Manejo de muestras para estudios moleculares

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Introducción
Los estudios de biología molecular o tecnología del ADN 
recombinante incluyen los análisis en que el material de inte-
rés son los ácidos nucleicos: ADN y ARN. El conocimiento 
de las características y propiedades de estas dos biomolécu-
las ha permitido la implementación de técnicas utilizadas en 
investigación y en la práctica médica. Estas metodologías se 
aplican con diversos fi nes, como la identifi cación de indi-
viduos, el monitoreo de tratamientos, el establecimiento de 
diagnósticos, la detección de bacterias y virus, la determina-
ción de carga viral, y el estudio de mutaciones y polimorfi s-
mos génicos, entre otros.
El análisis molecular constituye una herramienta indis-
pensable en el área de ciencias de la salud y establece diag-
nósticos, pronósticos y tratamientos certeros, específi cos y 
actuales. Asimismo, estos análisis permiten profundizar en 
el conocimiento de los mecanismos normales y las alteracio-
nes de los procesos celulares que participan en el desarrollo 
de una enfermedad, así como proponer nuevas alternativas 
terapéuticas y preventivas.
Este capítulo pretende brindar al lector un panorama 
general de los lineamientos básicos para el manejo de mues-
tras biológicas que serán sometidas a estudios moleculares. 
Se explica cómo seleccionar, obtener y preservar la muestra 
para obtener resultados fi dedignos. Además, se mencionan 
algunos ejemplos específi cos y las áreas de aplicación del 
análisis molecular.
Manejo de muestras
La implementación y realización de las técnicas molecula-
res debe llevarse a cabo por personal altamente capacitado 
en el área de biología molecular. Sin embargo, los resultados 
que se obtengan no sólo dependerán de la prueba molecu-
lar que se emplee, sino también de la toma y conservación 
de la muestra de manera apropiada. De este modo, la meto-
dología utilizada, bien sea simple o sofi sticada, económica o 
costosa, no será confi able si no se parte de una muestra 
manejada de forma adecuada. En general el personal encar-
gado de la toma, el transporte y del procesamiento de la 
muestra no es el mismo, por lo que es importante que cada 
uno de los implicados en el proceso conozca los cuidados y 
las consideraciones necesarios para evitar resultados erró-
neos. El manejo de muestras implica tres pasos fundamen-
tales: selección, toma y preservación de la muestra.
Selección de la muestra:
¿qué muestra debo estudiar?
Debe elegirse la muestra que contenga el ácido nucleico de 
interés. De aquí surgen dos alternativas: estudio de ácidos 
nucleicos del individuo o detección de ácidos nucleicos 
exógenos. En la fi gura 10-1 se señalan algunos casos en los 
que pueden aplicarse los análisis moleculares y el tipo de 
muestra adecuado para tal fi n.
Estudio de ácidos nucleicos de un individuo
En un individuo se puede estudiar su estructura genómica 
(ADN) o la expresión de sus genes (ARN) en una situación 
u órgano específi cos.
Análisis de la estructura genómica 
de un individuo 
Para este tipo de estudios la molécula de interés es el ADN 
genómico que se encuentra en el núcleo de las células. 
Todas las células de un individuo poseen el mismo genoma, 
que no se ve afectado por la edad ni por variables metabóli-
cas. Por ello, la muestra para estudiar la estructura genómica 
de un individuo puede ser cualquier célula nucleada. Sin 
embargo, hay que elegir la muestra que involucre el procedi-
miento menos invasivo y la menor cantidad de riesgos e 
incomodidad para el paciente.
Manejo de muestras para
estudios moleculares
94 PARTE II • Metodología del ADN recombinante
La muestra de elección para el análisis de la estructura 
genómica de un individuo es sangre periférica con anticoa-
gulante; ésta contiene glóbulos blancos, glóbulos rojos y 
plaquetas. Las únicas células de este tejido que poseen 
núcleo, y por ende ADN, son los leucocitos, a partir de los 
cuales es posible extraer ADN genómico.
El análisis del ADN de una persona es importante, ya 
que permite identifi car individuos, detectar polimorfi smos 
génicos de predisposición o protección a ciertas enferme-
dades, analizar mutaciones y establecer el diagnóstico de 
enfermedades genéticas.
Estudio de la expresión génica de un individuo
Para este análisis la molécula de interés es ARN mensajero 
(ARNm). El estudio de la expresión génica de un individuo 
revelará los cambios bioquímicos que experimenta el orga-
nismo en respuesta a una situación particular o momento 
metabólico. La expresión génica se regula de manera espa-
cial y temporal, y la regulación espacial representa la base 
de la diferenciación celular. Esto signifi ca que los genes no 
se expresan en todos los tejidos, sino que cada tejido u órga-
no expresa solamente los genes necesarios para llevar a 
cabo su función; por ejemplo, la insulina se expresa en las 
células beta del páncreas, la albúmina en los hepatocitos, la 
mielina en las células de Schwann del sistema nervioso cen-
tral, etc. Por otro lado, la regulación temporal signifi ca que 
la expresión génica depende del momento metabólico en el 
que se encuentre el individuo: en un individuo sano o enfer-
mo, en estado de ayuno o posprandial, en un embrión o en 
un anciano, o en estado de euforia o tristeza. Por esto, el 
individuo, como tal, es el resultado de la expresión de sus 
genes en un momento determinado. Estudiar la expresión 
génica resulta elemental en investigación para evaluar la 
respuesta a una variable específi ca y contribuir al conoci-
miento de la fi siología y patología humanas. Sin embargo, 
en la práctica médica, el estudio de la expresión de genes es 
complejo, y aún no supone una herramienta de diagnóstico 
de uso común, al alcance de todos, que brinde resultados 
que dicten o modifi quen estrategias de tratamiento clínico 
de manera signifi cativa.
La muestra de elección dependerá del tejido donde se 
exprese el gen de interés: si se expresa en leucocitos, la mues-
tra será sangre periférica con anticoagulante; si lo hace en el 
hígado, una biopsia de hígado, y si se expresa en tejido tumo-
ral, una biopsia del tejido sospechoso; por ejemplo, si se 
desea conocer qué tanto se expresa el gen de la telomerasa en 
un tumor de cáncer de pulmón, la muestra indicada será la 
biopsia del tumor.
Detección de ácidos nucleicos exógenos
ADN exógenos
Las técnicas de biología molecular permiten la detección 
del ADN procedente de cualquier fuente ajena al paciente, 
como bacterias y virus de ADN, por lo que constituyen una 
herramienta útil para el diagnóstico molecular de enferme-
dades causadas por microorganismos. Mycobacterium 
tuberculosis es un buen ejemplo, ya que es una bacteria de 
crecimiento lento cuyo diagnóstico mediante cultivo 
microbiológico puede requerir hasta cinco semanas; mien-
tras que las técnicas moleculares permiten su detección en 
24 a 48 horas. Sin embargo, para la identifi cación de otros 
microorganismos, el cultivo microbiológico es una herra-
mienta económica, sensible, rápida y específi ca. Por tal 
motivo, es recomendable que los estudios moleculares no 
se apliquen en forma indiscriminada.
Para la detección de genomas exógenos, la muestra 
dependerá de la historia natural del microorganismo infec-
tante; por ejemplo, en la detección del virus de la hepatitis B 
ESTRUCTURA
GENÓMICA
MUTACIONES POLIMORFISMOS
FIBROSIS
 QUÍSTICA
HEMOFILIA
DISTROFIA
 MUSCULAR
ADN ARNm
LEUCOCITOS
SUERO
BIOPSIA
LÍQUIDO SINOVIAL
LEUCOCITOS DE
SANGRE
PERIFÉRICA
DIABETES
CIRROSIS
CÁNCER
DISTROFIA
 MUSCULAR
DIABETES
CIRROSIS
CÁNCER
OBESIDAD
ARTRITIS
EXPRESIÓN
GÉNICA
DETECCIÓN DE
GENOMAS
EXTRAÑOS
VHB
VHC
VIH
PAPILOMA VIRUS
M. TUBERCULOSIS
ADN/ARN
exógeno
LEUCOCITOS SUERO
EXUDADO VAGINAL
LÍQUIDO
 CEFALORRAQUÍDEO
Figura 10-1. Selección de muestras para estudios moleculares.
CAPÍTULO 10 • Manejo de muestras para estudios moleculares 95
(VHB), se sabe que éste es un virus hepatotrófi co que al 
replicarse produce lisis celular y que los virus se diseminan 
por todo el organismo a través del torrentesanguíneo; por 
ello, la muestra de elección es sangre periférica sin anticoa-
gulante para la obtención de suero mediante centrifugación.
ARN exógenos
La detección de ARN exógeno a través de estudios molecu-
lares es una práctica continua en investigación, y en algunos 
casos específi cos de aplicación clínica. Por ejemplo, la 
detección y la cuantifi cación del ARN del virus de la inmu-
nodefi ciencia humana (VIH) y del virus de la hepatitis C 
(VHC) mediante estudios moleculares suponen una herra-
mienta elemental en el monitoreo de su tratamiento.
La muestra de elección dependerá, al igual que en la 
determinación de ADN, de la historia natural de la partícu-
la viral infectante. Tanto en el caso del VIH como en el del 
VHC, su historia natural permite establecer que el espéci-
men adecuado es suero procedente de una muestra de san-
gre periférica sin anticoagulante.
Toma de la muestra: ¿cómo debe tomarse 
la muestra?
En la toma de muestras para estudios moleculares deben 
considerarse algunos factores y recomendaciones que se 
mencionan a continuación. Si la muestra es sangre periféri-
ca, no es indispensable el estado de ayuno, ya que la ingesta 
de alimento no modifi ca la concentración ni la estructura de 
los ácidos nucleicos; sin embargo, es recomendable el ayu-
no para evitar que la alta concentración de lípidos de la 
muestra interfi era con la extracción de los ácidos nucleicos.
Uso de material libre de nucleasas
Las nucleasas (ADNsas y ARNsas) son enzimas altamente 
estables que degradan ARN, por lo que es necesario que se 
garantice la ausencia de estas enzimas en el material que se 
destine para análisis molecular, como lo son puntas y tubos 
de plástico, que deben ser nuevos, estériles y desechables. El 
material de vidrio y de metal puede someterse a temperatu-
ra de 230°C durante 8 horas para inactivar nucleasas.
Uso de guantes y cubrebocas
Las ADNsas y ARNsas se encuentran en la saliva y en el 
sudor, por lo que es obligatorio usar guantes y cubrebocas y 
su cambio frecuente cuando se trabaja con ácidos nuclei-
cos.
Limpieza total
Las bacterias, los hongos y las células muertas de la piel son 
fuentes ricas en ARNsas, por lo que se recomienda tomar 
las muestras en un ambiente higiénico, limpiar las superfi -
cies de trabajo con agentes descontaminantes y utilizar 
inhibidores de ARNsas, como el fenol, el dietilpirocarbona-
to de sodio (DEPC) u otros agentes ofrecidos por diversas 
casas comerciales.
Anticoagulantes
Se dispone de diversas sustancias que inhiben la cascada de 
la coagulación y que se utilizan en la toma de muestras. El 
ácido etilendiaminotetracético (EDTA) es un quelante de 
calcio y es el anticoagulante empleado con más frecuencia. 
Otro anticoagulante muy común es el citrato de sodio. 
Ambos pueden utilizarse para toma de muestras de sangre 
que se someterán a estudios moleculares. No se recomienda 
el uso de heparina, ya que puede interferir en procedimien-
tos posteriores, como la reacción en cadena de la polimerasa 
(PCR).
ADN o ARN de glóbulos blancos
Para aislar ADN o ARN a partir de glóbulos blancos, debe 
tomarse una muestra de sangre periférica en un tubo nue-
vo, estéril con anticoagulante, EDTA o citrato de sodio. La 
cantidad de sangre dependerá del método de extracción de 
ácidos nucleicos que vaya a emplearse y de la cantidad
de éstos que se requiera. Para la obtención de ADN, las 
muestras pueden guardarse a 4ºC hasta por cinco días sin 
que afecte de manera signifi cativa a la cantidad de ADN . 
Para la obtención de ARN el procesamiento debe ser, de 
preferencia, de inmediato, para evitar la degradación por 
ARNsas.
ADN o ARN de suero
Se toman 3 ml de sangre periférica en un tubo seco. Se deja 
a temperatura ambiente el tiempo mínimo necesario para 
permitir la formación del coágulo (máximo, 20 minutos). 
Enseguida, la muestra se centrifuga a 3 000 rpm durante 10 
minutos; se separa el suero, y se transfi ere a un tubo nuevo 
y estéril. El suero se somete al proceso de extracción de áci-
dos nucleicos adecuado, o bien se almacena a –20ºC hasta 
su procesamiento. El paquete globular se desecha de acuer-
do con las normas sanitarias de seguridad para desechos de 
material biológico contaminante.
ADN o ARN de biopsias
La expresión génica constituye el fundamento de la diferen-
ciación celular, por lo que el estudio de la expresión génica 
de un individuo involucra la toma de una biopsia del tejido de 
interés. También puede realizarse la búsqueda de ácidos 
nucleicos exógenos en un tejido específi co. La toma de 
biopsia no es un procedimiento simple sistemático, sino 
que debe realizarlo personal médico experto. Es un método 
invasivo que representa un riesgo para el paciente y requie-
re del uso de equipos costosos; por ejemplo, en el caso 
de infección por el VHB en estadio no replicativo, una biop-
sia hepática podría servir tanto para evaluar el grado del 
daño hepático mediante el estudio de la expresión de colá-
gena (ARN del huésped), como para llevar a cabo la bús-
96 PARTE II • Metodología del ADN recombinante
queda del virus (ADN viral). La toma de la biopsia hepática 
debe dirigirse con un equipo de ultrasonido, y el paciente 
debe permanecer en reposo total después del procedimien-
to, oprimiendo el sitio de la punción durante por lo menos 
12 horas para evitar hemorragias y complicaciones.
Otros fl uidos biológicos
En el caso de orina, líquido cefalorraquídeo o líquidos de 
punción, es necesario tomar la muestra en recipientes nue-
vos, estériles, con las precauciones de limpieza y esterilidad 
indicadas en este capítulo.
Preservación. ¿Qué variables afectan 
la estabilidad de los ácidos nucleicos?
Los ácidos nucleicos son susceptibles de degradarse por las 
nucleasas existentes en todas las células. La preservación de 
los ácidos nucleicos está dirigida a la inactivación de nuclea-
sas, por lo que las principales variables que afectan la inte-
gridad del ADN y el ARN aislados o dentro de las muestras 
son la temperatura y el tiempo. Debido a las características 
fi sicoquímicas y estructurales de los ácidos nucleicos, el 
ARN es una molécula mucho más sensible a la acción de 
nucleasas que el ADN, por lo que los cuidados para su pre-
servación suelen ser más estrictos. El ADN aislado puede 
mantenerse viable a 4ºC durante varias semanas, a –20ºC 
durante varios meses y a –70ºC durante años. Pueden utili-
zarse inhibidores de ADNsas, cuando el ADN sea la molécula 
en estudio, o bien inhibidores de ARNsas, cuando se tenga 
interés en estudiar ARN. Una recomendación valiosa es colo-
car la muestra desde el momento de la toma en varias alícuo-
tas para evitar congelamientos y descongelamientos repetidos 
que favorezcan la degradación de los ácidos nucleicos.
Biopsias
Como ya se explicó, las biopsias se emplean generalmente 
para estudiar la expresión génica, es decir, ARN; aunque 
también puede extraerse ADN exógeno o del paciente. Sin 
embargo, los cuidados en el manejo de las biopsias están 
dirigidos principalmente a la preservación de ARN por ser 
una molécula fácilmente degradable. Los tejidos contienen 
ARNsas endógenas que pueden inactivarse a baja tempera-
tura. Se recomienda el uso de nitrógeno líquido para conge-
lar el tejido inmediatamente después de su recolección, ya 
que su temperatura se encuentra por debajo de los –196ºC, 
y transportarlo en él hasta el sitio donde se almacenará o 
procesará para la extracción de ácidos nucleicos. Sin embar-
go, la congelación con nitrógeno líquido no siempre es una 
opción viable, y existen algunas soluciones en el mercado 
para preservar la integridad del ARN en tejidos, almace-
nando la muestra a 4ºC hasta por un mes antes de aislar el 
ARN. Finalmente, las biopsias pueden mantenerse dentro 
de un ultracongelador a –70ºC, o bien en nitrógeno líquido 
por tiempo indefi nido antes de la extracción de ácidos 
nucleicos.
Fluidos biológicos
Siempre que la molécula de interés sea ARN, las muestras 
deben mantenerse a –70ºC o en nitrógeno líquido, hasta 
que se llevea cabo la extracción de ARN.
ADN de leucocitos
Las muestras de sangre para obtención de leucocitos y la pos-
terior extracción de ADN pueden mantenerse a temperatura 
ambiente entre 15ºC y 25ºC, hasta por 48 horas; a 4ºC por 
varios días, o indefi nidamente a –70ºC. Sin embargo, para 
garantizar la obtención de ADN en buena cantidad y de bue-
na calidad utilizando métodos económicos de extracción, 
debe llevarse a cabo la extracción lo más pronto posible.
ARN o ADN en suero
El suero debe mantenerse a –70ºC o en nitrógeno líquido.
Uso de métodos comerciales 
En la actualidad, el desarrollo de la biología molecular y la 
ingeniería genética han permitido el diseño de moléculas o 
sustancias que preservan la integridad de los ácidos nuclei-
cos manteniendo las muestras a –20ºC, 4ºC y aun a tempe-
ratura ambiente. Asimismo, se dispone de métodos comer-
ciales para la extracción de ácidos nucleicos de muestras no 
frescas, que ofrecen un rendimiento aceptable a partir de 
muestras no almacenadas de manera adecuada. Obviamen-
te esta diferencia en el rendimiento se refl eja también en el 
costo, ya que un método casero de extracción de ácidos 
nucleicos podrá tener un costo 100 veces menor que uno 
comercial. La cuidadosa preservación de las muestras 
garantizará resultados fi dedignos y la disponibilidad de 
ADN o ARN para llevar a cabo ensayos por triplicado y ase-
gurar resultados libres de errores, al ofrecer una cantidad y 
una calidad de ácidos nucleicos buenas en la muestra, aun 
utilizando métodos económicos y sencillos de extracción.
Contaminación de muestras y degradación
Pueden obtenerse resultados no fi dedignos cuando las 
muestras no se procesan o conservan de forma adecuada 
(fi gura 10-2), denominados falsos positivos y falsos negativos.
Resultados falsos positivos
Un resultado falso positivo se obtiene cuando una muestra 
se contamina con otra, debido a un procesamiento inade-
cuado y da como resultado la detección de ADN o de ARN 
ajeno a la muestra problema.
Resultados falsos negativos
Un resultado falso negativo surge cuando el ADN o el ARN 
presentes en una muestra se degradan por acción de las 
nucleasas, lo que los convierte en indetectables a la sensibi-
lidad del método molecular utilizado.
CAPÍTULO 10 • Manejo de muestras para estudios moleculares 97
Trastornos o agentes infecciosos
detectados por estudios moleculares
a) Agentes infecciosos: VIH, VHB, VHC, virus del papilo-
ma humano (VPH), Mycobacterium tuberculosis, geno-
tipos del VHB, etcétera.
b) Enfermedades genéticas: fi brosis quística, distrofi a 
muscular de Duchenne, anemia de células falciformes, 
etcétera. 
c) Polimorfi smos génicos de predisposición o protección a 
enfermedades: apolipoproteína E en la enfermedad de 
Alzheimer, receptor β-3-adrenérgico en artritis reuma-
toide, cyp2E1 en cirrosis, etcétera.
d) Enfermedades adquiridas, expresión de genes: ARNm 
de albúmina en cirrosis, ARNm de ApoA1 en enferme-
Figura 10-2. Contaminación y degradación de muestras.
dad hepática, diabetes mellitus tipo 2, ARNm de albú-
mina en cirrosis, etcétera.
Áreas de aplicación de los
estudios moleculares
Los estudios moleculares tienen utilidad en todas las áreas 
de las ciencias biológicas. A continuación se mencionan 
algunas de las disciplinas correspondientes a las ciencias de 
la salud:
a) Infectología: los estudios moleculares se utilizan amplia-
mente en la identifi cación de virus y bacterias, por sus 
elevadas sensibilidad, especifi cidad y rapidez.
b) Epidemiología: la detección de polimorfi smos génicos de 
susceptibilidad o protección en una población mediante 
estudios moleculares es de gran utilidad para la imple-
mentación de campañas de prevención. Asimismo, los 
estudios moleculares han permitido la identifi cación de 
genotipos de microorganismos endémicos de una región 
para establecer tratamientos específi cos. 
c) Nutrigenómica y nutrigenética: el análisis molecular 
permite evaluar la interacción de los genes y los nutri-
mentos para la preservación y mejoramiento de la salud.
d) Farmacología: el conocimiento de los procesos fi siológi-
cos y patológicos moleculares ha contribuido al diseño 
de nuevos fármacos, con mayor especifi cidad y menor 
cantidad de efectos colaterales.
e) Terapia génica: los procedimientos moleculares han 
hecho posible el surgimiento de nuevas alternativas de 
tratamiento a padecimientos genéticos o adquiridos 
incurables.
CONTAMINACIÓN Y DEGRADACIÓN
DE MUESTRAS
ACCIÓN DE NUCLEASAS
CONTAMINACIÓN DE MUESTRAS FALSO POSITIVO
FALSO NEGATIVO
1. Describa en los recuadros el tipo de muestra de elección 
según la clasifi cación del material genético, indicando 
los cuidados especiales que requiere dicha muestra para 
obtener un resultado confi able en los análisis de biología 
molecular.
Material genético Tipo de muestras posibles Cuidados especiales
ADN exógeno
ARN exógeno
ADN endógeno
ARN endógeno
 Ejercicios de integración 
98 PARTE II • Metodología del ADN recombinante
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 Bibliografía
a) Enliste las aplicaciones del estudio de la estructura genó-
mica de un individuo.
b) Mencione un ejemplo donde se aplique el estudio de la 
expresión génica de un individuo.
c) Señale tres recomendaciones para la toma y preserva-
ción de muestras para estudios moleculares.
d) Explique la diferencia entre un resultado falso negativo y 
un resultado falso positivo.
e) ¿Qué tipo de muestra emplearía para detectar una muta-
ción?
 Preguntas de repaso 
2. Describa en los recuadros de la tabla, de acuerdo con la 
afección que se necesita diagnosticar, el tipo de muestra 
que debe seleccionarse y el tipo de ácido nucleico que 
debe analizarse.
Enfermedad Muestra biológica Ácido nucleico
Tuberculosis
VIH
VHB
Hemofi lia
Cirrosis hepática