Teorico 2 Fluorescencia

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Teorico 
Fluorescencia, FosForescencia
y Quimioluminiscencia
Dr. Martín F Desimone
Química Analítica Instrumental
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• 1er. paso: absorción o excitación
energía suficiente para llegar a nivel 
electrónico superior S1 o S2 
λ excitación
• 2do. paso: emisión de luz
energía radiativa emitida menor que 
la absorbida, 
λemisión > λ excitación
Corrimiento de Stokes
FLUORESCENCIA
Fluorescencia
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Iluminación continua Pulso de luz
Medidas en estado estacionario 
iluminación de la muestra constante 
(espectro de emisión)
Medidas resueltas en el tiempo la muestra se 
expone a un pulso de luz más corto que el 
tiempo de decaimiento luminiscente. Este 
decaimiento se registra con un sistema de 
detección de alta velocidad en una escala de 
tiempo de nanosegundos 
Rendimiento cuántico
La potencia de la emisión fluorescente F es proporcional a la potencia radiante 
del haz de excitación absorbido por el sistema.
F = K`(P0 – P)
Donde P0 es la potencia del haz que incide sobre la muestra y P es su potencia 
después de atravesar una longitud b del medio. La constante K` depende de la 
eficacia cuántica del proceso de fluorescencia.
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• Fluorescencia intrínseca
fluorescencia natural, propia del sistema
• Fluorescencia extrínseca
agrego a la muestra un fluoróforo externo (sonda fluorescente)
Por ejemplo:
• Proteínas, fluorescencia intrínseca debido a residuos aminoacídicos 
aromáticos, predomina el triptofano.
Además marcado con sondas fluorescentes (FITC, DNS). GFP y derivados.
• Ácidos nucleicos, sin fluorescencia intrínseca, se agregan sondas 
fluorescentes catiónicas planares (EtBr, DAPI) o fosfolípidos marcados
• Membranas, no fluorescentes, se agregan sondas liposolubles con baja 
fluorescencia en agua (DPH, ANS)
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Puntos cuánticos de CdSe 
ampliamente utilizados como 
marcadores para el 
diagnóstico biológico. Puede 
observarse el diferente color 
de la disolución según el 
tamaño nanométrico de los 
nanocristales. (inferior) 
cuando los puntos cuánticos 
se recubren con el 
bioreceptor adecuado 
pueden emplearse como 
dianas específicas. En el 
ejemplo se muestra la
localización en una única
célula de ciertos
componentes celulares
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Lámparas
1. Fuentes
•Lámpara mas comun para los fluorimetros de filtro es la lámpara de vapor de 
Mercurio de baja presión con ventana de sílice fundida, que provee líneas 
intensas a 254, 366, 405, 436, 546, 577, 691 y 773 nm.
•Para los espectrofluorímetros, donde se requiere una fuente de radiación 
continua, normalmente se utiliza la lámpara de arco de alta presión de Xenón. 
Es útil ya que su espectro es continuo entre 300 y 1330 nm
•Láser. Para detección de ultratrazas por fluorescencia.
Láseres
Para las medidas de fluorescencia se utilizan cubetas fabricadas con cuarzo.
Detectores
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insTrumenTaciÓn
insTrumenTaciÓn
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Metafase hibridizada con una 
probe para todos los 
centrómeros
Probes para cromosoma 7. Se utilizó un 
anticuerpo marcado con fluoresceína para 
identificar homólogos
Sondas fluorescentes para proteínas
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Sondas fluorescentes para 
ácidos nucleicos
Fluorescence micrographs of osteoblasts
Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 178 (2019) 214–221
Cell membrane integrity: 
Fluorescence
microscopy images of the 
bacteria
H = hexano, CH = ciclohexano, T = tolueno, EA = acetato de etilo, Bu = butanol
Efectos del solvente y del entorno local sobre la fluorescencia
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FosForescencia
DIAGRAMA DE 
JABLONSKI (1898-
1980)
Los instrumentos que se utilizan para estudios de 
fosforescencia tienen diseños similares a los 
flourómetros y a los espectrofluorímetros antes 
mencionados, solo difieren en que se requieren 
dos componentes adicionales. El primero es un 
dispositivo que irradia alternativamente la 
muestra y después de un retraso adecuado en el 
tiempo, mide la intensidad de fosforescencia. 
El retraso en el tiempo es necesario para 
diferenciar la emisión fosforescente de larga vida 
de la emisión de fluorescencia de corta duración 
que podría originarse en la muestra. 
FosForimeTro
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Quimioluminiscencia
Las grandes aplicaciones analíticas de la QL como método de 
detección en inyección en flujo, cromatografía líquida (CL) y 
electroforesis capilar (EC), junto con el gran potencial del 
inmunoensayo, hacen de esta técnica un campo de investigación muy 
interesante en una amplia variedad de disciplinas, que incluyen 
técnicas de separación en análisis químico, biológico, farmacéutico, 
biomédico y alimentario, control de calidad, etc.
Combinado con separaciones por cromatografía líquida de alta 
resolución (CLAR) , se han empleado varias reacciones 
quimioluminiscentes, entre otras con peroxioxalato, luciferasa, 
lucigenina y luminol
La QL se define como la emisión de radiación electromagnética 
(normalmente en la región del visible o del infrarrojo cercano) 
producida por una reacción química. Cuando esta emisión proviene 
de organismos vivos o sistemas derivados de ellos, se denomina 
bioluminiscencia
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Una ventaja de las técnicas QL es que permiten emplear una 
instrumentación básica bastante sencilla, ya que el sistema óptico no 
requiere fuente externa de excitación
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Las medidas de QL están fuertemente influenciadas por aquellos 
factores experimentales que afectan al rendimiento cuántico y a la 
velocidad de reacción, como son:
— La estructura química del precursor quimioluminiscente, no solamente 
la parte que contiene al grupo excitado electrónicamente, sino también 
las cadenas laterales.
— La naturaleza y concentración de otras sustancias que afectan el 
proceso de QL y que favorecen otros procesos competitivos no 
radiantes.
— El catalizador seleccionado.
— La presencia de iones metálicos, especialmente metales de transición 
implicados en el proceso de oxidación.
— La temperatura
— pH y fuerza iónica
— La hidrofobicidad del disolvente y la composición de la disolución (por 
ejemplo, la QL del luminol oxidado en dimetilsulfóxido (DMSO) es 0.05 
comparado con 0.01 en agua, siendo los colores azulvioleta (425 nm) y 
verde-azulado (480-502 nm), respectivamente)
— La presencia de aceptores de la energía transferida
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La aplicación de un spray con luminol sobre la superficie a investigar 
puede producir una luminiscencia capaz de detectar hematina a dilución 
de 1:108
Mecanismo propuesto 
para la reacción de la 
lofina
Mecanismo propuesto 
para la reacción de la 
lucigenina
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En QL indirecta, uno de los sistemas no biológicos más 
frecuentemente utilizados se basa en la reacción quimioluminiscente de 
los peroxioxalatos (PO-CL), que supone la oxidación por peróxido de 
hidrógeno de un éster aril oxalato en presencia de un fluoróforo
Reacciones bioluminiscentes
Considerando la 
estequiometría
de la reacción, 
por cada 
molécula
de ATP 
consumida se 
emite 
aproximadamente 
un fotón.
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Esquema de un luminómetro
la emisión quimioluminiscente no es constante sino que varía con el tiempo (el flash 
de luz está compuesto de una señal que se produce tras la mezcla de los reactivos, 
alcanza un máximo y después cae hasta la línea de base), y este perfil de emisión 
frente al tiempo puede variar ampliamente en diferentes sistemas 
quimioluminiscentes, por lo que hay que extremar el cuidado para detectar la señal 
en sistemas en flujo, midiendo en periodos de tiempo bien definidos.
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Algunas aplicaciones 
de la QL
Recientemente, las investigaciones se están centrando especialmente en el 
desarrollo de productos quimioluminiscentes para aplicaciones de
diagnóstico clínico.
La QL es hoy en día un posible sustituto del marcado isotópico, 
remplazando así el uso de radioisótopos. 
La QL se aplica también en el control de calidad de productos cárnicos y 
residuos
Resulta considerablemente ventajosa la sensibilidad que ofrecen las 
reacciones basadas en QL en diversos ámbitos del análisis aplicado, por 
ejemplo en la determinación de compuestos prohibidos en diversas 
matrices.
Como la intensidad de emisión es función de la concentración de las 
especies químicasimplicadas en la reacción QL, las medidas de la 
intensidad de emisión pueden emplearse con fines analíticos
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Fin