspondiente epítopo. Es la fuerza o intensidad de la unión, entre un sitio de unión del anticuerpo y un determinante antigénico. ESPECIFICIDAD Capacidad de los Ac de distinguir y reaccionar con una estructura química entre muchas. Reactividad cruzada El Ac reacciona con otro Ag, cuando este y el Ag que estimuló la producción del Ac especifico comparten un epítope idéntico o muy similar. No siempre ocurre. AVIDEZ Fuerza con la que un Ac se une a un Ag multivalente Paratopo unido al epitope IgG por ejemplo, tiene dos sitios de unión para el Ag, tiene más avidez que el anterior Tiene más sitios de unión al Ag, por eso tiene mayor avidez. (IgM) Lo ideal para una prueba es que sea 100% específica y 100% sensible. De todas formas, no existe una prueba con estas características. Pueden ser más sensibles que específicas o viceversa. SENSIBILIDAD Capacidad de una prueba para detectar individuos “enfermos” (VERDADEROS POSITIVOS) en una población “enferma”. Ejemplo: ELISA-WESTERN BLOTTING- INMUNOFLUORESCENCIA ESPECIFICIDAD Capacidad de una prueba para detectar individuos “sanos” (VERDADEROS NEGATIVOS) en una población “sana”. Ejemplo: WESTERN BLOTTING Categorías de las pruebas inumodiagnosticas Miden la cantidad de inmunocomplejos (unión Ag-Ac), utilizando radioisótopos, colorantes fluorescentes o enzimas. Para poder VER la unión Ag-Ac hay que agregar diversas sustancias porque a simple vista no se ve. ✓ Radioinmunoanálisis (RIA)→ utiliza radioisótopos ✓ IRMA→ utiliza radioisótopos ✓ ELISA→ utiliza radioisótopos ✓ Inmunofluorescencia→ utiliza colorante fluorescente Seminario 3er ERA | Sofía Yacovich 3 a Los Ac o Ag marcados reciben el nombre de CONJUGADO. Los Ac conjugados suelen ser monoclonales o antinmunoglobulinas específicas. Ac que reconoce el epitope del antígeno. El Ac tiene unido el colorante fluorescente, es un conjugado Ag Ac conjugado A diferencia del otro, este anticuerpo va dirigido hacia otro anticuerpo (no hacia un antígeno) entonces por eso es una anti-inmunoglobulina marcada Ac conjugado inmunoenzimÁticas (enzime linked inmunosorbent assay= ensayo de inmunoabsorcion ligado a una enzima) Fundamento: visualización de la cantidad de Ag-Ac formado a través de marcadores ligados a enzimas, que, en presencia del sustrato específico, producen una reacción colorimétrica. Ejemplos: ENZIMAS UTILIZADAS SUSTRATO peroxidasa→ ortofenildiamina fosfatasa alcalina→ paranitrofenilfosfato TIPOS DE PRUEBAS Indirecta→ busca o detecta el anticuerpo. Entonces se coloca el Ag Directa→ busca o detecta el antígeno. Se coloca el anticuerpo ELISA El segundo anticuerpo es la anti-inmunoglobulina que tiene unida la enzima. Para que se active nosotros ponemos el sustrato sin color, que cuando se une a la enzima produce un producto coloreado Seminario 3er ERA | Sofía Yacovich 4 ELISA INDIRECTO→ busca Ac Se trabajan con pocillos o cubas que vienen con el antígeno pegado 1) Se coloca el suero del paciente 2) Se incuba así se dan las condiciones necesarias para que se unan y se forme el inmunocomplejo (temperatura, pH, tiempo) 3) Se lava, se utiliza un buffer para que no se altere la unión Ag-Ac, para que se vaya o elimine todo lo que no se unió 4) Se agrega el conjugado que es una anti-inmunoglobulina con la enzima 5) Se vuelve a incubar y luego lavar 6) Se agrega el sustrato que reacciona con la enzima 7) Si hay cambio de color es porque se activó la enzima y que la prueba es POSITIVA, es decir, que el paciente tiene el anticuerpo. ELISA DIRECTO→ busca Ag Se trabaja con un pocillo que viene con el Ac pegado 1) Se coloca el suero del paciente con el supuesto Ag 2) Se incuba 3) Se lava 4) Se agrega el conjugado que es una Ig o Ac que tiene la enzima unida (si esta el antígeno, queda el antígeno entre dos anticuerpos, el que viene en el pocillo y el que agregamos nosotros, por eso se le dice sándwich). Éste conjugado se une a otro epitope del antígeno. 5) Se incuba 6) Se lava 7) Se agrega el sustrato y si se une a la enzima forma un producto coloreado que quiere decir que la prueba es positiva y que el paciente tiene el ANTIGENO. Prueba positiva. VENTAJAS DESVENTAJAS ▪ Alta sensibilidad y especificidad ▪ Rápido (horas) ▪ Reactivos estables ▪ Resultado visual=cambio de color ▪ Costo equipo automatización (incubadora, lavadora, espectrofotómetro) ▪ Costo microplacas (porque utiliza estructuras monoclonales) SUERO→ es el líquido que se obtiene de la sangre cuando esta se deja coagular luego de su extracción, es decir, no presenta fibrinógeno porque el mismo se utilizo en el proceso de coagulación (formando fibrina) Seminario 3er ERA | Sofía Yacovich 5 inmunofluorescencia Fundamento: visualización de la cantidad de Ag-Ac formado a través de colorantes fluorescentes utilizados como marcadores COLORANTE UTILIZADO: ISOTIOCIANATO DE FLUORESCEÍNA (FITC) (color verde flúor) ✓ Se utiliza un microscopio de fluorescencia, por lo que se trabaja con un portaobjeto TIPOS DE PRUEBAS DIRECTA (IFD) INDIRECTA (IFI) Busco antígeno Busco anticuerpo INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA→ busca Ag 1) Se trabaja con un portaobjeto (el resultado final se observa en microscopio) 2) Se le hace una biopsia al paciente y se coloca un pedacito de tejido en el portaobjeto= corte o impronta 3) Se fija el tejido al vidrio con acetona para asegurar que no se despegue 4) Se agrega el conjugado que es un anticuerpo que tiene unido el FITC (isotiocianato de fluoresceína) (reactivo) 5) Se incuba para favorecer las condiciones de unión de Ag-Ac 6) Se lava 7) Se observa en microscopio de fondo oscuro en donde se ve la fluorescencia en presencia del antígeno. INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA→ busca Ac Seminario 3er ERA | Sofía Yacovich 6 1) Se trabaja con un portaobjeto que ya viene con el antígeno 2) Se le saca sangre al paciente y separamos el suero= porque lo que buscamos es el Ac 3) Se coloca ese suero conel cultivo celular para que reaccionen y se unan Ag con Ac (si es que el paciente tiene el Ac) 4) Se incuba 5) Se lava 6) Se coloca el conjugado que es una anti-inmunoglobulina marcada con colorante fluorescente (FITC) 7) Se incuba 8) Se lava 9) Se observa en el microscopio de fondo oscuro la fluorescencia. VENTAJAS DESVENTAJAS • alta sensibilidad • rápida, sencilla • evidencia de Ag intracelulares • reactivos estables • costo equipo • lectura subjetiva, el observador tiene que estar entrenado. Treponema Palidum→ agente etiológico de la sífilis. Se determina por inmunofluorescencia donde se observa la forma de la espiroqueta (bacteria) Ac anti-toxoplasma gondii→ agente etiológico de la toxoplasmosis. El sustrato antigénico utilizado es una suspensión de toxoplasma gondii. Detecta antígenos de membrana. Virus respiratorios Virus Influenza B Ac anti-acrosina Ria-Irma ✓ Utilizan RADIOISÓTOPOS, entre ambos cambia el conjugado. Seminario 3er ERA | Sofía Yacovich 7 RIA (radioinmunoanálisis) competitivo→ busco Ag 1) Se trabaja con una placa que viene con el anticuerpo unido o pegado 2) Se le extrae sangre al paciente, separamos el suero que tiene el supuesto Ag (no marcado) y también colocamos el mismo antígeno, pero marcado con radioactividad. 3) Al hacer esto, va a haber una competencia por la unión con el Ac, el que está en mayor proporción o cantidad es el que se va a unir. 4) Se incuba y se lava previamente 5) Luego se mide la radioactividad RESULTADOS: ✓ Radioactividad alta→ se unieron los Ag marcados, significa que el paciente casi no tiene Ag propios, porque se unieron más los Ag marcados ✓ Radioactividad baja→ se unieron los Ag propios del paciente GRÁFICO: ✓ Cuanto más antígenos tiene el paciente, menor es la radioactividad que se mide ✓ Cuanto menos antígenos tiene el paciente, mayor es la radioactividad que se mide. -son inversamente proporcionales- IRMA (radioinmunoanálisis) no competitivo→ busco Ag 1) Se trabaja con una placa con un Ac pegado o unido 2) Se coloca el suero del paciente con el supuesto Ag (no marcado) 3) Se incuba, se lava 4) Se coloca el conjugado que es un anticuerpo marcado con radioactividad (si el paciente tiene los antígenos, este conjugado se va a unir o va a reconocer otro epitope del Ag diferente) 5) Se incuba y se lava nuevamente RESULTADOS: toda la radioactividad que se mida es porque está el antígeno, sino se va con el lavado ✓ Radioactividad alta→ el paciente tiene Ag ✓ Radioactividad baja→ el paciente no tiene Ag -es directamente proporcional- VENTAJAS DESVENTAJAS • Alta sensibilidad • Costo equipo • Utiliza radioisótopos, es peligroso Los complejos Ag-Ac se agregan y originan fenómenos perceptibles visualmente. Son reacciones no reversibles. Son de menor sensibilidad que las primarias, pero más clásicas. Dependen: ▪ Estado físico del Ag ▪ Temperatura ▪ Electrolitos presentes en la reacción ▪ Afinidad y avidez en la interacción Ag-Ac, proporción entre ambos ▪ Tipo de Ig presente Seminario 3er ERA | Sofía Yacovich 8 ✓ Si el Ag es SOLUBLE la reacción que se da es de PRECIPITACIÓN. ✓ Si el Ag es PARTICULADO (suspensión) la reacción es de AGLUTINACIÓN. -Se dice que es particulado porque generalmente son adicionados esos antígenos sobre alguna partícula, que puede ser una célula o látex. Son de mayor tamaño que los de precipitación. -La reacción de precipitación forma unos grumos mas “groseros” que el de precipitación. -Ambos se pueden ver a simple vista. -el paratopo reconoce un solo epítopo -cada Ig se une a un determinado Ag PRUEBAS AGLUTINACIÓN PRECIPITACIÓN a. Hemoaglutinación. b. Prueba de Coombs a. Inmunodifusión doble (o método de Ouchterlony) b. Inmunodifusión radial c. Inmunoelectroforesis d. Western blot (o inmunoblot) PRECIPITACION -varios epítopos son reconocidos por el paratopo -varios determinantes antigénicos se reconocen de La curva representa una curva de precipitación para una cantidad constante de Ac. Es decir, por ejemplo, queremos medir Ac en el paciente y nosotros ponemos la cantidad de Ag ✓ A baja concentración de Ag el paciente si tiene el Ac empieza a formar el inmunocomplejo, pero todavía no se alcanza a visualizar. abscisas→ ordenadas Seminario 3er ERA | Sofía Yacovich 9 ✓ Si seguimos agregando Ag la curva asciende porque cada vez hay más inmunocomplejos formados, ✓ En el medio de la grafica se obtiene la relación justa de Ag-Ac formado, es decir, una reacción equivalente entre cantidad de antígeno y de anticuerpo formado. ✓ A medida que seguimos agregando Ag van a haber menos Ac del paciente, por lo tanto, se empiezan a disolver los inmunocomplejos formados y por eso baja la curva. Zona de “prozona” Zona de equivalencia (es donde se observa la precipitación Zona de “pos-zona” Inmunodifusión doble 1)Se trabaja con un aplaca que tiene un gel y se le hacen un pocillos redondos a distancias predeterminadas. -ANTI-X→ anticuerpo x -pocillo 1→ suero del paciente 1 -pocillo 2→ suero del paciente 2 2) se incuba para así darle tiempo a que el anticuerpo y el antígeno difundan por el gel hasta que se encuentren y formen el inmunocomplejo, que es lo que precipita y se observa en la Reacción de Identidad (la línea ) REACCIÓN DE IDENTIDAD (figura 1)→significa que las 2 personas tienen el Ag contra el ANTI-X REACCION DE IDENTIDAD PARCIAL (figura 2)→ se forma un “espolón”, significa que la persona 1 tiene un Ag que la persona 2 no tiene, es decir, comparten el antígeno X, pero el Y no. REACCION DE NO IDENTIDAD (figura 3)→ se forman dos espolones, significa que las 2 personas no comparten ningún antígeno → se usa para, por ejemplo, para determinar los a-ENA (antígenos nucleares extraíbles) Ambos tienen el Antígeno X Seminario 3er ERA | Sofía Yacovich 10 Inmunodifusión radial 1) A diferencia de la prueba anterior, en el gel ya viene incorporado el anticuerpo 2) Cuando se coloca el Ac en la placa el gel esta líquido, luego se lo deja solidificar 3) Se hacen los pocillos con un sacabocados 4) Se coloca el suero del paciente con el supuesto Ag 5) Se incuba unas 48hr aproximadamente. El antígeno empieza a difundir en todo el diámetro del pocillo y como hay Ac en todo el gel, se observa una precipitación en anillo que se llama “halo de precipitación” A n ti c u e rp o i n c o rp o ra d o a l g e l GRAFICA ESTANDARIZADA: se van midiendo los halos para saber la concentración de un Ag, es decir: -podemos cuantificar y saber cuánto tiene y qué tiene. El tamaño de los halos es proporcional a la concentración del antígeno el anticuerpo está en todo el gel (anti-S) Figura A=se hace el pocillo y se coloca el suero del paciente que supuestamente tiene el Ag-S Figura B=se incuba y el antígeno empieza a difundir hasta que se forme el Halo Ag-Ac Figura C= precipita el inmunocomplejo en forma de halo Seminario 3er ERA | Sofía Yacovich 11 A, B y C son calibradores= son sustancias antigénicas las cuales nosotros ya sabemos la concentración que tienen, se colocan mediante la técnica anteriormente explicada. Entonces: -colocamos el calibrador A, B y C -en este caso estamos midiendo la concentración de C3 del complemento -A. B y C como ya se sus concentraciones las ubico en abscisas de la grafica -en ordenadas se determina el diámetro de A, B y C con una regla y eso lo coloco en la grafica -una vez que obtengo los valores uno los puntos y luego trazo la recta -P es del paciente, cuya concentración no conozco y quiero saber, entonces mido el diámetro y coloco el valor en el graficoen ordenadas, trazo una recta hasta la línea y luego bajo hacia abscisas y ahí voy a saber la concentración de P -de esta manera puedo saber la cantidad de C3 que tiene el paciente → esta técnica se puede usar para saber la cantidad de Inmunoglobulinas Inmunoelectroforesis (ief) Se hace cuando hay varios Ag en una muestra y que quiero determinar. Por ejemplo, cuando queremos determinar proteínas en el suero sanguíneo (albúminas, globulinas, etc.) se usa esta técnica 1) Se trabaja con un gel con dos pocillos en donde en uno se pone suero de una persona normal (rojo) y en el otro el del paciente (amarillo), para así poder comparar. En el medio hay un surco en el cual se coloca lo que va a reaccionar contra los antígenos de ambos 2) Se da una descarga eléctrica, o sea, una diferencia de potencial. Esto se hace para que se separen los diferentes antígenos (en este caso son proteínas). 3) En la segunda imagen se puede observar que al paciente (amarillo) le están faltando proteínas, sin embargo, aún no lo puedo visualizar. 4) En el surco se colocan ac antiproteínas séricas 5) Se incuba. El anticuerpo empieza a difundir hasta que se forme la precipitación que se puede visualizar por la unión Ag-Ac Seminario 3er ERA | Sofía Yacovich 12 Al paciente le falta las globulinas gamma, estos tienen tendencia a infectarse mucho Western blot ✓ Uno de sus usos más frecuentes es para confirmar HIV ✓ Se trabaja con un gel de poliacrilamida Seminario 3er ERA | Sofía Yacovich 13 aglutinación 1) Se hacen unos cortes o surcos en donde se coloca el antígeno 2) Se le coloca una diferencia de potencial, para esto se trabaja con una sustancia que se llama do decil sulfato de sodio que es un detergente que facilita la migración o corrida y que favorece que se separen los diferentes antígenos del virus haciendo que se ubiquen según sus pesos moleculares 3) Se transfiere del gel de poliacrilamida a un gel de nitrocelulosa que es un soporte solido 4) Se coloca el suero del paciente, queremos saber si tiene Ac contra el virus del HIV, por ejemplo 5) Para poder visualizar si hay una reacción, se coloca el conjugado que es un anti ac unido a una enzima 6) Se agrega un sustrato, se activa la enzima si es que el paciente tiene anticuerpo presente dando como resultado un producto coloreado 7) Se observa una banda de precipitación coloreada, dependiendo de la zona donde haya color se puede saber Ac contra qué Ag del virus hubo reacción. 8) También se puede hacer mediante Quimioluminiscencia de AGLUTINACIÓN DIRECTA o ACTIVA: las partículas o células tienen un antígeno intrínseco, es decir, que ya tienen el Ag en la propia célula, pueden ser en el GR para determinar grupo y factor AGLUTINACION PASIVA: partículas o células a las cuales se le agrega el antígeno, por ejemplo, al GR que se le agrega un lisado de Chagas, o partículas de látex para Ag del HIV Se considera aglutinación cuando el antígeno es PARTICULADO y tiene como tamaño mínimo el bacteriano ✓ Se trabaja con una microplaca en la que se le hacen pocillos para hacer la serie de disoluciones. ✓ En las microplacas se trabaja con controles positivos y controles negativos, esto se utiliza para asegurar que los reactivos estén bien. ✓ Cuando el pocillo esta todo coloreado se llama manto y con el puntito se le llama botón. Seminario 3er ERA | Sofía Yacovich 14 M1→ muestra 1 M2→ muestra 2 -se hacen diluciones del suero: ½ “uno en dos” en todos los pocillos se pone por ejemplo 50 microlitros de buffer (se trabaja con buffers para mantener el pH, luego se pone en el primer pocillo de M1 50 microlitros del suero del paciente. Se llama ½ porque tiene 50 de buffer y 50 de suero del paciente. Del ½ saco 50microlitros y los coloco en el segundo pocillo, es decir, vuelvo a diluir a la mitad el que ya estaba diluido a la mitad y es ¼. Del ¼ saco 50 microlitros y lo pongo en el siguiente pocillo, diluyéndolo a la mitad y así sucesivamente y sigue siendo 1/8, 1/16, 1/32= a estos se le llama títulos: a las diluciones. M1 entonces dio positivo hasta ¼. M2 dio positivo hasta 1/32 Se informa, por ejemplo: 32 DILS hemaglutinación Cada fila es para un paciente -hay controles positivos y negativos -se hacen las diluciones a la mitad Seminario 3er ERA | Sofía Yacovich 15 Prueba de Coombs PRUEBA DE COOMBS DIRECTA→ busca Ac 1) Se parten de glóbulos rojos SENSIBILIZADOS, es decir, GR que tiene pegado los Ac 2) Se hace esta prueba por ejemplo a un bebé Rh (+) que tiene una mamá Rh (-) o a aquellos que tienen anemia hemolítica autoinmune. 3) En este caso, la mama es la que genero los Ac contra los Rh (+) del bebé y por eso quedaron sensibilizados sus GR (son IgG de la mamá contra el Rh (+) del bebe) 4) Se coloca el Suero de Coombs= son Ig de conejos contra Ig humanas, es decir, Ig anti- inmunoglobulina humanas 5) Se incuba 6) Si hay reacción es porque la Ig del conejo reconoce las Ig humanas y forman la red o entramado y eso aglutina y se puede VER, significa entonces que el bebé tiene Eritroblastosis Fetal. PRUEBA DE COOMBS INDIRECTA→ busca Ac Se le hace a la mamá Rh (-) que tiene un bebé Rh (+) o a aquellos que hay que trasfundir -la mamá tiene los Ac contra los GR Rh (+) del bebé, tiene los Ac Anti D en el segundo embarazo Seminario 3er ERA | Sofía Yacovich 16 Entonces, como la Prueba de Coombs es con GR sensibilizados y la madre solo tiene los Ac o Ig tenemos que sensibilizar sus GR 1) Se usan GR O+ porque así me aseguro que no tiene Ag A, ni Ag B y que sea positivo para que solo tenga el Ag D, y así no tiene Ac contra el Rh. De manera que si la mamá tiene Ac anti-D va a reaccionar solo con el Ag-D 2) Se incuba, si la mamá tiene los Anti-Rh se van a unir a los GR y queda los GR SENSIBILIZADOS 3) Se coloca el Suero de Coombs (suero de conejo que tiene Ac contra el Ac anti- D) 4) Si están los Ac en los GR se van a unir, a formar la red y eso aglutina → para transfusiones de sangre para así evitar una reacción in vivo, es decir, para saber si el que va a recibir la sangre no tiene anticuerpos contra los GR que le van a transfundir. Si alguien con eritrocitos que no expresan el AgD (Rh (-)) es transfundido con sangre de un dador Rh (+), el receptor generará Ac IgG anti-D que pueden causar destrucción de los eritrocitos Rh (+) en transfusiones posteriores. VACUNA “ANTI-D” se coloca en la semana 28 para las madres Rh (-) o después del parto dentro de las 72hrs. Esta vacuna elimina los eritrocitos Rh (+) fetales presentes en la circulación materna.
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