Guia de Laboratorio de Inmunologia II

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Universidad de Oriente 
Núcleo Bolívar 
Escuela de Ciencias de la Salud 
Dr. Francisco Virgilio Battistini Casalta 
Departamento de Bioanálisis 
Catedra – Inmunología II 
Laboratorio 
 
Profesora: 
Lic. Alizar Abou Fakhr 
Ciudad Bolívar, Abril del 2021 
Bachilleres: 
Estudiantes del 7mo Semestre 
El presente trabajo pretende proporcionar al estudiante de la carrera de Bioanálisis 
la información esencial para comprender, ejecutar e interpretar un conjunto de técnicas 
inmunológicas de aplicación clínica, como parte de su formación en el curso del 
Laboratorio Inmunología II. Se asume que el estudiante posee de antemano una forma-
ción básica en Inmunología I, tanto teórica como de laboratorio. Los capítulos presentan 
una breve introducción que resume los fundamentos teóricos de cada técnica, seguida 
de una descripción general de los procedimientos, algunas notas sobre los principales 
cuidados e interpretación y una bibliografía sucinta. Los reactivos utilizados y su pre-
paración. Esperamos que este modesto trabajo didáctico sea de utilidad a los estudiantes 
en su formación, así como en su futuro ejercicio profesional. 
 
 
 
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Universidad de Oriente 
Núcleo Bolívar 
Escuela de Ciencias de la Salud 
Dr. Francisco Virgilio Battistini Casalta 
Departamento de Bioanálisis 
Catedra – Inmunología II 
Laboratorio 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Hecho por: 
Grupo Lunes A 
 
 
Ciudad Bolívar, Abril del 2021 
 
 
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INTRODUCCIÓN 
 Uno principales mecanismos que se pone en marcha cuando se activa la respuesta 
inmunológica es el sistema de complemento, que está conformado por un conjunto o red de 
proteínas cuya función directa es el reconocimiento y destrucción de los patógenos cuando 
estos invaden nuestro organismo. En condiciones normales las moléculas que forman parte 
del sistema de complemento se encuentran inactivas circulando libremente en el torrente 
sanguíneo y cuando se activan, al reconocer un microorganismo, migran hacia el tejido 
infectado y favorecen la inflamación y la eliminación del patógeno. 
 
En un organismo vivo sus componentes individuales tienen divididas las funciones entre 
ellos, y a la vez interaccionan entre si de una forma compleja, pero precisa. Sin embargo, 
este conjunto de interacciones delicadas puede ser fácilmente alterados por agentes que 
amenazan su integridad como la existencia de parásitos, los daños a órganos y tejidos 
(heridas) o la aparición de procesos tumorales. Para defenderse, los organismos han 
desarrollados una gran variedad de mecanismos que están formados por una serie de 
proteínas coordinadas en sus funciones. Estos sistemas se activan gradualmente, en cascada 
y sus diversos integrantes interaccionan entre sí, conformando las tres vías de activación del 
sistema de complemento: la vía clásica, la alterna y la de las lectinas. 
 
El análisis del complemento es de gran importancia ya que mide la cantidad o la actividad 
de las proteínas del complemento en la sangre. Las pruebas más comunes son las de las 
proteínas C3 y C4 y la prueba de CH50 que mide la cantidad y la actividad de todas las 
proteínas principales del complemento. Si la prueba muestra que los niveles de proteína del 
complemento no son normales o que no están funcionando como deberían con el sistema 
inmunitario, puede ser signo de una enfermedad autoinmunitario u otra condición que puede 
poner en riesgo la salud del paciente. 
 
 
 
 
 
 
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CUESTIONARIO DIAGNÓSTICO 
1. ¿Qué es el sistema del Complemento? 
El sistema del complemento hace parte de una de las 
primeras líneas de defensa contra infecciones y está 
constituido por una serie de proteínas solubles receptoras de 
membrana, para esas proteínas una vez que son activadas, y 
moléculas reguladoras que frenan su activación cuando han 
cumplido su función que es la de reforzar la respuesta inmune 
innata y adquirida. La mayoría de las proteínas o factores 
solubles son de tipo enzimático y son transportados por la 
sangre, pueden ser superficiales o de membrana que tienen la 
capacidad de unirse al microorganismo y activar una vía del sistema de complemento. 
 
El sistema del complemento forma parte del sistema inmunitario innato del organismo. A 
diferencia del sistema inmune adquirido (que produce anticuerpos frente a sustancias 
específicas), el sistema inmune innato es inespecífico y tiene la capacidad de responder 
rápidamente a sustancias desconocidas para el organismo, como pueden ser bacterias, tejidos 
no propios (como trasplantes), restos de células muertas o inflamación. Por lo tanto, no 
requiere una exposición previa al microorganismo o sustancia y no guarda memoria de 
exposiciones previas. 
 
 Como parte del sistema inmune innato, el sistema del complemento se ha desarrollado para 
reconocer complejos antígeno-anticuerpo (inmunocomplejos) así como también ciertas 
estructuras y polisacáridos (complejos de carbohidratos) que se encuentran en las 
membranas externas de los microorganismos y en otras células extrañas. 
 
Componentes: Las distintas proteínas que integran el sistema, son unas 37, se conocen como 
factores y representan el 10% de las proteínas presentes en el plasma, lo cual indica su 
importancia. 20 de ellas pertenecen al circuito de activación, 9 al sistema de control y 8 
sirven de receptoras a las moléculas originadas durante el proceso de activación en la primera 
fase. La cascada de activación se desarrolla en tres fases: Reconocimiento, activación y ata- 
 
 
5 
que a la membrana. 
 
Factores para vía clásica: C1q, C1r, C1s, C2, C3, C4 
Factores para la vía alterna: C3b, Factores B, D y properdin 
Factores para la vía de las lectinas: Lectina Ligadora de Manosa (MBL), ficolinas y las 
proteasas de serina, MASP1 Y MASP2 
 
2. ¿Cuáles son las funciones del sistema del complemento? 
 El sistema de complemento actúa en tres aspectos biológicos, en primer lugar, participa en 
la defensa del hospedero contra microorganismos patógenos, función que se ejerce por los 
siguientes mecanismos: 
-Opsonización 
-Liberación de péptidos quimiotacticos que atraen PMN 
-Activación de la fagocitosis 
-Amplificación de la inflamación 
-Lisis de células o bacterias por daño a la membrana 
Un segundo mecanismo es el de servir de puente entre la inmunidad innata y la adquirida. 
El tercer mecanismo consiste en favorecer el transporte e inactivación de complejos inmunes 
y la eliminación de cuerpos apoptóticos. 
 
3. ¿Cómo se activan la vía alterna y clásica del sistema del complemento? 
Vías de activación: 
El complemento es un sistema cuyos componentes se activan secuencialmente en forma de 
cascada. El proceso comienza con una etapa en la que las señales de peligro son identificadas 
por receptores para el reconocimiento de patrones moleculares (PRR). Los PRR implicados 
en este sistema incluyen Ac específicos, MBL, ficolinas, proteínas C reactiva y anticuerpos 
naturales IgM que pueden activar las diferentes vías. 
 
❖ Vía clásica: Inicia con una fase de reconocimiento, se inicia por medio de una 
molécula de IgM que se haya unido a un Ag en la superficie de un microorganismo o de una 
célula que deba ser destruida. Cuando un Ac reconoce un Ag en la membrana de un 
microrganismo, la molécula C1q se une al complejo Ag-Ac y permite la unión y activación 
 
 
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de los factores C1r y C1s, con lo cual se produce la activación completa del factor C1 que 
inducirá la activación del C4. 
• Se inicia: Por fase de reconocimiento, por medio de una molécula de IgM que 
se haya unido a un Ag en la superficie de un microorganismo. 
• Proteínas que participan: Complejo C1, C2, C3, C4, C5. 
• Proteínas que activan: C1q, C1r, C1s 
• Conversatas: C3 (convertasa) C4bC2a y C5 (convertasa) C4bC2aC3b, CAM 
- La C3 convertasa de la vía clásica convierte catalíticamente por hidrolisis 
muchas moléculas de C3 a C3a (difusibles) y C3b, quese anclando a la 
membrana del microorganismo. De esta manera actúa como un núcleo 
“focalizador” para que continúe la activación del complemento. 
- La C5 convertasa de la vía clásica cataliza la rotura de unidades de C5 
EN C5a (libre) y C5b, que se une a la membrana microbiana. 
 
❖ Vía alterna o Properdin 
Es la más antigua. La fase de activación de esta vía depende de dos mecanismos: 
 
a. Pequeñas cantidades de C3b, se anclan en la membrana y son reconocidas por el factor 
B que en presencia del factor D se fragmenta en Bb y Ba. El complejo C3bBb es 
estabilizado por el properdin y constituya la convertasa de C3 de la vía alterna 
 
b. El properdin puede actuar también, la vía alterna al reconocer sus ligandos en la 
membrana de bacterias, hongos y células necróticas 
 
• Se inicia: por C3b 
• Proteínas/componentes que participan: C3, Factor B, factor D, properdin 
• La activa: Por presencia de microorganismo 
• Proteína que activan: C3b 
• Convertasas: C3 (Convertasas) C3bBb, C5 (Convertasa) C3bBbp3b. 
- La C3 convertasa de la vía alterna rompe numerosas moléculas de C3, 
cuyos respectivos grandes de C3b tienden a unirse cerca de la misma 
convertasa unida a la membrana. 
 
 
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- La C5 convertasa de la vía clásica cataliza la rotura de unidades de C5 
EN C5a (libre) y C5b, que se une a la membrana microbiana. 
 
4. ¿Cuándo son necesarias las pruebas del sistema del complemento? 
Puede solicitarse cuando existe una inflamación o edema sin causa aparente o síntomas de 
enfermedad autoinmune como el lupus eritemasoso sistémico y cuando existe sospecha de 
trastorno relacionado con inmunocomplejos y el médico quiere comprobar el estado del 
complemento. 
 
Los componentes que más suelen solicitarse son el C3 y el C4, pero otros, como el C1-
inhibidor, también pueden solicitarse cuando se sospecha un déficit. Los componentes del 
complemento por separado suelen solicitarse cuando la actividad total del complemento 
(CH50 o CH100) está alterada para determinar cuál es el componente deficitario o anómalo. 
Una vez diagnosticado un trastorno crónico o agudo, la determinación del complemento 
puede utilizarse para dar una idea de la severidad del trastorno (asumiendo que dicha 
severidad se debe a un descenso de los componentes del complemento). También puede 
solicitarse ocasionalmente cuando el médico quiere controlar la actividad del trastorno en un 
momento concreto de su evolución. 
 
5. ¿Cuáles son las pruebas para la determinación de la vía clásica y alterna? 
Las proteínas del complemento se pueden medir individualmente o juntas, siendo las pruebas 
más comunes las que determinan a las proteínas C3 y C4, como también, la prueba de CH50 
que mide la cantidad y la actividad de todas las proteínas principales del complemento. 
 
Para evaluar el sistema de complemento se utiliza pruebas tanto cuantitativas como 
cualitativas y la utilidad de su determinación está en la inmunología clínica, ya que permite 
detectar deficiencia en factores de complemento además de anomalías funcionales en las 
vías de activación y regulación. 
Las pruebas cuantitativas analizan las concentraciones de componentes infecciosos del 
complemento e incluyen ensayos inmunogénicos, mientras que las pruebas cualitativas 
miden la actividad total del complemento (lisis en las distintas vías de activación). Las 
 
 
8 
pruebas que producen hemolisis dan una perspectiva de la función de la cascada enzimática 
siendo una de ellas la de capacidad hemolítica de (CH50). Otro método que se usa son los 
que utilizan los ensayos de inmunoabsorbancia asociados a enzimas (ELISA) Para detectar 
el depósito de C1q, C1s, C4, C3, factor B. 
 
❖ Técnica KENT Y FIFE (CH50): Ensayo CH50: La reacción se inicia con la 
interacción antígeno (glóbulos rojos del carnero) con el anticuerpo (hemolisina) al agregar 
el suero del paciente cuyos niveles del complemento se desean investigar, se inicia así la 
activación de la cascada, activando la vía alterna del sistema del complemento, se obtiene 
así destrucción de glóbulos rojos. La hemolisis se calcula mediante lectura 
espectrofotométrica, los resultados representan la cantidad del complemento requerido para 
lograr la hemolisis al 50% de los glóbulos rojos 
 
❖ Prueba de C4 del complemento: Mide la cantidad de proteínas C4 que hay en la 
sangre. Las enfermedades que implican niveles anormales de c4 es lupus eritematoso, un 
trastorno auto inmunitario. A menudo los niveles del complemento aumentan de manera 
drástica después de una infección o herida. Cuando el sistema de complemento se activa, los 
niveles disminuyen. 
 
6. ¿Qué condiciones pueden producir alteraciones en las proteínas del sistema de 
complemento? 
❖ DISMINUCIÓN 
Los componentes del complemento pueden encontrarse disminuidos por déficits hereditarios 
(relativamente raros) o debido a un exceso de consumo. Los déficits hereditarios en una o 
más proteínas del complemento suelen conllevar una alta frecuencia de infecciones 
bacterianas recurrentes o enfermedades autoinmunes. Los niveles de C3 y C4 generalmente 
están disminuidos en el lupus, mientras que C3 sólo es bajo en septicemia e infecciones 
causadas por hongos o parásitos como la malaria. 
Si el déficit se debe a un trastorno subyacente agudo o crónico, los niveles del complemento 
volverán a la normalidad una vez resuelto dicho trastorno. 
 
Pueden observarse descensos en los componentes del complemento en: 
http://www.labtestsonline.es/Glossary/Glossary_Protein.html
https://labtestsonline.es/conditions/enfermedades-autoinmunes
https://labtestsonline.es/conditions/malaria
 
 
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• Infecciones microbianas recurrentes (generalmente bacterianas) 
- Deficiencia de C5, C9, factor B, el factor D, o properdina: susceptibilidad a las 
infecciones por Neisseria 
- Deficiencia en C1, C2, C3, MBL, serina proteasa asociada a MBL (MASP-2), 
factor H, factor I, o el receptor 2 del complemento (CR2): provoca susceptibilidad a 
infecciones bacterianas recurrentes 
• Enfermedades autoinmunes, como LES o artritis reumatoide. 
- Defectos en C1, C4 y C5: lupus eritematoso sistémico 
• Angioedema hereditario o adquirido 
• Diversas enfermedades renales, entre ellas: glomerulonefritis, nefritis lúpica, nefritis 
membranosa, nefropatía por IgA, así como el rechazo del trasplante de riñón. 
• Cirrosis 
• Hepatitis 
• Malnutrición 
• Septicemia, shock 
• Enfermedad del suero (enfermedad por inmunocomplejos) 
 
❖ AUMENTO 
Las proteínas del complemento suelen encontrarse elevadas juntamente con otras proteínas 
conocidas como proteínas de fase aguda, durante una inflamación crónica o aguda. Todas 
estas proteínas volverán a niveles normales una vez se haya resuelto el trastorno subyacente. 
Sin embargo, no es habitual medir las proteínas del complemento en estas circunstancias, en 
comparación con la prueba más ampliamente solicitada que es la proteína C reactiva (PCR). 
 
 También se puede observar una mayor actividad del complemento en los 
siguientes casos: 
• Cáncer (leucemia, linfoma de Hodgkin, sarcoma) 
• Colitis ulcerosa 
• Tiroiditis 
• Infarto agudo del miocardio 
https://labtestsonline.es/conditions/artritis-reumatoide
https://labtestsonline.es/glossary/angioedema
http://www.labtestsonline.es/Glossary/iga.html
https://labtestsonline.es/conditions/cirrosis
https://labtestsonline.es/conditions/hepatitis
http://www.labtestsonline.es/condition/Condition_Malnutrition.html
http://www.labtestsonline.es/Glossary/Glossary_Septicemia.html
https://labtestsonline.es/glossary/reactante-de-fase-aguda
https://labtestsonline.es/tests/proteina-c-reactiva
https://labtestsonline.es/conditions/leucemia
https://labtestsonline.es/conditions/linfoma
https://labtestsonline.es/glossary/colitis-ulcerosa
https://labtestsonline.es/conditions/infarto-agudo-de-miocardio-y-sindrome-coronario-agudo
 
 
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• Sarcoidosis 
• Artritis reumatoide juvenil 
 
❖ MUTACIONESLas mutaciones en los genes para el factor B, factor H, factor I, la proteína cofactor de 
membrana (CD46), o C3: desarrollo de la variedad atípica del síndrome urémico hemolítico 
 
https://labtestsonline.es/conditions/artritis-reumatoide-juvenil
 
 
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TECNICAS DE LABORATORIO 
INMUNODIFUSIÓN RADIAL 
❖ FUNDAMENTO 
 Esta técnica es de tipo inmunoprecipitación y 
consiste en hacer reaccionar un antígeno con su anticuerpo 
correspondiente en un medio semisólido. Este medio 
puede ser de gel de agar o agarosa, en placa de cristal o 
plástico, cuyo espesor sea uniforme y el anticuerpo esté 
distribuido en él. 
 El resultado final será la formación de un anillo de precipitación. Estos geles suelen 
estar coloreados para que la lectura se realice con mayor facilidad. En los geles se hacen 
unos pocillos de dimensiones determinadas y dentro de ellos se dispensa la muestra donde 
queremos cuantificar el antígeno. 
 
❖ MATERIALES Y MUESTRA 
• Agarosa 
• Antiglobulina humana (antígeno) 
• Beaker 
• Placas de petri 
• Estufa de incubación (37ºC). 
• Lámina porta objetos de vidrio 
• Muestras de suero (anticuerpos) 
• Pipetas automáticas de 20 uL 
• Puntas amarillas para pipeta automática 
• Pipeta Pasteur 
 
❖ PROCEDIMIENTO 
1. El antígeno en suspensión se mezcla con el Agar en estado líquido. 
2. Luego se vierte en una placa de petri. 
3. Una vez solidificado con una pipeta Pasteur se hacen agujeros (pocillos) en la placa, que 
 
 
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contendrán la muestra de suero. 
 
4. Se incuba (37°C) de modo que el suero con anticuerpo se difunde por la placa de Agar y 
reacciona con el antígeno contenido en la placa. 
 
5. Al cabo de 24h se ha creado un precipitado fruto de la 
reacción Ag- Ac que se muestra en la placa como línea 
blanca rodeando el pocillo (en ocasiones se pueden aplicar 
tintes para facilitar su visionado) siendo su diámetro un 
reflejo de la concentración de Ac. Que teníamos en la 
muestra. 
 
❖ ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS 
 Los anillos de precipitina serán visibles en 24 a 48 horas. El diámetro de este círculo 
es un reflejo de la concentración de anticuerpos que teníamos en la muestra de suero, de 
modo que, a mayor diámetro, mayor concentración de anticuerpo. 
 
 Para cuantificar la cantidad exacta de anticuerpos es preciso disponer de una recta 
estándar o patrón previamente creado donde se grafica el diámetro vs. Log de la 
concentración de Ag. Esta recta se hace a partir de muestras de anticuerpos conocidas en 
cada pocillo, que reaccionan con el antígeno; en el eje Y el área del círculo y en el eje X la 
concentración de anticuerpos conocida. 
 
 Al final se comparan los valores obtenidos de la muestra de suero frente a los valores 
de la recta patrón, obteniendo así el valor de la concentración de anticuerpos para cada 
muestra de suero del individuo. Del mismo modo, se puede calcular mediante 
una metodología análoga la cantidad de antígeno presente en una muestra, embebiendo esta 
vez en agar anticuerpo y creando la recta patrón sobre la base de concentraciones conocidas 
de antígeno, también se une a IgM. 
 
EJEMPLO: Interpretar las láminas de difusión en agarosa, determinando en que pozos hay 
reacción Ag-Ac. 
 
https://es.wikipedia.org/wiki/Di%C3%A1metro
https://es.wikipedia.org/wiki/Metodolog%C3%ADa
https://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Muestra_(general)&action=edit&redlink=1
 
 
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GRÁFICA: En un papel cuadriculado regular, se debe obtener una curva lineal estándar. Si 
la curva no es lineal, la concentración desconocida no se puede determinar con precisión. 
 
ENSAYO INMUNOABSORBENTE LIGADO A ENZIMAS (ELISA) 
 El ensayo inmunoabsorbente ligado a 
enzimas (ELISA) utiliza como sus siglas lo indican 
una enzima como marcador para mediar la formación 
de complejos antígeno-anticuerpo, es un tipo de EIA. 
Permite detectar pequeñas partículas llamadas 
antígenos, que habitualmente son fragmentos de 
proteínas. La identificación es específica, es decir, 
 
 
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consigue que pequeños segmentos de proteínas destaquen y no puedan ser confundidas con 
otras. 
 
 Representa una aplicación popular del inmunoensayo sándwich heterogéneo de fase 
sólida que combina un reactivo marcado enzima-anticuerpo con un anticuerpo unido a una 
fase sólida. Inicialmente, se utilizaban como material de base sólida tanto las placas de 
microtítulo como las esferas de 1/4 de pulgada. Una placa de microtítulo es simplemente una 
placa plástica cuadrada con pocillos de poca profundidad recubiertos con un analito. 
 
❖ FUNDAMENTO 
 La detección se realiza colorimétricamente por la interacción de un sustrato 
cromogénico y una enzima que ha sido acoplada a un anticuerpo detector La prueba de 
ELISA se basa en la formación de inmunocomplejos, (reacción antígenoanticuerpo, uno de 
los cuales debe ser de reactividad conocida), para detectar la presencia de un análito de 
interés. Consiste en fijar Ag o Ac a un soporte sólido, poniendo en contacto una fase fluida 
que contiene el reactivo complementario formando un complejo. 
 
❖ KIT DE ELISA 
 El contenido del kit puede varias ligeramente. Por favor refiérase a las inserciones 
específicas del producto para obtener una lista completa de contenidos para los ensayos 
individuales. 
• Anticuerpo de captura 
• Anticuerpo de detección biotinilado 
• Estándar masa calibrada 
• Estreptavidina – HRP 
• Protocolo detallado 
 
❖ PASOS GENERALES PARA LA TÉCNICA DE ELISA 
1. Tapizado del pocillo con el antígeno o anticuerpo. 
2. Adición de la muestra problema con la mezcla de antígenos o anticuerpos. 
3. Unión del antígeno o anticuerpo específico al anticuerpo o antígeno tapizado en 
 
 
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el pocillo. 
4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antígeno o anticuerpo no unido. 
 
5. Adición del anticuerpo secundario 
marcado con la enzima. 
 
6. Unión del anticuerpo secundario al 
antígeno o anticuerpo. 
 
7. Lavado del pocillo para eliminar el 
exceso de enzima no unida. 
 
8. Adición del substrato. 
9. Unión del substrato a la enzima. 
10. Desarrollo del color. 
 
❖ EQUIPOS 
 El analizados de Elisa es un 
espectrofotómetro especializado a través del 
cual se realiza la lectura de los resultados 
obtenidos, luego de la aplicación de la 
técnica empleada para la determinación de 
la presencia de antígenos o anticuerpos 
específicos en una muestra analizada. 
 
 Existen varios materiales que son utilizados en los equipos analizadores de Elisa, uno 
de ellos son las cubetas de espectrofotometría, las cuales son elaboradas con dos tipos de 
materiales, el cuarzo y el plástico. Cuando se va a trabajar bajo luz ultravioleta, se utilizan 
las cubetas elaboradas con cuarzo y cuando el trabajo se realiza con la luz visible, las ideales 
son las fabricadas de plástico. 
 
 El analizador de Elisa está provisto de rejillas o filtros de difracción, los cuales 
limitan el rango de la longitud de onda a las utilizadas por esta prueba y están comprendidas 
entre 400 y 750nm. Con el uso del analizador de Elisa, es posible obtener información de 
 
 
16 
una muestra y conocer la naturaleza de la sustancia que contiene. Con ella, también es 
posible determinar la cantidad de sustancia a examinar, y allí su aplicación en la serología y 
la inmunología. 
 
❖ UTILIDAD 
Detección de Antígeno-Anticuerpo: 
• Bacterias 
• Parásitos 
• Hongos 
• Virus 
Detección de complejos autoinmunes: 
• Anti-DNA (Antígenos nucleares extractables: Sm – Ro – La – Rnp) 
• Anti-Histonas (H1, H2A, H2B, H3, H4) 
Detección de Antígenos asociados a tumores: 
• Ag prostático 
• Ag ovario (Ca125) 
• ACE, alfafetoproteína 
 
❖ ANÁLISIS DE RESULTADOS 
¿Qué hacer antes de ejecutar a un ELISA? 
 Una prueba de ELISA se debe realizar 
siempre en réplicas (los duplicados o los 
triplicados) para lograr suficiente número de 
muestras para calcular la desviación estándar y el 
coeficiente de variación. El coeficientedel desvío 
se debe mantener menos el de 20%. Si el desvío 
calculado es alto, después el surgimiento de los 
desvíos debido a medir con una pipeta, la 
contaminación de placas y de reactivos, la evaporación, y/o la temperatura tienen que ser 
evaluados. 
 
 
 
17 
Curva estándar 
 Una curva estándar se utiliza para medir la concentración de la muestra. Primero, los 
valores de la absorción de las concentraciones estándar (pg/ml) se trazan. Una curva negativa 
también se hace que no contiene ningunos datos de la muestra estándar y se utiliza para 
descubrir y para medir ruido de fondo. Para una medición exacta, este valor de base se debe 
restar de la curva estándar. 
 
 Los valores de la absorción de la concentración sabida se pueden trazar como mando 
positivo. La concentración de la proteína del objetivo es derivada primero calculando la 
absorción media y entonces usando la curva estándar para estimar la concentración. 
 
 Los factores de la dilución deben también ser tenidos en cuenta. Por ejemplo, si la 
muestra se ha diluido cuatro veces, después la absorción debe ser multiplicado por cuatro 
antes de usar la curva estándar para derivar la concentración. 
 
Coeficiente de variación 
 La definición del coeficiente de variación es el índice de la desviación estándar y del 
medio - es decir desviación estándar (σ) /mean (µ). Los valores grandes del coeficiente de 
variación indican las inexactitudes debido a medir con una pipeta o a la mezcla de reactivos 
entre los pozos, contaminación bacteriana o fungicida, desecación de pozos, o las variaciones 
de la temperatura. 
 
Recuperación del pico 
 El valor obtenido después de funcionar con la prueba de ELISA depende de cómo 
una proteína apuntada obra recíprocamente con los anticuerpos, y esta acción recíproca se 
compara a una curva 
estándar de la proteína. Varios factores - incluyendo almacenador intermedio, matriz y los 
anticuerpos heterophilic - pueden afectar al atascamiento de la muestra, así que a éste deben 
ser tenidos en cuenta al determinar la exactitud de un ELISA. 
 
 Un análisis del pico se puede realizar para determinar la exactitud de los resultados 
de ELISA. En este análisis, una cantidad sabida de proteína recombinante se agrega o se 
clava hacia adentro a la muestra. Entonces, usando la curva estándar la cantidad de material 
 
 
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se mide. Las desviaciones grandes en los valores medidos pueden indicar los desvíos debido 
a los elementos desconocidos en el análisis. 
 
Análisis de las linearidades 
 Las linearidades ensayan también se utilizan para determinar la exactitud de ELISA. 
En este caso, la muestra clavada `' se diluye en serie al 1:2, al 1:4 y a 1: 8. Si la concentración 
de la muestra alterada se descubre, y si los resultados no visualizan un cambio lineal en las 
mediciones, puede indicar desvíos en la exactitud de ELISA. 
 En algunos casos, los desvíos se pueden observar en ciertas concentraciones y 
observar no más en concentraciones más inferiores. En tales casos, la muestra puede tener 
que ser diluido antes de que se realicen las mediciones de la concentración. 
 
Localización de averías 
• El ruido de fondo se puede causar por varios factores, incluyendo: 
• Lavado escaso de los pozos 
• Almacenadores intermedios contaminados de la estela turbulenta 
• Demasiado reactivo de la detección 
• Reactividad cruzada del anticuerpo 
• Precipitación del almacenador intermedio y/o del analito 
 
 A veces, la curva estándar pobre puede ser generada. Esto puede ser debido a los 
desvíos en la solución estándar, degradación del patrón, el patrón se reconstituye 
incorrectamente, o si la curva no ajusta la escala. En vista de que este último, trazando se 
pueden hacer usando diversas escalas, tales como curva logística con abscisas y ordenadas 
logarítmicas o de 5 parámetros. 
TURBIDIMETRÍA 
Método inmunoturbidimétrico para la determinación del componente C3 del 
complemento 
❖ FUNDAMENTO 
 La proteína C3 del complemento reacciona con el anticuerpo específico anti-C3 
formando inmunocomplejos insolubles. La turbidez provocada por estos inmunocomplejos 
 
 
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es proporcional a la concentración de C3 en la muestra y puede medirse 
espectrofotométricamente. 
 
❖ MUESTRA 
 Suero o plasma heparinizado 
a) Recolección: obtener la muestra de la manera usual. 
 
b) Aditivos: en caso de que la muestra a emplear sea plasma, se recomienda no emplear 
niveles en exceso de heparina como anticoagulante. 
 
c) Sustancias interferentes conocidas: no emplear sueros hemolizados o contaminados. No 
se observan interferencias por bilirrubina hasta 20 mg/dl, triglicéridos hasta 25 g/l, ni 
hemoglobina hasta 10 g/dl. 
 
d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: se recomienda usar suero 
preferentemente fresco. Si el ensayo no puede ser realizado en el mismo día, la muestra 
puede ser conservada 48 horas en refrigerador (2-10o C). En caso que se deba procesar en 
un período más largo de tiempo, debe conservarse inmediatamente a -20o C. 
 
❖ MATERIALES 
Reactivo A: solución fisiológica tamponada, pH 7,35 ± 0,10. 
Reactivo B: anticuerpo monoespecífico anti-C3. 
- Solución fisiológica. 
- Calibrador Proteínas nivel alto Turbitest AA 
(en este caso) 
 
 
20 
- Espectrofotómetro. 
- Cubetas espectrofotométricas de caras paralelas. 
- Micropipetas y pipetas 
- Tubos de Kahn o hemólisis. 
- Reloj 
 
❖ CONDICIONES DE REACCIÓN 
- Longitud de onda: 340 nm 
- Temperatura de reacción: temperatura ambiente (25o C). El control de la temperatura 
no es crítico, pudiendo oscilar entre 22 y 30o C. 
- Tiempo de reacción: 30 minutos 
 
❖ PROCEDIMIENTO 
Para realizar la Curva de Calibración 
 Realizar en tubos de Kahn, las siguientes diluciones en solución fisiológica, del 
Calibrador Proteínas nivel alto: 
- 1:10, 1:20, 1:40, 1:80 y 1:160, empleando solución fisiológica como punto cero. 
 
Calibrador Proteínas diluido 70 ul 
 Reactivo A 900 ul 
- Homogeneizar y leer la absorbancia de cada dilución a 340 nm (DO1 ) llevando el 
aparato a cero con agua destilada. Luego agregar: 
 
 Reactivo B 120 ul 
- Mezclar e incubar 30 minutos a temperatura ambiente. 
- Leer la absorbancia a 340 nm (DO2 ), llevando el aparato a cero con agua destilada. 
 
 Calcular la diferencia (∆A = DO2 - DO1) para cada dilución del Calibrador 
Proteínas, incluyendo el punto cero. Representar en papel milimetrado las diferencias de 
absorbancia (∆A = DO2 - DO1) en función de la concentración en mg/dl (g/l) del Calibrador 
Proteínas. 
 
Para la muestra: 
 
 
21 
- Realizar diluciones 1:10 de las muestras en solución fisiológica. 
 Muestra diluida 70 ul 
 Reactivo A 900 ul 
- Homogeneizar y leer la absorbancia a 340 nm (DO1) llevando el aparato a cero con agua 
destilada. Luego agregar: 
 
 Reactivo B 120 ul 
- Mezclar e incubar 30 minutos a temperatura ambiente. 
- Leer la absorbancia a 340 nm (DO2), llevando el aparato a cero con agua destilada. 
 
❖ CÁLCULOS 
 Calcular la diferencia de absorbancia (∆A = DO2 - DO1) correspondiente a cada 
muestra analizada. Interpolar esta diferencia (∆A) en la curva de calibración para determinar 
la concentración en mg/dl correspondiente a la muestra estudiada. 
 
 Las muestras con absorbancias superiores a la del Calibrador Proteínas nivel alto, 
deben ser diluidas 1:2 con solución fisiológica y procesadas nuevamente. Multiplicar el 
resultado obtenido por dos. 
 
Valores de Referencia 
 90 - 180 mg/dl (0,9 - 1,8 g/l). 
Cada laboratorio debe establecer sus propios valores de referencia. 
 
❖ ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS 
 El C3 es una β-2-proteína que constituye el componente central de la vía clásica y de 
la alternativa del complemento. Se comporta además como una proteína de fase aguda, por 
lo tanto, niveles séricos aumentados se relacionan con enfermedades inflamatorias agudas.Niveles séricos disminuidos se observan en enfermedades autoinmunes, glomerulonefritis, 
deficiencias congénitas, etc. 
 
❖ LIMITACIONES 
 La turbidez y la presencia de partículas en las muestras, pueden interferir con la 
prueba. Por lo tanto, las partículas que puedan resultar de una coagulación incompleta, o de 
 
 
22 
una desnaturalización de las proteínas, deben ser removidas por centrifugación antes de 
proceder a su ensayo. 
 
 Las muestras que presentan absorbancias superiores al calibrador más alto de la curva 
de calibración, deberán ser diluidas y ensayadas nuevamente. La concentración de C3 para 
dichas muestras se obtiene multiplicando el resultado obtenido por el factor de dilución 
correspondiente. 
NEFELOMETRÍA 
 Es una técnica que mide la luz dispersada (desviada) en una dirección determinada 
(en general se define a 90º) por las partículas presentes en la suspensión. En este método se 
mide directamente la luz dispersada, es más sensible que la turbidimetría por lo que es el 
método recomendado para mezclas con muy baja turbidez. 
 
 La nefelometría cuantitativa es un examen de laboratorio para medir en forma rápida 
y precisa los niveles de ciertas proteínas llamadas inmunoglobulinas en la sangre. Las 
inmunoglobulinas son anticuerpos que ayudan a combatir una infección. Este examen mide 
específicamente las inmunoglobulinas IgM, IgG e IgA. 
 
❖ FUNDAMENTO 
 Procedimiento analítico que se 
basa en la dispersión de la radiación 
que atraviesa las partículas de la 
materia cuando la luz atraviesa en un 
medio transparente en el que existe una 
suspensión de partículas sólidas, se 
dispersa en todas las direcciones y 
como consecuencia se observa turbia. 
 
 La dispersión no supone la pérdida neta de potencia radiante solo es afectada la 
dirección de la propagación porque la intensidad de la radiación es la misma en cualquier 
ángulo, lo hace usando una fotocelda colocada en un ángulo de 90° con respecto a una fuente 
luminosa, a través de la cual se ilumina la muestra para analizar que se encuentra en una 
https://medlineplus.gov/spanish/ency/article/002223.htm
 
 
23 
cámara fotocelda de lectura las partículas de la suspensión dispersa en la luz y esta luz va a 
un dispositivo detector, finalmente en el sobreseimiento central junto a la fuente luminosa 
absorbe la luz directa de la muestra a analizar, cuanta mayor dispersión de luz se detecte e 
igual a mayor concentración del analito buscado y a menor dispersión menor concentración. 
 
❖ APLICACIONES 
• Tiene aplicación para la determinación de fracciones del complemento, 
inmunoglobulinas, transferrina, haptoglobina, cadenas kappa y lambda, albúmina, pre-
albúmina, proteína C reactiva, factorreumatoide, alfa 2 macro globulina y otras proteína. 
 
• Se usa en instrumentos automatizados que mide la sensibilidad de los antibióticos, 
determinación de ribonucleasas y sulfatos en orinas. 
 
• Detección de complejos inmunes Cuando una muestra biológica contiene un antígeno 
de interés, éste se mezcla (en una solución buffer) con un anticuerpo para formar un complejo 
inmune. La nefelometría mide la cantidad de luz que se dispersa por la reacción antígeno-
anticuerpo (Ag-Ac), y de esta manera se detectan los complejos inmunes 
 
❖ INSTRUMENTOS 
• Nefelómetro 
 Para la nefelometría es necesario emplear un 
equipo con características específicas, que recibe el 
nombre de nefelómetro. Sus componentes básicos son: 
- Fuente de luz: los modelos más antiguos 
empleaban la lámpara dewolframio. En la actualidad 
se usan lámparas de arco de mercurio (Hg), diodos 
emisores o láser de helio-neón, de baja potencia. 
- Sistema colimador (innecesario con la lámpara de láser), cuyas funciones la de 
concentrar el rayo de luz en haces paralelos. 
- Sistema óptico (colimador + selector de longitud de onda). 
- Cubeta de medición. 
- Detector a 90° 
 
 
24 
❖ MUESTRA 
 Suero, plasma sanguíneo, orina. 
 
❖ PROCEDIMIENTO 
 En esta técnica se añade a la muestra de suero un anticuerpo específico frente a la 
proteína que queramos detectar. El anticuerpo se añade en unas condiciones en las que la 
unión con su proteína va a producir una inmunoprecipitación en fase líquida. Cuando se 
aplica una luz a la muestra el inmunoprecipitado va a dispersarla. La luz dispersada en 
determinados ángulos por estos inmunocomplejos solubles se mide mediante células 
fotoeléctricas como densidad óptica. La cantidad de luz dispersada es proporcional a la 
concentración de proteína en suero. 
 
❖ PATOLOGÍAS RELACIONADAS A LAS DEFICIENCIAS DE LAS 
INMUNOGLOBULINAS 
 Aumento de los niveles de IgG Disminución de los niveles de IgG 
 
● Infección o inflamación crónica 
● Hiperinmunización (número más 
alto que lo normal de anticuerpos 
específicos) 
● Mieloma múltiple por IgG (un tipo 
de cáncer de la sangre) 
● Enfermedad hepática 
● Artritis reumatoidea 
 
● Agammaglobulinemia (niveles muy 
bajos de inmunoglobulinas, un trastorno muy 
raro) 
● Leucemia (cáncer de la sangre) 
● Mieloma múltiple (cáncer de la médula 
ósea) 
● Preeclampsia (presión arterial alta 
durante el embarazo) 
● Tratamiento con ciertos fármacos 
quimioterapéuticos 
Aumento de los niveles de IgM: Disminución de los niveles de IgM 
● Mononucleosis 
● Linfoma (cáncer del tejido linfá-
tico) 
● Macroglobulinemia de Waldens- 
 
 
 
● Agammaglobulinemia (muy rara) 
 
● Leucemia 
 
https://medlineplus.gov/spanish/ency/article/001361.htm
https://medlineplus.gov/spanish/ency/article/000583.htm
https://medlineplus.gov/spanish/ency/article/000205.htm
https://medlineplus.gov/spanish/ency/article/000431.htm
https://medlineplus.gov/spanish/ency/article/001307.htm
https://medlineplus.gov/spanish/ency/article/001299.htm
https://medlineplus.gov/spanish/ency/article/000583.htm
https://medlineplus.gov/spanish/ency/article/000898.htm
https://medlineplus.gov/spanish/ency/article/000591.htm
 
 
25 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
tröm (cáncer de los glóbulos blancos en la 
sangre) 
● Mieloma múltiple 
● Artritis reumatoidea 
● Infección 
● Mieloma múltiple 
Aumento de los niveles de IgA Disminución de los niveles de IgA 
● Infecciones crónicas, especialmente 
del tracto gastrointestinal 
● Enfermedad intestinal inflamatoria, 
como la Enfermedad de Crohn 
● Mieloma múltiple 
 
● Agammaglobulinemia (muy rara) 
● Deficiencia hereditaria de IgA 
● Mieloma múltiple 
● Gastroenteropatía por pérdida de 
proteínas 
(Diagnóstico conjunto a otras pruebas) 
https://medlineplus.gov/spanish/ency/article/000249.htm
 
 
26 
REFERENCIAS BIBIOLOGRÁFICAS 
 
Calculating and evaluating ELISA data, (s.f). Abcam.Recuperado de: 
https://www.abcam.com/protocols/calculating-and-evaluating-elisa-data 
 
Cetola V., (2000). Método inmunoturbidimétrico para la determinación del 
componente C3 del complemento. Recuperado de: 
https://www.wienerlab.com.ar/VademecumDocumentos/Vademecum%20espanol/c3_turbi
test_aa_sp.pdf 
 
Complemento (s.f). Labtestonline. Recuperado de: 
https://labtestsonline.es/tests/complemento 
 
Hernández, L., González, C., (2002), Introducción al Análisis Instrumental. Editorial: 
Ariel Ciencia. Wentworth, Ladner. (1975), Fundamentos de química física 
 
Martínez E., (2012).Determinación de biomasa. Slideshare. Recuperado de: 
http://www.slideshare.net/yuricomartinez/labo2-peso-hmedo-pesoseco-turbidimetra 
 
Medida de los analitos por fotometría y espectrofotometría. [Blog]. Recuperado de: 
http://elblogdeadepi.blogspot.com/p/resumen-analisis-bioquimico-fundamentos.html 
 
Rodríguez, F. (2019). Determinación de IgG por Inmunodifusión Radial (IDR). 
Recuperado de: https://www.franrzmn.com/determinacion-igg-inmunodifusion-radial-idr/ 
 
Rojas M., Anaya C., Cano L., Aristizábal B., Gómez L., Lopera D., 
(2017). Inmunología de Rojas (17th ed.).Colombia: Corporación para Investigaciones 
Biológicas (CIB). 
 
Spike and-Recovery and Linearity of Dilution Assessment for ELISA. (s.f). 
Thermofisher. Recuperado: https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-
science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-
library/pierce-protein-methods/overview-elisa.html 
 
https://www.abcam.com/protocols/calculating-and-evaluating-elisa-data
https://labtestsonline.es/tests/complemento
http://www.slideshare.net/yuricomartinez/labo2-peso-hmedo-pesoseco-turbidimetra
http://elblogdeadepi.blogspot.com/p/resumen-analisis-bioquimico-fundamentos.html
https://www.franrzmn.com/author/francisco-rodriguez/
https://www.franrzmn.com/determinacion-igg-inmunodifusion-radial-idr/
 
 
27 
Universidad de Oriente 
Núcleo Bolívar 
Escuela de Ciencias de la Salud 
Dr. Francisco Virgilio Battistini Casalta 
Departamento de Bioanálisis 
Catedra – Inmunología II 
Laboratorio 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Hecho por: 
Carrera, Ana 
 
 
Ciudad Bolívar, Abril del 2021 
 
 
 
28 
INTRODUCCION 
 
 La cuantificación de linfocitos T circulantes es de suma importancia para la 
evaluación de pacientes en estudio por deficiencias de su sistema inmune, ya sean innatas o 
adquiridas. La enumeración de las poblaciones linfocitarias (T y B), en conjunto con las 
pruebas que evalúan su funcionalidad, contribuyen a precisar la naturaleza de la 
inmunodeficiencia y a predecir las complicaciones más probables que enfrentará el paciente, 
así como a establecer una base para las estrategias profilácticas y terapéuticas posibles. Por 
ejemplo, la evaluación del estado inmunológico de los pacientes infectados por el virus de 
inmunodeficiencia humana (HIV), incluye un control periódico de sus cifras de linfocitos T, 
en especial la subpoblación CD4+ (T cooperadores), cuyas disminuciones muestran 
correlación con la aparición de los signos y síntomas característicos del síndrome de 
inmunodeficiencia adquirida (SIDA). 
 
 Por otra parte, durante el seguimiento y control de pacientes que reciben tratamientos 
inmunosupresivos fuertes (por ejemplo, en receptores de trasplantes, o pacientes con 
neoplasias tratadas mediante quimioterapia/radioterapia, etc.), la evaluación de linfocitos T 
y B puede proveer información útil para regular la dosificación del tratamiento. Algunos 
estudios han descrito que es posible predecir tempranamente una crisis de rechazo en 
trasplantes renales mediante la detección de un aumento de los linfocitos T circulante. 
 
 En el caso de enfermedades linfoproliferativas como las leucemias linfocíticas, la 
clasificación con base en su origen T, B, o NK posee interés, dado que el pronóstico y la 
susceptibilidad a distintas terapias pueden mostrar diferencias. 
 
 
 
 
29 
POBLACIONES LINFOCITARIAS 
 
Generalidades de las poblaciones celulares 
 Una población celular es un conjunto de células de un mismo tipo que se encuentran 
en un ambiente determinado. 
 
 Los linfocitos son un grupo de células del sistema inmunitario. Sus características más 
importantes 
 
• Son las únicas células capaces de reconocer diversos determinantes antigénicos y 
distinguirlos específicamente 
 
• Desempeñan un papel fundamental en el control de las infecciones 
 
 En los linfocitos se evidencian subpoblaciones que difieren entre sí en sus funciones y 
productos proteicos, pero son muy similares desde el punto de vista morfológico. Por esta 
razón se necesitan técnicas de alta sensibilidad y especificidad para su estudio diferencial. 
 
 Los linfocitos humanos pueden clasificarse en dos poblaciones principales según 
su función biológica y su expresión de antígenos de superficie celular: linfocitos B y 
linfocitos T. 
 
 – Linfocitos B: Están implicados en la inmunidad adaptativa con un rol fundamental 
que es el de producir anticuerpos (inmunidad humoral). 
 
 – Linfocitos T: a diferencia de los linfocitos B, los linfocitos T están involucrados en 
la inmunidad celular. Reconocen antígenos de los microorganismos intracelulares y actúan 
destruyendo los microorganismos y las células infectadas. 
 
 • Linfocitos T cooperadores: son CD3+CD4+. Su función característica es que, 
luego de activarse por exposición a un antígeno secretan intermediarios (citocinas) 
que ayudan a la activación y proliferación de otras células como macrófagos y linfocitos 
B, para controlar la infección. 
 
 • Linfocitos T citotóxicos: Están implicados en la destrucción de células 
infectadas por microbios y células tumorales. 
 
Células NK 
 Además de los linfocitos B y T existen otros tipos de células denominadas células 
NK que son morfológicamente indistinguibles de los linfocitos T y B excepto por los 
gránulos que contienen. Las células NK son componentes importantes en la 
defensa inmunitaria innata y median la citotoxicidad contra ciertas células tumorales y 
células infectadas por virus. 
 
Monocitos 
 Los monocitos son células sanguíneas que pertenecen a una subpoblación de 
leucocitos, denominada sistema de fagocitos mononucleares. 
 
• Se encargan de la regulación de la inmunidad innata y adaptiva, así como de la 
remodelación del tejido y la homeostasis. 
 
 
30 
• Cumplen la función patrullaje en búsqueda permanente de algo anormal. 
 
• Fagocitosis consiste en capturar y digerir partículas que son peligrosas y nocivas para 
el organismo. (esto pasa cuando ellos pasan a los diversos tejidos y órganos del 
cuerpo convirtiéndose en MACROFAGOS). 
 
Métodos de separación de las poblaciones linfocitarias: tipos, fundamento. 
 Bøyum (1958) ideó un método basado en la centrifugación de la muestra sobre un 
gradiente de densidad discontinuo, en donde el medio original consistía en una mezcla de 
ficoll y metrizoato de sodio, con densidad de 1,077 g/ml. Este método es rápido y simple, 
por lo que se utiliza muy comunmente para obtener preparaciones enriquecidas de linfocitos 
sanguíneos. Aunque estrictamente esta técnica resulta en la separación de los leucocitos 
mononucleares, que incluyen tanto a los linfocitos como a los monocitos, los primeros 
superan ampliamente en número a los segundos, cuando se trabaja con muestras de sangre 
periférica. 
 
 El medio de separación para purificar linfocitos sanguíneos consiste en una mezcla de 
dos componentes. El ficoll 400 es un polímero sintético de sacarosa y epiclorhidrina, de 
400.000 daltons, soluble en agua. Por otra parte, el diatrizoato de sodio (que ha sustituido al 
metrizoato de la fórmula original de Bøyum) es un compuesto que, al ser mezclado con el 
ficoll, forma soluciones de baja viscosidad y alta densidad. 
 
La función del diatrizoato es proveer la densidad óptima para la separación y a la vez 
la osmolaridad adecuada para mantener la viabilidad de las células. Además, el ficoll causa 
la aglutinación de los eritrocitos, lo cual facilita aún más su sedimentación. 
 
Fundamento de la separación 
 Al estratificar una muestra de sangre sobre el ficoll-diatrizoato y centrifugar, las 
células mononucleares se separan de las demás debido a diferencias de densidad. Como se 
mencionó, el ficoll aglutina los eritrocitos, por lo que estos pasan a través del medio y 
sedimentan al fondo. Los granulocitos también sedimentan por su tamaño y densidad, y por 
su tendencia a formar agregados. Los mononucleares (linfocitos y monocitos), por su menor 
densidad, se quedan en la interfase entre el plasma y el medio, con presencia baja de 
plaquetas y otros tipos celulares. Al final de la centrifugación, los leucocitos mononucleares 
se recogen del anillo blanco que se forma en la interfase entre el plasma y el ficoll-
diatrizoato. 
 
Factores que afectan el procedimiento 
 La cantidad de sangre a procesar debe guardar proporción con el volumen y la altura 
del medio de separación. Al aumentar la altura del estrato de sangre con respecto a la altura 
del medio, se aumenta la contaminacióncon eritrocitos en la interfase. Por esto, el diámetro 
del tubo es un factor importante para establecer el volumen de sangre óptimo para fraccionar. 
Para aumentar el tamaño de la muestra, es preferible aumentar el diámetro del tubo, tratando 
de no variar la altura de las capas de medio y de sangre. 
 
 El rendimiento y la pureza de los linfocitos dependen en gran parte de la eficiencia en 
la remoción de los eritrocitos. Cuando estos son aglutinados por el ficoll, algunos linfocitos 
son atrapados dentro de los grumos, y por lo tanto se pierden. Este fenómeno se reduce 
 
 
31 
diluyendo la sangre 1:2 antes de fraccionarla, usando una solución salina fisiológica, con el 
fin de mejorar el rendimiento final de los linfocitos. La aglutinación de los glóbulos rojos se 
favorece conforme aumenta la temperatura, con lo cual se acelera la separación, pero se 
disminuye el rendimiento (ej. a 37°C). En bajas temperaturas (4°C) se disminuye la 
velocidad de agregación, por lo que hay que prolongar el tiempo de separación. Una 
temperatura de alrededor de 18°C da resultados óptimos en cuanto al balance entre tiempo 
y rendimiento. 
 
Procedimiento 
1. Colocar 2 ml de F-D (ficoll-diatrizoato) en un 
tubo de 10-15 ml. 
 
2. Diluir 2 ml de sangre (anticoagulada1 o 
desfibrinada) con 2 ml de solución salina fisiologica 
(SSF) 
 
3. Estratificar cuidadosamente 4 ml de la sangre 
diluída sobre el F-D (¡no mezclar!). 
 
4. Someter a 1800 rpm por 40 min 
 
5. Con cuidado de no mezclar las capas, sacar el 
tubo de la centrífuga y aspirar el plasma (capa superior) 
con una pipeta, delicadamente, dejando intacto el anillo 
blanquecino de células mononucleares en la interfase. 
 
6. Aspirar el anillo de células mononucleares, sin 
recoger demasiado plasma, ni F-D. Depositar las 
células en un tubo limpio. 
 
 
32 
7. Añadimos 10 ml SSF, mezclamos, sometemos a 1600 rpm por 10 min. 
 
8. Descartamos 5ml, agregamos 5ml y lo sometemos a 1600 rpm por 10min 
 
9. Se descarta 10 ml. 
 
10. Con una pipeta Pasteur sin bulbo, transferir por capilaridad una gota de la suspensión 
a una cámara de recuento celular. 
 
11. Contar 100 linfocitos con el objetivo de 40x y anotar como "rosetas" aquellos 
linfocitos que posean 3 o más eritrocitos adheridos. No deben contarse las células permeables 
al azul tripán (dañadas), ni los monocitos. 
 
12. Calcular el porcentaje de linfocitos T (%T o % células E+), así como su número 
absoluto (T/µl ò células E+ /µl) con base en los datos del hemograma de la muestra (número 
de leucocitos totales y fórmula leucocitaria diferencial). 
 
• Ejemplo del cálculo de la cifra absoluta de linfocitos T: 
 
 Expresión de resultados e interpretación 
 Las cifras de linfocitos T obtenidas deben expresarse tanto en números absolutos 
(T/mm3, T/μl) como relativos (%), para evitar errores de interpretación. Los valores de 
referencia deben ser preferentemente establecidos en las condiciones de cada laboratorio. 
 
El uso de la cámara en esta etapa es esencial, ya que, si la lectura final se realiza en un 
portaobjetos con cubreobjetos convencional, la 
presión que ejerce este último, al colocarlo, 
disgrega un cierto número de rosetas. En cambio, 
el espacio (0,1 mm) existente entre el 
cubreobjetos y la superficie de la cámara de 
Neubauer evita este problema. 
 
El anticoagulante recomendado para 
obtener la muestra de sangre es la heparina sódica 
(10-50 U/ml) sin preservantes. El EDTA puede 
causar una disminución en la formación de 
rosetas. La muestra debe ser procesada el mismo 
día, para preservar al máximo la viabilidad 
linfocitaria. 
 
Ventajas: Este procedimiento permite recuperar alrededor de un 50% de los linfocitos 
presentes en la muestra, con una viabilidad mayor del 90% (determinada mediante exclusión 
del azul tripán) 
 
Desventajas: La unión que se establece entre los linfocitos T y los eritrocitos de 
carnero es muy frágil, lo cual constituye el principal problema técnico de este método: las 
agitaciones, aún leves, pueden desintegrar las rosetas y causar amplias variaciones en los 
resultados. 
 
Cuantificación de linfocitos T mediante formación de rosetas 
Las diferentes poblaciones y subpoblaciones de linfocitos no son distinguibles morfo- 
 
 
33 
lógicamente. Para identificarlas, se requieren métodos de laboratorio que detectan, por lo 
general, proteínas de membrana que utilizamos como "marcadores" de dichas poblaciones. 
Alrededor de 1970 se encontró que los linfocitos T humanos poseen la propiedad de unirse 
espontáneamente a los eritrocitos de carnero in vitro, formando agrupaciones llamadas 
rosetas E. 
 
El fenómeno de formación de rosetas se debe a que los linfocitos T humanos poseen 
en su superficie un receptor que media la unión con los eritrocitos de carnero. 
Inicialmente, este receptor fue denominado "antígeno T11", cuando se generaron las 
primeras series de anticuerpos monoclonales contra marcadores de los linfocitos T. 
Posteriormente, cuando se introdujo el uso de la nomenclatura de "grupos de diferenciación" 
(CD, clusters of differentiation), se cambió su nombre a CD2. Esta es una glicoproteína de 
membrana de 50 kDa, presente en todos los linfocitos T humanos maduros, cuya función 
natural es la interacción con una glicoproteína de 40-70 kDa, denominada LFA-3 (leukocyte 
function antigen) o CD58, presente en la superficie de diversos tipos celulares. Los 
eritrocitos de carnero poseen una molécula análoga al LFA-3 humano en su superficie. 
 
Independientemente de la función natural del CD2, su presencia es útil para 
identificar a los linfocitos T humanos, a través de la formación de rosetas. 
 
Solamente los linfocitos T viables pueden formar rosetas, por lo que las células 
muertas (que se detectan porque han incorporado el colorante supravital azul de tripán) no 
deben ser tomadas en cuenta para establecer el porcentaje de linfocitos T por este método. 
La formación óptima de las rosetas se logra con una incubación breve a 37°C, seguida de un 
período más largo a 4°C, a pH fisiológico. 
 
Roseta B 
Propiedad que tienen los linfocitos B (con receptores en su superficie para el fragmento 
Fc de las inmunoglobulinas) de producir rosetas con hematíes recubiertos de anticuerpos 
antieritrocitarios (p. ej., hematíes D recubiertos de anticuerpos anti-D). Se le denomina test 
de rosetas EA (eritrocito-anticuerpo), pues no precisa complemento. 
 
Estas células son, en su mayoría, theta negativas. No es un buen marcador de linfocitos 
B, pues otras células distintas de las células B tienen dicho marcador, como los monocitos, 
las células T activadas y las células K. Además, no todas las células B tienen receptor para 
 
 
34 
el fragmento Fc de las inmunoglobulinas. 
 
Técnica Inmunitaria de las Rosetas tipo B. 
 Los pasos 1 - 6 son los mismos que los efectuados para la técnica de Rosetas T. 
 
 5. Tomar 0,25 ml. del reactivo linfocitos B (reactivo C3) y mezclarlo con 0,25 ml. células 
linfocitarias. 
 
6. Centrifugar a 1.500 r.p.m. durante 2', bajo control de cronómetro. 
7. Incubar 30' a temperatura de laboratorio. 
8. Retirar el sobrenadante con pipeta Pasteur. 
9. Añadir 2 ml. de solución de Hanks, o incluso 3 ó 4 ml. si queda muy concentrado. 
10. Ponerlo durante 10 segundos en un agitador rápido. 
11. Lectura. 
 
 Hay que destacar que para el empleo del C3 solamente se necesita suero humano. 
 
 Se cuentan en el hematocímetro no menos de 200 células. Se considera como célula 
formadora de roseta aquélla que al menos adhirió 3 hematíes en su superficie. 
 
 
 
 
35 
 
Universidad de Oriente 
Núcleo Bolívar 
Escuela de Ciencias de la Salud 
Dr. Francisco Virgilio Battistini Casalta 
Departamento de Bioanálisis 
Catedra – Inmunología II 
Laboratorio 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Hecho por: 
Grupo Lunes B 
 
 
Ciudad Bolívar, Abril del 2021 
 
 
36 
 
INTRODUCCIÓN 
La inmunofluorescenciaes una técnica hondamente versátil, efectuada primeramente 
por Albert Hewett Coons, Hugh J Creech, Norman Jones y Ernst Berliner de la Universidad 
de Harvard en 1941; a la cual se le han dado una extensa gama de usos en el ámbito científico 
y clínico. Puede ser utilizada para responder preguntas ecológicas, genéticas y fisiológicas 
respecto a muchos organismos. Entre las aplicaciones clínicas se tiene que se aprovecha para 
el diagnóstico directo de algunas enfermedades dermatológicas, bien sea empleando 
inmunofluorescencia directa o indirecta sobre tejido epitelial de los pacientes estudiados. La 
importancia de esta técnica de laboratorio radica en el hecho de su amplia utilidad en el área 
de investigación y diagnóstico de una variedad de agentes virales, tanto en humanos como 
en animales, se ha dispuesto en organismos unicelulares como las levaduras para visualizar 
los microtúbulos intranucleares y citoplasmáticos, actina y proteínas asociadas, los 
filamentos de 10 nm y otros constituyentes del citoplasma, de la membrana y las paredes 
celulares. 
 
En términos generales, la Inmunofluorescencia es una técnica de imagen basada en 
la tinción de células con anticuerpos formados contra una proteína diana que se conjuga 
concisamente con un fluorocromo o en su defecto se emplea junto a un anticuerpo secundario 
conjugado. Desarrollar los conocimientos en un procedimiento como la 
inmunofluorescencia nos permitirá diagnosticar enfermedades autoinmunitarias, siendo una 
herramienta precisa para el juicio médico. 
 
La inmunofluorescencia se clasifica en dos grandes grupos, la cuantitativa 
(inmunoensayo de polarización fluorescente) y la cualitativa (Directa, Indirecta o Indirecta 
amplificada por el complemento). 
 
 
 
 
 
 
 
37 
 
CUESTIONARIO DIAGNOSTICO 
 
1.- ¿Qué es un sustrato en inmunofluorescencia? 
El sustrato es el corte de tejido el cual contiene los antígenos que queremos 
determinar o buscar en el paciente. 
 
2.- ¿Qué es un anticuerpo monoclonal? 
Es un anticuerpo producido por un solo clon de linfocitos B. Los anticuerpos 
monoclonales son anticuerpos idénticos porque son producidos por un solo tipo de célula del 
sistema inmune, es decir, todos los clones proceden de una misma célula madre. 
 
3.- ¿Qué es un anticuerpo antinuclear? 
El sistema inmunitario normalmente produce anticuerpos para ayudarte a combatir 
infecciones. Por el contrario, los anticuerpos antinucleares a menudo atacan los propios 
tejidos del cuerpo. Los anticuerpos antinucleares son autoanticuerpos que tienen como 
blanco el contenido del núcleo celular. Están presentes en enfermedades autoinmunes como 
el Lupus. 
 
4.- ¿Qué es fluorescencia? 
La fluorescencia es un tipo particular de luminiscencia, que caracteriza a las 
sustancias que son capaces de absorber energía en forma de radiaciones electromagnéticas y 
luego emitir parte de esa energía en forma de radiación electromagnética de longitud de onda 
diferente. 
 
 
https://es.wikipedia.org/wiki/Autoanticuerpo
https://es.wikipedia.org/wiki/N%C3%BAcleo_celular
 
 
38 
INMUNOFLUORESCENCIA 
 
Es una técnica histocitoquímica de laboratorio que permite la detección de un 
antígeno o un anticuerpo, mediante el uso de sustancias fluorescentes denominadas 
fluorocromos. Se emplea, de manera habitual, en el diagnóstico de enfermedades 
autoinmunes. Es un conjunto de técnicas diagnósticas que recurren al uso de sustancias 
fluorescentes, fluorocromos, que permiten detectar la presencia de un antígeno o anticuerpo 
en células o tejidos. 
 
Fundamento 
Las moléculas proteicas de los anticuerpos se unen al marcador fluorescente 
(fluorocromo) por medio de enlaces firmes químicos como la actividad inmunológica de 
estos no se altera, la capacidad de los mismos de unirse a los antígenos homólogos 
permanece integra. 
 
Tipos de inmunofluorescencia 
La técnica de inmunofluorescencia tiene variantes que pueden ser cuantitativas o 
cualitativas. 
 
1. Cuantitativa: la variante cuantitativa es el inmunoensayo de polarización 
fluorescente (FPIA) es un inmunoensayo de tipo competitivo en fase homogénea, muy 
utilizado en ensayos de laboratorio clínico para la cuantificación de analitos que se 
encuentran en muy baja proporción en los líquidos biológicos, del orden del microgramo o 
nanogramo por mililitro, tales como hormonas, drogas terapéuticas, drogas de abuso, 
vitaminas y algunos aminoácidos, de importancia clínica. 
 
Método del Inmunoensayo de polarización fluorescente 
Un anticuerpo específico para reconocer a la molécula de interés es puesto en 
contacto con la muestra biológica que contiene el analito y con una cantidad conocida de la 
misma molécula de interés unida químicamente a otra molécula que sirve de "marca" o 
"etiqueta" capaz de generar una señal mensurable, la molécula natural presente en la muestra 
biológica compite por los sitios de unión en los anticuerpos con la molécula marcada y al 
final de un cierto tiempo necesario para que el sistema se estabilice, la proporción de 
https://es.wikipedia.org/wiki/Inmunoensayo
https://es.wikipedia.org/wiki/Analito
https://es.wikipedia.org/wiki/Microgramo
https://es.wikipedia.org/wiki/Nanogramo
https://es.wikipedia.org/wiki/Mililitro
https://es.wikipedia.org/wiki/Hormona
https://es.wikipedia.org/wiki/Vitamina
https://es.wikipedia.org/wiki/Amino%C3%A1cido
 
 
39 
moléculas marcadas unidas a los anticuerpos resulta inversamente proporcional a la cantidad 
de molécula natural presente en la muestra. Esta proporción de molécula marcada unida al 
anticuerpo es la que genera la señal que se mide. En los ensayos competitivos por lo tanto la 
señal producida es inversamente proporcional al analito presente en la muestra (A menor 
cantidad de analito, mayor es la señal y viceversa); esta propiedad permite cuantificar con 
facilidad muy pequeñas cantidades y variaciones en la concentración de un analito. 
 
En lo que se distingue FPIA de otros inmunoensayos competitivos es en la forma en 
que se genera y detecta la señal. En FPIA la molécula marcadora es fluorescente, y lo que se 
detecta es la luz polarizada en un plano específico generada por la fluorescencia de la marca. 
 
En FPIA la molécula competidora marcada es fluorescente y comparativamente 
pequeña, por lo que presenta altas velocidades de rotación en relación a su tiempo de 
decaimiento. Pero cuando la molécula marcada se une a un anticuerpo, que tiene una masa 
de varios cientos de miles de daltons, gira mucho más lentamente. Las moléculas libres al 
ser iluminadas con luz polarizada generan luz no polarizada, pero las moléculas marcadas 
unidas al anticuerpo que giran mucho más lentamente emiten luz polarizada. La intensidad 
de la luz polarizada obtenida es por lo tanto proporcional a la cantidad de molécula 
competidora marcada unida al anticuerpo e inversamente proporcional a la cantidad de 
molécula natural presente en la muestra de interés 
 
2. Cualitativa: existen tres técnicas cualitativas, las cuales son: 
 
a. Directa o primaria: La muestra clínica que presuntamente contiene el antígeno 
bajo estudio es puesta en contacto con un anticuerpo monoclonal dirigido contra dicho 
microorganismo conjugado con un fluorocromo (como por ejemplo fluoresceína). Si el 
antígeno esperado está presente se formará un complejo antígeno--anticuerpo. La reacción 
positiva es en forma de fluorescencia verde manzana y puede verse con la ayuda de un 
microscopio de fluorescencia. 
 
https://es.wikipedia.org/wiki/Fluorescencia
https://es.wikipedia.org/wiki/Luz_polarizada
 
 
40 
Imagen 1. Inmunofluorescencia directa 
 
b. Indirecta o secundaria: es una técnica de doble capa en donde se aplica el 
anticuerpo sin marcar directamente sobre el sustrato de tejido y se visualiza por tratamiento 
con suero anti-inmunoglobulina conjugado con fluorocromo. El proceso se realiza en dos 
etapas: 
Imagen 2. Etapas de la inmunofluorescenciaindirecta 
 
- La primera etapa: se fijan sobre un portaobjeto los antígenos que constituyen el 
sustrato conocido como especifico, sobre él se coloca el suero de quien se sospecha la 
presencia de Ac específicos; si la reacción es positiva se dará la formación del complejo Ag-
Ac no visible ya que el anticuerpo no está marcado. 
 
 
41 
- La segunda etapa: se agrega una anti-inmunoglobulina humana marcada, que 
reaccionará con el Ac del complejo producido en la primera etapa y dará la fluorescencia. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Imagen 3. Inmunofluorescencia directa e indirecta 
 
c. Indirecta amplificada por el complemento: esta técnica está basada en el método 
indirecto para la detección de Ac que fijan el complemento. El procedimiento es parecido 
pero en el segundo paso se añade complemento fresco, que queda fijado alrededor de las 
zonas a las que se ha unido el Ac. Una única molécula de Ac puede inducir la unión de 
muchas moléculas de C3b a la sección, debido al proceso de amplificación que se produce 
en la vía clásica del complemento; a continuación, estas moléculas de C3b pueden ser 
visualizadas mediante anti-C3 marcado con fluoresceína. 
 
 
 
42 
Imagen 4. Inmunofluorescencias cualitativas 
 
Ventajas de la inmunofluorescencia 
• Se pueden obtener resultados rápidos 
• No es necesario realizar cultivos 
• Se pueden identificar microorganismos específicos en un grupo mixto 
• Determina la identidad de un organismo muerto. Es sensible 
 
Desventajas de la inmunofluorescencia 
• Costos en reactivos y equipos 
• Debe ser utilizado por personal especializado 
• Los resultados no son 100% específicos 
• Perdida de actividad fluorescente causada por la exposición a la luz 
 
 
 
43 
Aplicación de los métodos 
 
✓ Inmunofluorescencia directa: Las técnicas directas han sido adaptadas para 
diagnostico bacteriológico, micológico, viral, en la inmunopatología, en la investigación de 
depósitos de complemento o inmunoglobulinas o complejos Ag-Ac sobre determinadas 
estructuras. 
 
La inmunofluorescencia directa se utiliza para diagnosticar enfermedades de tipo 
autoinmunitario, es decir, aquéllas en las cuales las defensas pierden el control y atacan algún 
órgano de nuestro propio organismo. Es de gran utilidad para el diagnóstico de 
enfermedades de piel y mucosas, como el lupus eritematoso. También permiten la detección 
de inmunoglobulinas (IgG, IgA, IgM) y fracción 3 del complemento, cadenas ligeras lambda 
y cadenas ligeras kappa sobre tejido congelado. Sus aplicaciones más comunes son el estudio 
de enfermedades ampollosas o inmunitarias sobre biopsia cutánea y la clasificación de 
glomerulopatías en biopsia renal. 
 
✓ Inmunofluorescencia indirecta: la detección por el método indirecto tiene mayor 
sensibilidad que el directo, por presentar amplificación de señal debido a una unión de dos 
o más anticuerpos, se utiliza para diagnosticar Treponema pallidum (FTA-abs), Toxoplasma 
gondii, Rickettsia conorii. Las técnicas indirectas se usan también ampliamente para 
diagnostico en múltiples campos y como técnicas cuantitativas en múltiples sistemas, 
ejemplos de éstas los tenemos en el diagnóstico de sífilis, lupus eritematosos sistémico y 
toxoplasmosis. 
Microscopio de fluorescencia 
El microscopio de fluorescencia es una variación del microscopio de luz ultravioleta 
en el que los objetos son iluminados por rayos de una determinada longitud de onda. La 
imagen observada es el resultado de la radiación electromagnética emitida por las moléculas 
que han absorbido la excitación primaria y reemitido una luz con mayor longitud de onda. 
Para dejar pasar sólo la emisión secundaria deseada, se deben colocar filtros apropiados 
debajo del condensador y encima del objetivo. 
 
Está compuesto por: 
https://es.wikipedia.org/wiki/Microscopio_de_luz_ultravioleta
https://es.wikipedia.org/wiki/Longitud_de_onda
https://es.wikipedia.org/wiki/Radiaci%C3%B3n_electromagn%C3%A9tica
https://es.wikipedia.org/wiki/Mol%C3%A9cula
 
 
44 
• Fuente de luz: Se necesita una intensa fuente de luz para excitar la fluorescencia 
en el espectro específico de cada fluorocromo. Se emplean lámparas de mercurio a alta 
presión. 
 
• Filtros: Son los que permiten el paso de luz de una determinada longitud de onda, 
la del rango y color necesario para excitar al fluorocromo y bloquean las longitudes no 
deseadas. Una vez filtrada, la luz incide sobre el espécimen por reflexión de un espejo 
dicroico y es nuevamente filtrada para poder ser observada. Los tipos de filtros son: 
 
- Filtro de excitación: selecciona la longitud de onda o el espectro de excitación 
necesaria para excitar la muestra. 
 
- Filtro dicroico: refleja la luz necesaria para la excitación y transmite el resto en 
la banda de emisión. 
 
- Filtro de emisión o de barrera: actúa como una especie de control de calidad, ya 
que solo permite pasar las longitudes de onda de interés. 
 
• Objetivos: Deben tener gran capacidad para transmitir la luz y proveer una imagen 
de alta calidad. De igual manera deben poseer una gran apertura numérica. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Imagen 5. Componentes del Microscopio de fluorescencia 
 
 
 
45 
Utilidad del microscopio de fluorescencia 
Este microscopio hace uso de la fluorescencia y se convierte en una herramienta de 
inestimable valor para la investigación científica, ya que permite alcanzar altos niveles de 
sensibilidad y resolución microscópica, permitiendo una apreciación diferente de la 
información que se puede obtener de los especímenes y que generalmente pasa 
desapercibida. Este microscopio tiene numerosas aplicaciones, como, por ejemplo: 
 
• Marcaje de moléculas en células y tejidos para su caracterización e identificación. 
• Estudio de células normales y patológicas. 
• Estudios inmunológicos. 
• Mineralogía. 
Diferencia con otros microscopios 
Microscopio de 
fluorescencia 
Microscopio óptico 
Microscopio 
electrónico 
Microscopio de luz 
ultravioleta 
Utiliza propiedades 
de fluorescencia 
para generar la 
imagen. 
La muestra es 
iluminada mediante 
luz visible 
La muestra no es 
iluminada con luz. 
Se utiliza electrones 
Ilumina la muestra 
con luz ultavioleta 
Permite observar 
sustancias que 
emiten luz propia a 
una longitud de 
onda determinada. 
La luz es conducida 
por un objetivo y un 
ocular. 
Los electrones 
impactan sobre la 
muestra dentro de 
una cámara de 
vacío. 
Puede observar una 
muestra que es 
transparente a luz 
visible. 
 
Fluorocromos 
Un fluorocromo es una molécula capaz de absorber fotones y emitir fotones de menor 
energía (mayor longitud de onda). Los fluorocromos actúan como fuentes de luz de un color 
determinado que pueden ser localizadas en áreas específicas de la muestra que se estudia. 
 
La reacción de unión ocurre entre los grupos aminos y carboxilo de la proteína y los 
grupos tiocinato o cloruro de sulfonilo de los colorantes. El pH afecta la fluorescencia por 
 
 
46 
esto se debe de trabajar a pH estable y adecuado dependiendo del colorante. 
 
Para las técnicas cualitativas los fluorocromos que se utilizan son: Fluoresceína que 
se debe trabajar a un pH 8, isotiocrato de fluoresceína o rodamina que se debe trabajar a un 
pH 7. Para las técnicas cuantitativas se pueden utilizar: samario, europio o tiberio. 
 
Fluoróforo 
Un fluoróforo es la parte del fluorocromo responsable de la emisión de la 
fluorescencia. 
 
Tipos de fluoróforos 
1.- Moléculas orgánicas: Los fluoróforos Alexa Flúor (derivados de la rodamina) 
han sido utilizados como marcadores de biomoléculas. La fotoestabilidad es una de las 
principales características de este tipo de colorantes, además barren todo el espectro. 
 
2.- Puntos cuánticos: son nano cristales (2-50 nm) semiconductores que, al ser 
iluminados, re-emiten luz en una longitud de onda muy específica y que depende del tamaño 
de este.Cuanto más pequeños sean los puntos, menor es la longitud de onda y más acotadas 
las propiedades cuánticas de la luz que emiten. Por ello la luz emitida vira del azul al rojo a 
medida que el tamaño del punto se incrementa. 
 
3.- Proteicos: GFP posee un barril beta formado por 11 cadenas e incluye una hélice 
alfa central que atraviesa el barril en toda su longitud. En esta hélice hay tres aminoácidos 
consecutivos que forman un cromóforo natural, de forma que cuando la GFP es iluminada 
con luz ultravioleta, produce una brillante fluorescencia verde. 
 
Espectros de absorción y emisión 
- Espectro de absorción: Muestra la diferente intensidad de fluorescencia observada 
en función de la longitud de onda de excitación, a una longitud de onda de emisión fija. 
 
- Espectro de emisión: Muestra la intensidad de la emisión fluorescente en función 
de la longitud de onda de emisión, con una longitud de onda de excitación fija (máxima). 
 
Debido a la diferente configuración electrónica de los fluorocromos cada uno presen-
ta un espectro de absorción y de emisión característica y única. Los fabricantes dan el pico 
 
 
47 
de máxima absorción y el pico de máxima emisión o bien los espectros de absorción y 
emisión. 
Imagen 6. Espectros de emisión y absorción 
 
Los fluorocromos mas utilizados son: Fluoresceina y rodamina 
Fluorocromo 
Longitud de 
onda de 
absorcion (nm) 
Color de 
absorcion 
Longitud de 
onda de 
emisión (nm) 
Color de 
emisión 
Fluoresceina 
(FTIC) 
494 Azul 520 
Verde 
manzana 
Rodamina 
(TRITC) 
540 Verde 570 
Rojo - 
naranja 
 
 
 
 
Imagen 7. Longitud 
de onda de 
fluoresceína y 
rodamina 
 
 
 
 
 
48 
Utilidad 
Los fluorcromos son muy utiles porque la molécula que es marcada con ellos 
(fluorescente), aún cuando sea muy pequeña, puede ser observada debido a la luz que emite. 
Los fluorocromos actúan como fuentes de luz de un color determinado que pueden ser 
localizadas en áreas específicas de la muestra que se estudia. 
 
Ventajas 
No requieren proteínas recombinantes (pero si un anticuerpo primario) 
 
Desventajas 
• Si damos un pulso de luz de excitación a una población de fluoróforos en un solvente 
uniforme, la fluorescencia se decae exponencialmente. 
• Pueden generar puentes (aglomeraciones) en proteínas membranales 
• La mayoría de los fluoróforos tienen una vida media (τ) en el rango de nanosegundos 
 
Equipos para utilizados para la inmunofluorescencia cuantitativa 
En la inmunofluorescencia cuantitativa se puede utilizar el microscopio de 
fluorescencia o también se puede utilizar un fluorímetro o fluorometro. 
 
Un fluorímetro es un dispositivo de laboratorio utilizado para medir los parámetros 
de la fluorescencia: su intensidad y la distribución de longitudes de onda del espectro de 
emisión después de la excitación por un cierto espectro de luz. Estos parámetros se utilizan 
para identificar la presencia y la cantidad de ciertas moléculas específicas en un medio. 
 
Los fluorímetros mo-
dernos son capaces de dete-
ctar concentraciones de mo-
léculas fluorescentes tan ba-
jas como 1 parte por billón. 
 
Imagen 8. Esquema general 
de un fluorímetro 
 
https://es.wikipedia.org/wiki/Fluorescencia
https://es.wikipedia.org/wiki/Intensidad_luminosa
https://es.wikipedia.org/wiki/Longitud_de_onda
https://es.wikipedia.org/wiki/Espectro_de_emisi%C3%B3n
https://es.wikipedia.org/wiki/Espectro_de_emisi%C3%B3n
https://es.wikipedia.org/wiki/Espectro_de_frecuencias
https://es.wikipedia.org/wiki/Mol%C3%A9cula
https://es.wikipedia.org/wiki/Concentraci%C3%B3n
https://es.wikipedia.org/wiki/Parte_por_bill%C3%B3n
 
 
49 
También se pueden utilizar equipos automatizados que es el analizador cuantitativo 
de inmunofluorescencia. 
Pruebas que se pueden determinar por este método 
Prueba de Anticuerpos antinucleares (ANA) 
Una prueba de ANA detecta anticuerpos antinucleares en la sangre. El sistema 
inmunitario normalmente produce anticuerpos para ayudarte a combatir infecciones. Por el 
contrario, los anticuerpos antinucleares a menudo atacan los propios tejidos del cuerpo (se 
dirigen específicamente al núcleo de cada célula). 
 
La detección de ANA debe realizarse mediante inmunofluorescencia indirecta (IFI) 
en líneas celulares como prueba de tamizado inicial debido a su alta sensibilidad. El título 
de referencia para los ANA es de 1:40 para adultos y 1:20 para niños. Títulos o suelen ser 
indicativos de una enfermedad autoinmune. 
 
Los ANAs sugieren la presencia de un lupus eritematoso sistémico (en el cual se 
encuentran presentes en más del 90 % de los pacientes clínicamente diagnosticados); aunque 
también pueden aparecer en otras patologías autoinmunes reumatológicas como la 
enfermedad mixta del tejido conectivo (>90 % de los casos), el síndrome de Sjögren (60 %), 
la artritis reumatoide, la esclerodermia, la polimiositis y dermatomiositis (30 %); y también 
https://es.wikipedia.org/wiki/Lupus_eritematoso_sist%C3%A9mico
https://es.wikipedia.org/wiki/Enfermedad_mixta_del_tejido_conectivo
https://es.wikipedia.org/wiki/S%C3%ADndrome_de_Sj%C3%B6gren
https://es.wikipedia.org/wiki/Artritis_reumatoide
https://es.wikipedia.org/wiki/Esclerodermia
https://es.wikipedia.org/wiki/Polimiositis
https://es.wikipedia.org/wiki/Dermatomiositis
 
 
50 
en otras condiciones autoinmunes no reumáticas como hepatitis autoinmune, enfermedad de 
Addison, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), enfermedad de Hashimoto, anemia 
hemolítica autoinmune, esclerosis múltiple o diabetes mellitus tipo I. 
 
Detección de anticuerpos anti-DNA 
El ensayo se fundamenta en el reconocimiento de los anticuerpos que reaccionan 
contra el DNAn de la mitocondria gigante (cinetoplasto) del parásito Crithidia luciliae. La 
prueba solo se considera positiva cuando se tiñe el cinetoplasto independientemente de la 
tinción en el núcleo, debido a que en el núcleo puede existir reactividad contra otros 
componentes, lo que da resultados falsos positivos. La técnica es altamente específica, pero 
poco sensible, por lo que es conveniente en ciertos casos confirmar los resultados con otras 
pruebas más sensibles como el ELISA. 
 
Los anticuerpos antiDNA son considerados marcadores de Lupus Eritematoso 
Sistémico (LES), su prevalencia en estos pacientes es de 40% a 80%. Bajos niveles de estos 
anticuerpos pueden estar presentes en otras enfermedades autoinmunes. Existe una 
correlación entre los niveles de los anticuerpos anti-DNA y la actividad de la enfermedad. 
Por esta razón, es una herramienta para seguir la evolución de la enfermedad y eficacia del 
tratamiento. 
 
Anticuerpos anti-citoplasma del neutrófilo 
Para la detección de los ANCA, la IFI se utiliza también como prueba de tamizado 
inicial, debido a que en ella se observan los 3 patrones de tinción que se relacionan con 
manifestaciones clínicas de autoinmunidad. Los patrones son: el citoplásmico o cANCA, el 
perinuclear o pANCA y el atípico o xANCA. El patrón cANCA se caracteriza por presentar 
una tinción citoplásmica en neutrófilos fijados con etanol o acetona. Los anticuerpos que dan 
el patrón cANCA reconocen proteínas débilmente catiónicas o neutras como la proteinasa-
3 (PR-3) y la proteína catiónica de 57kDa (CAP-57), las cuales se liberan de los gránulos 
específicos por el tratamiento de las células con alcohol o acetona y se distribuyen de manera 
homogénea en el citoplasma de los neutrófilos. 
https://es.wikipedia.org/wiki/Hepatitis_autoinmune
https://es.wikipedia.org/wiki/Enfermedad_de_Addison
https://es.wikipedia.org/wiki/Enfermedad_de_Addison
https://es.wikipedia.org/wiki/P%C3%BArpura_trombocitop%C3%A9nica_idiop%C3%A1tica
https://es.wikipedia.org/wiki/Enfermedad_de_Hashimoto
https://es.wikipedia.org/wiki/Anemia_hemol%C3%ADtica_autoinmune
https://es.wikipedia.org/wiki/Anemia_hemol%C3%ADtica_autoinmune
https://es.wikipedia.org/wiki/Esclerosis_m%C3%BAltiple
https://es.wikipedia.org/wiki/Diabetes_mellitus_tipo_I