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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS CARRERA DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AMBIENTALES Identificación molecular de especies de tiburón comercializadas en el Mercado 17 de Diciembre, Santo Domingo de los Tsáchilas-Ecuador Trabajo de Titulación modalidad Proyecto de Investigación presentado como requisito previo a la obtención del Título de Licenciada en Ciencias Biológicas y Ambientales AUTOR: Manzanillas Castro Ana Belén TUTOR: MSc. Camila Acosta López Quito, 2022 ii DERECHOS DE AUTOR Yo, Ana Belén Manzanillas Castro en calidad de autor y titular de los derechos morales y patrimoniales del trabajo de titulación “Identificación molecular de especies de tiburón comercializadas en el Mercado 17 de Diciembre, Santo Domingo de los Tsáchilas-Ecuador”, modalidad Proyecto de investigación, de conformidad con el Art. 114 del CÓDIGO ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS CONOCIMIENTOS, CREATIVIDAD E INNOVACIÓN, concedemos a favor de la Universidad Central del Ecuador una licencia gratuita, intransferible y no exclusiva para el uso no comercial de la obra, con fines estrictamente académicos. Conservamos a mi/nuestro favor todos los derechos de autor sobre la obra, establecidos en la normativa citada. Así mismo, autorizo/autorizamos a la Universidad Central del Ecuador para que realice la digitalización y publicación de este trabajo de titulación en el repositorio virtual, de conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior. La autora declara que la obra objeto de la presente autorización es original en su forma de expresión y no infringe el derecho de autor de terceros, asumiendo la responsabilidad por cualquier reclamación que pudiera presentarse por esta causa y liberando a la Universidad de toda responsabilidad. Firma: ____________________________ Ana Belén Manzanillas Castro C.C.: 1720921947 Dirección electrónica: abmanzanillas@uce.edu.ec iii APROBACIÓN DEL TRABAJO DE TITULACIÓN POR PARTE DEL TUTOR Yo, Camila Acosta López, en mi calidad de tutor del trabajo de titulación, modalidad: proyecto de investigación elaborado por la señorita Ana Belén Manzanillas Castro; cuyo título es: IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE ESPECIES DE TIBURÓN COMERCIALIZADAS EN EL MERCADO 17 DE DICIEMBRE, SANTO DOMINGO DE LOS TSÁCHILAS-ECUADOR, previo a la obtención del Grado de Licenciada en Ciencias Biológicas y Ambientales; considero que el mismo reúne los requisitos y méritos necesarios en el campo metodológico y epistemológico, para ser sometido a la evaluación por parte del tribunal examinador que se designe, por lo que lo apruebo, a fin de que el trabajo sea habilitado para continuar con el proceso de titulación determinado por la Universidad Central del Ecuador. En la ciudad de Quito a los 03 días del mes de enero del año 2022. Firmado electrónicamente por: CAMILA ACOSTA Firma Camila Acosta López, MSc. DOCENTE TUTORA C.C.: 1721644076 iv APROBACIÓN DEL TRABAJO DE TITULACIÓN El Tribunal constituido por: Dr. Iván Jácome Negrete y M.Sc. Juan Francisco Rivadeneira Luego de receptar la presentación escrita del trabajo de titulación previo a la obtención del título de Licenciada en Ciencias Biológicas y Ambientales, presentado por la señorita Ana Belén Manzanillas Castro Con el título: Identificación molecular de especies de tiburón comercializadas en el Mercado 17 de Diciembre, Santo Domingo de los Tsáchilas-Ecuador Emite el siguiente veredicto: APROBADO Fecha: 10 de marzo de 2022 Para constancia de lo actuado firman: Nombre Apellido Calificación Firma Revisor 1 Dr. Iván Jácome Negrete 20 ____________ Revisor 2 M.Sc. Juan Francisco Rivadeneira 19.32 ____________ v AGRADECIMIENTOS A mi familia por todo su cariño y apoyo incondicional durante toda mi etapa académica, en especial a mi padre por acompañarme en cada fase de este proyecto de investigación. A mi tutora, Camila Acosta, por compartir sus conocimientos durante todo el desarrollo del proyecto. Al profesor, Fidel Rodríguez, por su genuino interés y apoyo en la realización de esta investigación. A los inspectores de pesca; Diego Bermúdez, Ermen Moncayo, Jonathan Arteaga y Darwin Andino por la apertura y confianza en las conversaciones y por facilitar la obtención de muestras de tiburón en el mercado. A todos mis compañeros y amigos que estuvieron presentes en la fase de laboratorio por su grata compañía y colaboración. vi TABLA DE CONTENIDOS pág. DERECHOS DE AUTOR ...................................................................................................ii APROBACIÓN DEL TRABAJO DE TITULACIÓN POR PARTE DEL ............. iii TUTOR .................................................................................................................................. iii APROBACIÓN DEL TRABAJO DE TITULACIÓN ................................................. iv AGRADECIMIENTOS ....................................................................................................... v TABLA DE ONTENIDOS .......................................... ¡Error! Marcador no definido. LISTA DE TABLAS ........................................................................................................... vii LISTA DE FIGURAS ........................................................................................................ viii LISTA DE ANEXOS .......................................................................................................... ix RESUMEN ..............................................................................................................................x ABSTRACT ........................................................................................................................... xi INTRODUCCIÓN ............................................................................................................... 1 METODOLOGÍA ................................................................................................................ 9 Área de estudio ................................................................................................................... 9 Diseño de la investigación .............................................................................................. 10 Población y muestra ......................................................................................................... 10 Metodología ...................................................................................................................... 10 Análisis estadístico ........................................................................................................... 13 RESULTADOS .................................................................................................................... 14 Extracción y determinación de la calidad de ADN de las muestras ......................... 14 Identificación de especies mediante PCR multiplex ................................................... 14 Composición y proporción de las especies de tiburones ........................................... 15 Observación del mercado e información de las muestras .......................................... 18 DISCUSIÓN ........................................................................................................................ 20 Identificación de especies mediante PCR multiplex ................................................... 20 Composición y proporción de las especies de tiburones ........................................... 22 Observación del mercado e información de las muestras .......................................... 25 CONCLUSIONES ..............................................................................................................28 RECOMENDACIONES ................................................................................................... 29 LITERATURA CITADA ................................................................................................... 30 ANEXOS .............................................................................................................................. 40 vii LISTA DE TABLAS TABLA pág. 1. Número total (n) y porcentaje (%) de las especies recolectadasen el Mercado Mayorista 17 de Diciembre con sus categorías de la UICN y del CITES…………………………………………………..……………….18 viii LISTA DE FIGURAS FIGURA pág. Figura 1. Mercado 17 de Diciembre en la provincia de Santo Domingo de los Tsáchilas-Ecuador. ................................................................................................................ 9 Figura 2. Familias de tiburones identificados en las muestras del Mercado 17 de Diciembre. ............................................................................................................................. 16 Figura 3. Composición de especies de tiburón identificadas en el Mercado 17 de Diciembre. ............................................................................................................................. 17 ix LISTA DE ANEXOS ANEXO pág. 1. Decreto ejecutivo 486...................................................................................................... 40 2. Acuerdo Ministerial No. 0084-A, 2020 ......................................................................... 45 3. Contrato Marco de Acceso a los Recursos Genético……………………………50 3. Tabla de secuencias de primers para especies de tiburón. ......................................... 56 4. Guía de encuesta informal .............................................................................................. 57 5. Integridad del ADN extraído a partir de tejido de tiburón en gel de agarosa al 1.2% ..................................................................................................................................... 57 6. Electroforesis en gel de agarosa al 1.2% de los productos de la PCR triplex para A. pelagicus (rabón). .......................................................................................................... 58 7. Electroforesis en gel de agarosa al 1.2% de los productos de la PCR triplex para C. falciformis (sedoso). ..................................................................................................... 58 8. Electroforesis en gel de agarosa al 1.2% de los productos de la PCR triplex para P. glauca (azul). .................................................................................................................. 59 9. Electroforesis en gel de agarosa al 1.2% de los productos de la PCR triplex para S. lewini (tiburón martillo). ............................................................................................... 59 10. Electroforesis en gel de agarosa al 1.2% de los productos de la PCR triplex para I. oxyrhinchus (mako). ...................................................................................................... 60 11. Electroforesis en gel de agarosa al 1.2% de los productos de la PCR cuádruplex para C. falciformis (sedoso) y P. glauca (azul). .............................................................. 60 x TEMA: Identificación molecular de especies de tiburón comercializados en el Mercado mayorista 17 de Diciembre, Santo Domingo de los Tsáchilas-Ecuador Autor: Ana Belén Manzanillas Castro Tutor: MSc. Camila Acosta López RESUMEN La poca regulación en el seguimiento del comercio de tiburón por especies es un gran desafío que Ecuador comparte con varios países del mundo, debido principalmente a las dificultades para identificar a nivel de especie, utilizando las partes de tiburón comercializadas (aletas secas, carne y procesados). Para abordar estos problemas de conservación y gestión, en el presente estudio aplicamos un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) multiplex con primers especie-específicos basados en la región ribosomal ITS2. Además, se caracterizó el comercio de la carne de tiburón en el Mercado mayorista 17 de Diciembre-Santo Domingo de los Tsáchilas, mismo que funciona como centro de acopio para el comercio de este producto. Las entrevistas informales con comerciantes locales confirmaron que los filetes de tiburón son comercializados bajo el nombre de “tollo” indistintamente de la especie y resulta ser un producto atractivo para los consumidores por su precio económico. En cuanto a los resultados basados en la identificación de los tejidos (n=150) mediante PCR multiplex revelan que el comercio está compuesto por al menos cinco especies. El tiburón rabón (56.76%) fue la especie más común, seguida del tiburón sedoso (25.67%), el tiburón martillo (10.14%), el tiburón azul (6.46%) y el mako (0.67%). El 93.26% (n=138) de las muestras analizadas corresponden a especies que constan en alguna de las categorías de amenaza de la UICN y en el Apéndice II del CITES. La técnica molecular aplicada en este estudio ha demostrado ser confiable, rápida y útil para la identificación de especies de tiburón por lo que resulta ser una herramienta clave para fortalecer los sistemas de trazabilidad y la cadena de custodia de los productos de tiburón. PALABRAS CLAVE: CONSERVACIÓN, COMERCIO, IDENTIFICACIÓN GENÉTICA, ITS2, PCR MULTIPLEX, TIBURONES. xi TITLE: Molecular identification of shark species commercialized in the wholesaler market “17 de Diciembre”, Santo Domingo de los Tsáchilas-Ecuador Author: Ana Belén Manzanillas Castro Tutor: MSc. Camila Acosta López ABSTRACT Lack of an effective regulation in the tracking of shark commerce by species is a great challenge that Ecuador shares with several countries in the world, due mainly to the difficulties in identifying up to species level, using commercialized shark parts (dry fins, meat, and processed goods). To approach these problems in conservation and management, in the present study we applied a multiplexed polymerase chain reaction with species-specific primers based on the ITS2 ribosomal region. Furthermore, the commerce of shark meat was characterized in the wholesaler market “17 de Diciembre”-Santo Domingo de los Tsáchilas, which works as collection center for the commerce of this product. The informal interviews with local merchants confirmed that the shark fillets are commercialized under the name of “tollo” indistinctly from the species and turns out to be attractive to the consumers for its economical price. Regarding the results based on identification of the tissue (n=150) through multiplex PCR reveal that the commerce is composed of by at least five species. The Pelagic thresher (56.76%) was the most common species, followed by the silky shark (25.67%), the scalloped hammerhead (10.14%), the blue shark (6.46%) and the shortfin mako (0.67%). Of the analyzed samples 93.26% (n=138) correspond to species that feature in one of the threat categories of the UICN and the CITES Appendix II. The molecular technique applied in this study has shown to be trustworthy, fast and useful for the identification of shark species, for which it turns out to be a key tool to strengthen the traceability and the custody chain of the shark products. KEYWORDS: CONSERVATION, COMMERCE, GENETIC IDENTIFICATION, ITS2, MULTIPLEX PCR, SHARKS. 1 INTRODUCCIÓN Los tiburones pertenecen a la clase Chondrichthyes, surgieron hace más de 400 millones de años durante la era Paleozoica convirtiéndose en uno de los grupos de vertebrados más antiguos del planeta (Worm et al. 2012).Según Weigmann (2016), los tiburones comprenden cerca de 500 especies pertenecientes a 34 familias. Su evidente supervivencia en el planeta a lo largo de los años está relacionada a su gran éxito evolutivo que ha permitido a los mismos adaptarse a diversos ecosistemas desde océanos, mares, estuarios, arrecifes de coral hasta sistemas de agua dulce como ríos y lagos (Aguilar et al. 2005). Anatómicamente se caracterizan por ser vertebrados acuáticos mandibulados con endoesqueleto cartilaginoso y dentículos en todo su cuerpo. Por lo general los dientes no están fusionados con las mandíbulas. Su fertilización es interna por medio de los pterigopodios que son los apéndices copuladores externos de los machos. Sus aletas están soportadas por radios blandos no segmentados (ceratotriquia), carecen de vejiga natatoria, entre otras características que los distinguen del resto de los cordados (Nelson 2006); (Castellanos et al. 2013). En cuanto a su biología, presentan una estrategia de vida tipo K que se caracteriza por un crecimiento lento, maduración sexual tardía, largos ciclos reproductivos y una baja tasa de fecundidad (Aguilar et al. 2005). Siendo esta estrategia específica para especies con poca mortalidad y depredadores naturales (García 2008). Sin embargo, dichas características tienen serias implicaciones para las poblaciones de este taxón, limitando su capacidad para soportar la sobrepesca (Moreno et al. 2008). Los tiburones cumplen un rol ecológico importante en la estructura y funcionamiento de los ecosistemas marinos. Algunos son considerados como "depredadores tope” por estar en la cúspide de las redes tróficas de manera que afectan significativamente el tamaño poblacional de las especies presa y con ello la composición de los niveles inferiores de las redes alimentarias (Cortés 1999). De modo que la disminución de las poblaciones de tiburones podría ocasionar un incremento desproporcionado de los 2 mesodepredadores ya que tienden a ser especies más generalistas y con una mayor tasa reproductiva (Early-Capistrán 2014). Este fenómeno ecológico es conocido como ‘liberación del mesodepredador’, que a su vez afecta a otras especies que se encuentran en niveles inferiores de la cadena trófica (Ritchie y Johnson 2009); (Roof et al. 2016). Según, Myers et al. (2008) las variaciones en las interacciones top-down (de arriba hacia abajo) en la red trófica son inevitables cuando se eliminan estos grupos funcionales de depredadores ápice. De la misma manera, Ruppert et al. (2013) señalan que las alteraciones en la cadena trófica son una consecuencia predecible pero los impactos precisos en otros procesos del ecosistema (ciclo de nutrientes, alteración del hábitat, entre otros) resultan difíciles de discernir ya que se trata de un sistema marino complejo que se basa en interacciones y redes múltiples, con una alta variedad de especies, y amplios nichos de dieta que se deben de tomar en consideración (García 2008); (Vega 2012); (Roof et al. 2016). Los tiburones ápice y mesodepredadores con una dieta oportunista, eliminan a los individuos débiles y enfermos, fortaleciendo la composición genética de las poblaciones de presas (Aguilar et al. 2005). Los tiburones ápice cumplen un papel importante como carroñeros facultativos, reduciendo la probabilidad de transmisión de enfermedades, mejoran la redistribución y transferencia de energía dentro del ecosistema marino. Así mismo, los mesopredadores ayudan a controlar las poblaciones de las especies invasoras manteniendo el equilibrio en la composición y función de los ecosistemas (Roof et al. 2016). A pesar de su gran importancia ecológica, este grupo de vertebrados se han visto altamente amenazados por actividades antrópicas, especialmente por el comercio de aletas de tiburón. Se estima que; a nivel mundial, aproximadamente 100 millones de peces cartilaginosos se desembarcan anualmente, cifra que no considera las capturas de tiburones ilegales, no declaradas y no reglamentadas (INDR) (Aguilar et al. 2005); (Worm et al. 2012). Según, Dent y Clarke (2015) entre los años 2000 y 2011 la importación de carne de tiburón a nivel mundial creció un 42%. En consecuencia, un tercio de las especies de tiburón están al borde de la extinción (Swing 2010). Ante esta crisis ambiental, la Convención sobre el Comercio Internacional de Especies Amenazadas de Fauna y Flora Silvestres (CITES) incluyo dentro del Apéndice II a 14 3 especies de tiburones. Actualmente 183 países son parte de este acuerdo internacional incluyendo a China y Ecuador (CITES 2021). No obstante, en China aún existe una alta demanda de aletas de tiburón puesto que elaboran la tradicional sopa de aleta de tiburón china, que es considerada como un alimento exquisito y nutritivo (Abercrombie et al. 2005). Por otro lado, la carne de tiburón no es tan codiciada y por ende no representa un ingreso significativo (Swing 2010). En China, el precio de mercado de aleta de tiburón alcanza los $1000 por kilogramo, convirtiéndose en uno de los productos pesqueros más caros del mundo (Dent y Clarke 2015). Esto ha llevado a que se practique ampliamente el “aleteo”, que consiste en cortar las aletas del animal capturado para después lanzarlo al mar generalmente vivo, para así obtener más espacio de almacenamiento para aletas maximizando el valor del contenido de su espacio de retención (Romero 1993); (Dent y Clarke 2015). China posee la flota pesquera más grande del mundo, convirtiéndose en el mayor productor y consumidor de productos de tiburón (Lack y Sant 2006). En 2016, China declaró alrededor de dos millones de toneladas de peces marinos procedentes de 2 600 buques de aguas distantes (correspondientes del Pacífico noroccidental, Pacífico sudoccidental y Atlántico sudoccidental) (FAO 2018). En la actualidad, su comercio se ha desplazado hacia el Pacífico Suroriental, en busca de nuevos recursos pesqueros como el tiburón de Colombia y Ecuador (Núñez y Wuest 2019). Como parte de este crecimiento, países como Ecuador exportan ilegalmente grandes cantidades de tiburón ya sea directamente a China o a través de países intermediarios como Perú, que reexportan todas las aletas hacia el mercado asiático (Dent y Clarke 2015); (Núñez y Wuest 2019); (Castilla 2019). Entre los años 2014 y 2018, se reportó el tráfico ilegal de 1700 toneladas de aletas de diferentes especies de tiburón desde Perú a China, donde el 40% de las aletas procedieron del Ecuador (Castilla 2019). Ecuador ocupa el puesto 25 de los mayores países pesqueros a nivel mundial, debido a que está ubicado en uno de los sistemas de circulación oceánica más dinámicos del mundo (Acebo y Nuñez 2016). En nuestro país predominan tres tipos de métodos de pesca: artesanal, industrial y la acuicultura (Menéndez 2008), siendo la artesanal la más popular, ya que cuenta con más de 15 000 embarcaciones registradas (FAO 2011); 4 (Cabrera 2018). Este método de pesca se realiza a lo largo de toda la costa continental ecuatoriana, donde el pescador se interna hasta ocho millas náuticas (Acuerdo Ministerial N°2305, 1984). La realizan tanto pescadores independientes como organizados en cooperativas o asociaciones, operan manualmente las artes de pesca y utilizan embarcaciones de tamaño y alcance limitado, además de capturar principalmente peces demersales y pelágicos costeros (Acebo y Nuñez 2016). El artículo 152 de la Ley Orgánica para el Desarrollo de la Acuicultura y Pesca (2020), señala que la pesca dirigida de tiburones está prohibida, así como el arte de pesca utilizado para capturar este recurso. Según, el artículo 149 de dicha ley, la comercialización interna y externa del tiburón está autorizada dentro de los límites de permisibilidad para la pesca incidental, de acuerdo con la normativa nacional e internacional vigentes en materia de especies amenazadas.No obstante, en el caso de que se efectúen capturas incidentales de ejemplares vivos o muertos de las siguientes especies: Rhincodon typus (Smith, 182) (tiburón ballena), Cetorhinus maximus (Gunnerus, 1765) (tiburón peregrino), Carcharodon carcharias (Linnaeus, 1758) (tiburón blanco), Lamna nasus (Bonnaterre, 1788) (Tiburón cailón), Squalus acanthias (Linnaeus, 1758) (mielga), Carcharhinus longimanus (Poey, 1861) (tiburón océanico), Sphyrna zygaena (tiburón martillo liso), Sphyrna mokarran (tiburón martillo gigante), Sphyrna tiburo (tiburón cabeza de pala) y Sphyrna lewini (tiburón martillo), deberán ser regresados inmediatamente al mar, ya que se prohíbe la comercialización y exportación de las mismas (Decreto ejecutivo N°486, 2007) (ver Anexo A); (Acuerdo Ministerial No. 0084-A, 2020)(ver Anexo B). Cabe mencionar que está prohibido el aleteo de cualquier especie de tiburón, con el objetivo de asegurar la sustentabilidad de las poblaciones de estos (Decreto ejecutivo N°486, 2007). No obstante, desde que entró en vigencia dicho decreto, la pesca de tiburones habría crecido más del 50%, representando la tercera parte de la pesca artesanal (Alvia 2016). De hecho, en el año 2020 se decomisaron 26 toneladas de aletas de tiburón en China provenientes de Ecuador, estos envíos están valorados en 1,1 millones de dólares (El Universo 2020). Se estima que cerca de 9000 toneladas de tiburones capturados como pesca incidental son desembarcadas por año en Ecuador (Sinovas y Price 2015). Estas cifras sugieren que en realidad la mayoría de los tiburones son capturados 5 intencionalmente bajo la excusa de una pesca incidental motivados por el factor económico (Martínez-Ortíz et al. 2015). El Instituto Nacional de Pesca es la institución responsable del plan de Control Sanitario y Verificación Regulatoria de todos los establecimientos y entidades incluidos en la cadena de trazabilidad, con el fin de inspeccionar los productos pesqueros a lo largo de las distintas fases de la cadena (Acuerdo Ministerial No. 06 177-A, 2006). Estas fases son: 1) extracción, 2) comercialización mayorista; 3 comercialización minorista; 4) procesamiento; 5) exportación y 6) consumo (Núñez y Wuest 2019). La trazabilidad de los tiburones se basa en los registros de capturas y de desembarcos (Sinovas et al. 2015). Las actividades de las embarcaciones se controlan a través de dispositivos de monitoreo satelital, bitácoras de pesca y observadores a bordo (Sinovas et al. 2015). Según la Comisión Permanente del Pacífico Sur (2016), Ecuador cuenta con 252 inspectores de pesca a nivel nacional y 101 observadores de pesca a bordo, quienes han sido capacitados en la identificación de productos y subproductos de tiburón (piel, carne, aletas, etc.). Además, el Viceministerio de Acuacultura y Pesca (MAP) emite guías de movilización de pesca incidental para movilizar el producto dentro de Ecuador; mientras que el Ministerio de Ambiente, Agua y Transición Ecológica (MAATE) al ser autoridad Administrativa de la CITES emite los permisos de exportación (Núñez y Wuest 2019). Mediante los registros obtenidos de las cadenas de trazabilidad, se conoce que en Ecuador las vísceras de tiburones capturados son comercializadas en la ciudad del desembarque para la elaboración de suplementos alimenticios para animales. Mientras que las aletas son exportadas a los países asiáticos. Por otro lado, la carne se comercializa a nivel nacional, principalmente en la Sierra donde se cotizan a precios de otras especies de mayor valor, debido a que la misma se suele vender en filetes por lo que resulta difícil para los consumidores identificar correctamente (Cevallos y Menéndez 2017). Según Saubi (2018), la substitución de especies es el fraude más común. A menudo hay irregularidades en la cadena de custodia, es decir, en los documentos relacionados con la trazabilidad del producto. Por ello, el desconocimiento es uno de los principales 6 obstáculos para implementar planes de conservación para los tiburones, ya que resulta difícil identificar a simple vista las especies que están siendo capturadas cuando han pasado por procesos de mutilaciones (Shivji et al. 2002). Es por ello, que se han implementado varias metodologías para la identificación de tiburones siendo la más común el marcador de diagnóstico basada en rasgos morfológicos (Hidalgo 2013). Los tiburones se distinguen fácilmente de los demás peces marinos debido a la forma de su cuerpo y la estructura de sus aletas. Mientras que, para la identificación taxonómica de las diferentes especies de tiburón se utilizan principalmente guías de campo que proveen de claves dicotómicas usando las características morfológicas más útiles de diagnóstico como cabeza, dientes y aletas (Martínez-Ortíz et al. 2007). Este tipo de identificación resulta difícil cuando al animal le faltan las aletas y la cabeza. Para estas situaciones, se usan los marcadores moleculares que son fragmentos de ADN polimórfico que nos permiten distinguir entre diferentes grupos taxonómicos (Ríos et al. 2009). Según Shivji (2002), los antiguos métodos de identificación genética desarrollados para tiburones se basaban en marcadores moleculares como el RFLP (Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción) que resultaba ser relativamente lento, costoso y laborioso. Por ello, propuso la utilización de otros marcadores moleculares como los espaciadores internos transcritos (ITS) del ADN ribosomal (ADNr) para examinar variaciones ínterespecies (ITS2) e intraespecies (ITS1), teniendo un enfoque más rápido y económico (Zapata et al. 2004). El ADNr eucariota se compone de grupos repetidos en tándem de genes de ARNr 18S, 5.8S y 28S, que la ARN polimerasa I transcribe como una molécula precursora (Gehlot et al. 2015). Las unidades de transcripción del ARN ribosómico presentan exones (regiones codificantes) e intrones (regiones no codificantes) que, mediante el proceso de corte y empalme, son eliminadas para la maduración del ARN. Los componentes codificantes del ARNr primario, son los genes 18S, 5.8S y 28S, que se encuentran flanqueados antes del procesamiento por dos secuencias ITS determinadas como ITS1 e ITS2, las cuales están separadas por el gen 5.8S (Salgado 2011). El gen 5.8S es altamente conservado y es útil para diseñar primers, que son secuencias de oligonucleótidos que flanquean la región del ADN a amplificar (Tamay et al. 2013). 7 La región ITS2 en comparación con ITS1, tiene subregiones de conservación bastante alta, suficiente para que sea usada para análisis filogenéticos a nivel de género y especie debido a su baja variación intraespecífica, pero suficiente polimorfismo interespecífico para producir fuertes marcadores de diagnóstico (Shivji et al. 2002). Lea-Charris et al. (2016), sugieren que la región ITS2 siendo relativamente corta es un buen marcador filogenético a nivel de especie y/o género. Además, es considerada una región potencial para ser usada como código de barra genético por sus características que incluyen la disponibilidad de regiones conservadas para diseñar primers específicos y por su facilidad de amplificación. La amplificación de la región ITS2 del ADNr, es la más común para la identificación molecular de tiburones, debido a que esta región es altamente divergente entre taxones por sobre el nivel de género, y por esto es probable que los primers especie-específicos solo amplifiquen ADN de especies relacionadas (Shivji et al. 2002). Esto se evidencia en el estudio realizado por Pank et al. (2001) en donde indican que el locus ITS2 en C. plumbeus y C. obscurus es de aprox. 1268 pb de tamaño, con una divergencia en la secuencia del 4%, entre especies. Para realizar el análisis de manera más rápida, técnicas de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) multiplex se han estandarizado donde se puedenidentificar varias especies de tiburón simultáneamente (Hidalgo 2013). Este tipo de PCR es una variante de un PCR común el cual consiste en fabricar múltiples copias de una secuencia diana de ADN, mediante un proceso de amplificación. Mientras que en la PCR multiplex, se añaden más de un par de primers por lo que tienen más de una secuencia target de amplificación (Méndez-Álvarez y Pérez-Roth 2004). Este enfoque de diseño de PCR multiplex, ha funcionado bien en diferentes estudios que se han basado en la identificación en tiburones. Así, Shivji et al. (2002) utilizaron primers especie-específicos basados en regiones ITS2, para producir amplicones de diagnóstico distinguiendo entre las especies de las familias Lamnidae y Carcharhinidae de forma simultánea. Mediante la misma técnica molecular, Caballero et al. (2012), determinaron que la tasa de éxito en identificar las muestras de tiburones a nivel de género y/o especie aplicando la técnica de PCR multiplex fue del 89% en las costas del pacífico colombiano. 8 Estos estudios previos demuestran que la técnica molecular de PCR multiplex con primers especie-específicos, es un método rápido y eficaz (Nachtigall et al. 2017). Ya que, esta técnica requiere solo PCR sin procesamiento enzimático adicional o secuenciación de los productos amplificados para obtener un diagnóstico de especie, a diferencia de RFLP o el análisis filogenético (Pinhal et al. 2012). Para este taxón, el entorno regulatorio actual es insuficiente para salvaguardar este recurso pesquero y se requieren estrategias de conservación fortalecidas. Por ello, este estudio resalta la importancia de los métodos moleculares en la identificación de las especies de tiburones y la necesidad de implementarlos en puntos de control estratégicos. La finalidad de este estudio es identificar las especies de tiburones presentes en el Mercado 17 de Diciembre mediante PCR multiplex. En específico, establecer el porcentaje de especies encontradas en el mercado mediante el uso de primers especie- específicos. Además, de caracterizar la comercialización de la carne de tiburón en dicho mercado. 9 METODOLOGÍA Área de estudio Las muestras de tiburón se recolectaron en el Mercado 17 de Diciembre, ubicado en la avenida Jacinto Cortéz, al oeste de la ciudad de Santo Domingo perteneciente a la provincia de Santo Domingo de los Tsáchilas, Ecuador (ver Figura 1) (Quirola 2018). El Mercado 17 de Diciembre tiene una superficie de 1916 metros cuadrados con una capacidad para 77 locales comerciales. Tiene un radio de influencia directa de 3 Km (Quirola 2015). Al ser uno de los mercados de mariscos más grandes de la ciudad, hay una intensa actividad comercial que activa la economía generando fuentes de trabajo para la población local. Figura 1. Mercado 17 de Diciembre en la provincia de Santo Domingo de los Tsáchilas- Ecuador. 10 Diseño de la investigación El presente estudio corresponde a un diseño observacional descriptivo porque detalla la dinámica del comercio de especies específicas de tiburón en el Mercado 17 de Diciembre, Santo Domingo de los Tsáchilas. Población y muestra El presente estudio, busca identificar las especies de tiburones presentes en el Mercado 17 de diciembre, mediante la técnica PCR multiplex, con la finalidad de levantar una línea base de información que servirá de punto de partida para estudios posteriores. Por lo tanto, no es necesario el cálculo de la muestra, sin embargo, la posible población son los cuerpos de tiburones comercializados en el Mercado 17 de Diciembre por vendedores mayoristas, durante 123 días. La muestra se basó en un estudio de línea base, por lo que se obtuvo 150 tejidos de tiburón (cada tejido corresponde a un cuerpo distinto de tiburón) comercializados en el Mercado 17 de Diciembre durante los meses de marzo, abril y mayo del 2021. El muestreo fue similar al método descrito por: Jabado et al. (2015), que menciona que se debe realizar visitas al mercado dos veces al mes con el objeto de obtener una muestra representativa de las especies comercializadas. En total, se realizaron seis visitas al mercado, cada visita representa un evento de muestreo que consistió en recolectar 25 tejidos obtenidos entre seis vendedores mayoristas del Mercado 17 de Diciembre. Se trató de un muestreo no probabilístico intencional dado que, las muestras corresponden a los tejidos que nos dieron acceso los vendedores (Arias-Gómez et al. 2016). Metodología Colección de muestras de tejido muscular de pescado Antes de iniciar la colecta de las muestras se obtuvo el Contrato Marco de Acceso a los Recursos Genéticos MAAE-DNB-CM-2021-0201 emitido por el Ministerio del Ambiente, Agua y Transición Ecológica (ver Anexo C). Cada muestra de tejido se colocó en fundas Ziploc rotuladas con un código que indica la inicial del nombre común de la especie y la fecha de recolección. Se movilizaron las 11 muestras de pescado en una hielera al Laboratorio de Variabilidad fenotípica y genotípica de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Central del Ecuador donde se almacenó a -20°C (Pank et al. 2001). Extracción de ADN de muestras de tejido de pescado Para la extracción de ADN genómico del tejido de tiburón se usó el Kit GeneJET Genomic DNA Purification (Thermo Scientific). Cada tejido se cortó en trozos pequeños de 25 mg para luego ser desintegrado con un mortero que contenía 180 μL de solución de digestión. El producto obtenido se colocó en un tubo Eppendorf de 1,5 ml, y se agregó 20 μL de solución de proteinasa K y se procedió a mezclar bien mediante pipeteo. Se incubo la muestra a 56 °C durante 3 horas aproximadamente hasta que el tejido esté completamente lisado y no queden partículas. Luego, se retiró del baño María y se agregó 20 μL de solución de RNasa A, se mezcló mediante pipeteo y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Una vez transcurrido el tiempo establecido, se agregó 200 μL de solución de lisis y se mezcló bien agitando manualmente durante 15 segundos hasta obtener una mezcla homogénea. Luego, se agregó 400 μL de etanol al 50% y nuevamente se mezcló pipeteando. El lisado obtenido se transfirió a una columna de purificación de ADN genómico GeneJET y se centrifugó durante 1 minuto a 6000 rpm. Se desechó el tubo de recolección y se colocó la columna de purificación de ADN genómico GeneJET en un nuevo tubo de recolección de 2 ml para añadir 500 μl de buffer de lavado I (con etanol añadido). Se centrifugó durante 1 minuto a 8000 rpm y se desechó el flujo para nuevamente colocar la columna de purificación en el tubo de recolección. Después, se agregó 500 μL de buffer de lavado II (con etanol añadido) a la columna de purificación de ADN Genómico GeneJET y se centrifugó durante 3 minutos a 12000 rpm. Se desechó el tubo de recolección, mientras que la columna de purificación de ADN genómico GeneJET se transfirió a un tubo Eppendorf de 1.5 ml. Se agregó 100 μL de tampón de elución al centro de la membrana de la columna de purificación de ADN genómico GeneJET y se dejó incubar durante 2 minutos a temperatura ambiente. Después, se centrifugó durante 1 minuto a 8000 rpm. Finalmente, se desechó la columna de purificación GeneJET y se almacenó el ADN purificado a -20 °C (Thermo Fisher Scientific 2016). 12 Se cuantificará el ADN usando el fluorómetro Qubit. Mientras, que la calidad se determinará mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,2% (80V, 45 min) y se visualizarán las bandas en el programa Microtek Bio-1000F (Hidalgo 2013). Identificación de especies de tiburón mediante PCR multiplex Para la PCR multiplex se contaron con dos primers universales y diez primers especie- específicos (ver Anexo D). El PCR triplex consistió en colocar en una misma reacción los primersuniversales de tiburón (FISH5.8SF y FISH28SR) junto con cada uno de los primer especie-específicos. Las condiciones de ciclos térmicos y la concentración de reactivos se realizaron en base a Pinhal (2012). Cada 50 μl de la reacción de PCR contiene 10-25 ng/μL de ADN, 12,5 pmol de cada primer, 1X de Buffer de PCR, 2,0 mM de MgCl2-, 200 μM de dNTPs y 1 unidad de Taq DNA Polimerasa. La PCR multiplex se amplificó siguiendo las siguientes condiciones: una denaturación inicial a 94°C por 15 minutos, seguido por 35 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 65°C por 1 minuto y 72°C durante 2 minutos, con una extensión final de 5 minutos a 72°C. Al terminar el ciclaje, se mantuvieron las muestras a 4°C o -20°C hasta que fueron analizadas por electroforesis en gel de agarosa al 1,2%. Para optimizar el proceso, se aplicó PCR cuádruplex para las dos especies pertenecientes a la familia Carcharhinidae, usando los dos primers universales de tiburón y los primers especie-específicos para Prionace glauca (Linnaeus, 1758) y Carcharhinus falciformis (Müller and Henle, 1839). Las condiciones de ciclos térmicos y concentraciones de reactivos fueron las mismas que se aplicaron al PCR triplex (Pank et al. 2001). También se realizó un ensayo de PCR pentaplex en la familia Carcharhinidae. Alopiidae y Sphyrnidae. En la primera familia se combinó en una sola reacción los tres primers especie-específicos; P. glauca, C. falciformis y Carcharhinus galapagensis (Snodgrass & Heller, 1905) con los dos los primers universales. Así mismo, con la familia Alopiidae se juntaron los dos primers universales con los tres primers especie-específicos: Alopias pelagicus (Nakamura, 1935), Alopias superciliosus (Guérin, 1830) y Alopias vulpinus (Bonnaterre, 1788). De la misma forma, para la familia Sphyrnidae se colocó en una sola reacción los tres primers especie-específicos; Sphyrna zygaena (Linnaeus, 1758), 13 Sphyrna lewini (Griffith & Smith, 1834) y S. mokarran (Rüppel, 1837) con los dos los primers universales. Las condiciones de ciclos térmicos y concentraciones de reactivos fueron las mismas que se aplicaron al PCR triplex (Pank et al. 2001). Electroforesis en gel de Agarosa Para visualizar los productos de amplificación en cada reacción de PCR, se realizó electroforesis en gel de agarosa al 1,2%. Los productos de PCR antes de ser cargados en el gel fueron preparados añadiendo 2 μl de Buffer de carga y 8µL de la reacción de PCR. Se utilizó el ladder de 100 pb y la electroforesis se realizó a 110 V por 2 horas (Hidalgo 2013). Observación del mercado e información de las muestras La dinámica comercial de carne de tiburón fue investigada a través de observaciones al mercado y de conversaciones informales dirigidas a los inspectores de pesca y a los comerciantes de tiburón. Se realizaron preguntas para conocer el origen de las muestras, su valor económico y otras referentes a este comercio (ver Anexo E) (Jabado et al. 2015); (Núñez y Wuest 2019). Análisis estadístico En el presente trabajo se aplicaron métodos estadísticos descriptivos. Se utilizaron medidas de frecuencia para determinar la proporción de especies de tiburón presentes al momento de evaluar la población, para ello se empleó el análisis de prevalencia, cuya fórmula es: 𝑃 = 𝐴 𝐴 + 𝐵 Donde, A es el número total de individuos de cierta especie y A+B es total de la población muestreada en el momento que se realizó el estudio (Fajardo-Gutiérrez 2017). 14 RESULTADOS Extracción y determinación de la calidad de ADN de las muestras Un total de 150 muestras de tejido de tiburón fueron recolectadas en el Mercado mayorista 17 de Diciembre. Para la extracción de ADN se siguió el protocolo propuesto en el manual del Kit GeneJET Genomic DNA Purification (Thermo Scientific) con un ajuste del tiempo de incubación a 56° C por 3 horas. En cuanto a la calidad del ADN extraído, las muestras presentaban una banda bien definida cerca al pozo en que se colocó la mezcla de ADN evidenciando su buena calidad (ver Anexo F). Identificación de especies mediante PCR multiplex Al realizar PCR triplex en todas las muestras de tiburón, los primers especie-específicos demostraron completa especificidad de especie (Anexo G-L). Los tejidos identificados como Alopias pelagicus (rabón) presentaron un tamaño de banda de 1200pb para el control positivo ITS2 y una banda de 385 pb correspondiente al primer forward especie-específico y al primer reverse universal (Anexo G). Sin embargo, no se identificó en las muestras ninguna especie de Alopias superciliosus ni Alopias vulpinus cuando se realizó PCR triplex con los primers específicos para cada especie. El ensayo de PCR triplex también se utilizó para identificar a Carcharhinus falciformis (sedoso), las muestras identificadas como dicha especie amplificaron en dos bandas; una en el amplicón del control positivo (1470pb) y la otra en el amplicón de especie-específico (1085pb) (Anexo H). Así mismo, las muestras identificadas como Prionace glauca (azul) amplificaron en la banda de 1470 pb y en la banda fue de 929 pb producida por el primer especie-específico y el primer reverse universal (Anexo I). Por otro lado, no se identificó en ninguna de las muestras la especie Carcharhinus galapagensis al realizar PCR triplex utilizando el primer específico para dicha especie. Aplicando el mismo ensayo de PCR triplex, se identificó las muestras pertenecientes a Sphyrna lewini (tiburón martillo) que presentaron dos bandas, una en el amplicón 15 control positivo (860pb) y la otra en el amplicón de especie-específico (445pb) (Anexo J). Por el contrario, en ninguna de las muestras se visualizó la amplificación de las bandas de tamaño de 249pb y 782pb producidas por los primers específicos para Sphyrna zygaena y Sphyrna mokarran respectivamente. En cuanto, a la única muestra identificada como Isurus oxyrinchus (mako) presentó un tamaño de banda de 1350pb para el control positivo ITS2 correspondiente a la familia Lamnidae y amplificó tenuemente en la banda de especie-específico (771 pb) (Anexo K). Los resultados de la PCR cuádruplex confirman la identificación de las especies P. glauca (azul) y C. falciformis (sedoso) hecha por la PCR triplex. Se visualizó las bandas generadas por los amplicones de los primers universales (1470 pb) y las bandas pertenecientes al amplicón específico de cada especie. Si bien en este punto casi todas las muestras de la familia Carcharhinidae estaban identificadas hasta el nivel de especie, hubo dos muestras que amplificaron solo en la banda de 1470 pb (Anexo L). Por consiguiente, se realizó PCR pentaplex para evitar falsos negativos, con ello se confirmó que las dos muestras presentaban solo una banda que corresponde a control positivo ITS2. Es decir, presuntamente dos muestras corresponden a tiburones de la familia Carcharhinidae, pero no pertenecen a ninguna de estas tres especies; P. glauca, C. falciformis y C. galapagensis. Los resultados de la PCR triplex en la identificación de A. pelagicus (rabón) se confirmaron mediante ensayos de PCR pentaplex. En las muestras se observó las bandas pertenecientes a la especie A. pelagicus (385pb). Así mismo, se realizó un ensayo de PCR pentaplex para Sphyrnidae donde se observó que las muestras pertenecían solo a una especie de la familia ya que presentaron una banda de 445pb que corresponde a S. lewini (tiburón martillo). Composición y proporción de las especies de tiburones De un total de 150 muestras de individuos de tiburón se identificaron 148 a nivel de especie y los 2 individuos restantes, se identificaron solo hasta el nivel de familia utilizando el método de PCR multiplex. Se registraron un total de cinco especies de tiburones distribuidos en 4 familias (ver Tabla 1), siendo la más abundante dentro del estudio; Alopiidae con 84 individuos, seguido de Carcharhinidaecon 50. Mientras que 16 las familias Sphyrnidae y Lamnidae fueron las menos representadas con 15 y 1 individuo respectivamente (ver Figura 2). Figura 2. Familias de tiburones identificados en las muestras del Mercado 17 de Diciembre. De este estudio preliminar, Alopias pelagicus (rabón) es la especie de tiburón más comercializada en la ciudad de Santo Domingo; la misma se identificó en más de la mitad del total de las muestras (56.76%). La segunda especie más comercializada es Carcharhinus falciformis (sedoso) presente en el 25.67% del total de las muestras. Mientras que Sphyrna lewini (tiburón martillo), Prionace glauca (azul) e Isurus oxyrinchus (Rafinesque, 1810) (mako) tuvieron una menor representatividad con 10.14%, 6.76% y 0.67% respectivamente (ver Figura 3). 17 Figura 3. Composición de especies de tiburón identificadas en el Mercado 17 de Diciembre. 18 En base a las evaluaciones globales de la Lista Roja de la UICN, cuatro de las cinco especies identificadas en este estudio integran al grupo de <<especie amenazada>>. De las cuales, la especie S. lewini (tiburón martillo) está clasificada en la categoría <<En Peligro Crítico>>, mientras que A. pelagicus (rabón) e I. oxyrinchus (mako) figuran como <<En Peligro>> y C. falciformis (sedoso) consta en la categoría de <<Vulnerable>>. Por el contrario, P. glauca (azul) figura en la Lista Roja de Especies Amenazadas de la UICN como <<Casi Amenazada>>. El 80% de las especies de este estudio están incluidas en el Apéndice II del CITES (ver Tabla 1). Tabla 1. Número total (n) y porcentaje (%) de las especies recolectadas en el Mercado Mayorista 17 de Diciembre con sus categorías de la UICN y del CITES (CR En Peligro crítico; EN En Peligro; VU Vulnerable; NT Casi amenazado). Observación del mercado e información de las muestras Este estudio se enfoca en la comercialización de la carne fresca de tiburón dentro del Mercado Mayorista 17 de Diciembre-Santo Domingo de los Tsáchilas. En este mercado hay 77 locales que ofrecen una variedad de productos del mar. De estos, se estima que 6 se dedican a la venta de carne de tiburón. La mayoría de los tiburones que llegan al mercado son desembarcados de los puertos pesqueros de Manta y Esmeraldas, para después ser transportados en camiones refrigerados a la ciudad de Santo Domingo. Cabe puntualizar que los individuos son desembarcados eviscerados, sin aletas ni cabeza. Una vez que llegan al mercado, los inspectores de pesca se encargan de revisar las guías de movilización y la mercadería pesquera. En este punto, la mayoría de las especies son Familia Nombre científico Nombre común UICN CITES n % Carcharhinidae Prionace glauca Tiburón azul NT --- 10 6.76 Carcharhinus falciformis Tiburón sedoso VU Apéndice II 38 25.67 Alopiidae Alopias pelagicus Tiburón Rabón EN Apéndice II 84 56.76 Sphyrnidae Sphyrna lewini Tiburón martillo CR Apéndice II 15 10.14 Lamnidae Isurus oxyrinchus Tiburón mako EN Apéndice II 1 0.67 Total 148 100 19 identificadas tanto por su nombre común como por su nombre científico. De hecho, las especies más significativas en términos de desembarque son A. pelagicus (rabón) y P. glauca (azul). Sin embargo, la trazabilidad de las especies se pierde cuando los comerciantes mayoristas venden el tiburón a los minoristas, quienes generalmente cortan el cuerpo en filetes y lo venden a los consumidores finales como “tollo” indistintamente de la especie. Por consiguiente, el valor de la carne no varía según la especie, sino por la oferta y la demanda. Hasta la fecha de este estudio, la libra de carne de tiburón fluctúa entre $1.20 y $1.50. Los consumidores locales prefieren la carne de tiburón principalmente por su precio más económico en comparación con otros peces. Por ello, la ciudad de Santo Domingo es considerado un destino importante para el comercio de este producto del tiburón, y una pequeña fracción (cerca del 20%) que llega al mercado son distribuidos a diferentes ciudades de la sierra principalmente a Quito, Tulcán e Ibarra. Según los comerciantes, alrededor de 30 personas están vinculadas en la comercialización directa e indirectamente dentro del mercado mayorista. 20 DISCUSIÓN Identificación de especies mediante PCR multiplex Este estudio es la primera evaluación de la composición de especies de tiburón en el principal mercado pesquero de Santo Domingo de los Tsáchilas-Ecuador. La metodología aplicada en este estudio permite la identificación de las muestras solo si se cuenta con los primers específicos para la especie objetivo. La tasa de éxito en la identificación de las muestras hasta el nivel de especie fue del 98.67% mediante la técnica de PCR multiplex. Mientras que el 1.33% se trata de dos muestras que pertenecen a la familia Carcharhinidae pero se desconoce su especie. Ambas muestras amplificaron en la banda de control positivo para dicha familia (1470pb) (Magnussen et al. 2007). Las posibles especies son: Carcharhinus altimus (Springer, 1950), Carcharhinus leucas (Muller & Henle, 1839), Carcharhinus limbatus (Müller & Henle, 1839), Carcharhinus longimanus (Poey, 1861), Carcharhinus porosus (Ranzani, 1839) y Galeocerdo cuvier (Péron y Lesueur, 1822). Las mismas se encuentran presentes en aguas continentales del Ecuador, y además se han reportado como especies comunes en los desembarques pesqueros (Aguilar et al. 2005); (Fowler et al. 2005); (Martínez-Ortíz et al. 2007); (Herrera 2021). Varios estudios han señalado la coamplificación de bajo rendimiento del amplicón control positivo cuando los tiburones; P. glauca (azul) y C. falciformis (sedoso) eran las especies objetivo (Pank et al. 2001); (Shivji et al. 2002); (Chapman et al. 2003); (Abercrombie 2004); (Hidalgo 2013). Sin embargo, en este estudio este fenómeno solo se observó cuando I. oxyrinchus (mako) era la especie objetivo. Shivji et al. (2002) sugieren que se trata de una interacción competitiva putativa de "proximidad de cebador", es decir, al estar relativamente cerca el sitio de apareamiento del primer especie-específico con el sitio de apareamiento del primer control positivo 5.8SF se crea cierto tipo de competencia entre primers. 21 Cabe mencionar que la inconsistencia del amplicón universal de tiburón no es señal de fallo en la identificación ya que, dicho primer universal se incluye en la PCR multiplex solo con el fin de evitar resultados falsos negativos. Es decir, si conoce que las muestras son exclusivamente de tiburón existe la opción de no utilizar el primer de control positivo (Shivji et al. 2002). El uso de los primers especie-específicos basados en regiones ITS2 del ADN ribosomal previamente diseñados (ver Anexo D), han sido de gran utilidad para determinar las especies de tiburones. Así mismo, las combinaciones estandarizadas de los primers propuesta por Hidalgo (2013) reflejan diagnósticos confiables. El uso de PCR multiplex con resultados eficientes, requiere estrategias de planificación, múltiples intentos y optimización de las condiciones de reacción a fin de evitar la aparición de problemas que pudieran comprometer la eficiencia del método, ya que es muy susceptible a errores de ejecución y de contaminantes (Bolivar et al. 2014). Así mismo, existen otras técnicas moleculares como la PCR multiplex en tiempo real que es una variante de la técnica descrita en este estudio, con la característica que elimina la necesidad de realizar electroforesis, reduciendo así el tiempo de diagnóstico de las especies (Cardeñosa et al. 2018). Estos métodos se utilizan cada vez más para fortalecer los sistemas de trazabilidad y la cadena de custodia de los productos de tiburón (Shivji et al. 2002); (Chapman et al. 2003). Estas técnicas moleculares junto con guías de identificación, son herramientas que en conjuntoproporcionan información suficiente para justificar la retención de envíos sobre la presencia ilegal de especies incluidas en la CITES y así evitar que las capturas ilegales tengan mercado (Cardeñosa et al. 2018). De hecho, estas nuevas técnicas de investigación molecular han demostrado ser eficientes en diferentes países como Hong Kong y Perú, lo que evidencia que las técnicas científicas son herramientas para la gestión de los recursos pesqueros y lo que se necesita es voluntad política para ejecutar medidas de conservación de tiburones (Pardo 2020). Lamentablemente, Ecuador no considera dichas herramientas moleculares en su Plan de Acción Nacional para la conservación y manejo del recurso tiburón (PAT Ec) 2020-2024 aspira que el uso de reportes de observadores, inspectores y guías de comercialización sean herramientas suficientes para controlar la descarga de la pesca, así como la comercialización interna y externa de tiburón y sus derivados, cuando evidentemente no lo es. 22 Composición y proporción de las especies de tiburones Las familias de tiburones más frecuentes en los desembarques artesanales en Ecuador son: Alopiidae, Carcharhinidae, Lamnidae, Sphyrnidae y Triakidae (Aguilar et al. 2005); (Coello y Herrera 2018). Para el presente estudio se recolectaron muestras de tiburones pelágicos, por ello, coincidimos con las primeras cuatro familias. Sin embargo, la familia Triakidae corresponde a tiburones dermesales que no son el objeto de estudio (Martínez-Ortíz et al. 2007). Las cinco especies de tiburón identificadas en este estudio, fueron similares a las seis especies características de los desembarques artesanales del Pacífico ecuatoriano (A. pelagicus, P. glauca, C. falciformis, A. superciliosus, S. zygaena, e I. oxyrinchus) (Elias y Diaz 2019). Cabe mencionar que, la composición de especies en los desembarques pesqueros varía según las estaciones climáticas, épocas del año, temperatura del mar, ciclo de la marea y más factores ambientales que junto con factores biológicos y operacionales influencian directamente las tasas de capturabilidad (Lowry et al. 2007); (Megalofonou et al. 2009). Martínez-Ortíz y García-Domínguez (2013), confirman que Alopias pelagicus (rabón) es la especie más capturada por las pesquerías en Ecuador. Si bien, es una especie de gran importancia comercial en nuestro país, también lo es para varias de las naciones que limitan en el Océano Pacífico. En el estudio realizado en la Costa Pacífica de Colombia se determinó que el 90.17%. de las muestras amplificadas corresponden a dicha especie (Caballero et al. 2012). Sumando a esto, en el estudio realizado en Hong Kong por Cardeñosa et al. (2021) identificaron que el 84.9% de las muestras de aletas procedentes del Pacífico Oriental (Ecuador, Perú, Costa Rica, México y Panamá) corresponden al tiburón rabón. Se estima que en el Pacífico oriental-central, las poblaciones de Alopias spp. han decrecido en abundancia en un 83% (Ward y Meyers 2005). De hecho, la población de A. pelagicus del Pacífico oriental está clasificada como <<En Peligro>> en la Lista Roja de Especies Amenazadas de la UICN, por lo que urge la necesidad de adoptar medidas más rigurosas que aseguren una pesca sostenible (Tsai et al. 2010); (Liu et al. 2013). La segunda especie más abundante en el mercado mayorista de Santo Domingo- Ecuador fue Carcharhinus falciformis (sedoso). Mismo resultado se reportó al otro lado 23 del mundo, en los mercados de Hong Kong y Guangzhou en China (Cardeñosa et al. 2020). Se presume que la gran mayoría de los tiburones comercializados en esta zona provienen del Océano Pacífico tropical oriental. El tiburón sedoso es la especie predominante en las capturas incidentales de tiburones en las pesquerías atuneras de cerco en el Pacífico oriental (Hall y Roman 2013). Si bien, la Comisión Internacional para la Conservación del Atún Atlántico (ICCAT) y la Comisión Interamericana del Atún Tropical (CIAT) han prohibido el desembarque de esta especie, se ha demostrado tasas de supervivencia del 38 al 52% de los tiburones liberados (Hutchinson et al. 2015). Según Rice y Harley (2013) la biomasa de población reproductora se ha reducido al 67% de su valor desde 1995. Además, se ha demostrado que no solamente ha disminuido drásticamente la abundancia relativa del tiburón sedoso del Océano Pacífico oriental durante las últimos dos décadas, sino que también lo ha hecho el tamaño de los tiburones en respuesta al aumento de los niveles de captura (Whoriskey et al. 2011); (Dapp et al. 2016). En consecuencia, C. falciformis (sedoso) del Océano Pacífico oriental está clasificado por la UICN como <<Vulnerable>>, lo que refleja la necesidad de contar con medidas de gestión y prohibiciones a nivel nacional y regional que permitan regular el comercio internacional. El 80% de las especies encontradas en este estudio, están clasificadas en alguna de las categorías de amenaza de la UICN, mismas que también constan en el apéndice II del CITES. La especie que se encuentra en la categoría de mayor amenaza de este estudio es Sphyrna lewini (tiburón martillo), que ha experimento un declive dramático de su población mayor al 90% (Baum et al. 2003). Esta especie es muy cotizada para el comercio de aletas de tiburón debido a que los consumidores asiáticos consideran que las aletas de mayor longitud, grosor y mejor textura de la ceratotrichia (radios de la aleta) provienen de las especies más grandes siendo ésta una de ellas (Rose 1996); (Clarke et al. 2007). En respuesta a las preocupaciones sobre las tendencias decrecientes de esta población, el gobierno ecuatoriano en el año 2020 mediante decreto ministerial prohibió la comercialización y exportación de esta especie que se encuentra <<En Peligro Crítico>> (Acuerdo Ministerial No. 0084-A, 2020). Por lo tanto, la identificación de 15 tejidos correspondientes a S. lewini (tiburón martillo) implica que en el Mercado Mayorista 17 de Diciembre, se estaba violando dicha prohibición. 24 Pese a las actuales restricciones legales, es común que las autoridades encuentren aletas y/o cuerpos de especies protegidas escondidas en bodegas de las embarcaciones. Así, en el año 2017 el buque Fu Yuan Yu Leng 999, de bandera china, fue detenido mientras cruzaba la Reserva Marina de Galápagos sin autorización. Este barco contenía 7639 tiburones, y las especies más representadas fueron el tiburón sedoso, el tiburón punta blanca oceánico, el tiburón martillo común, el rabón y tiburón azul (Bonaccorso et al. 2021). Sumando a esto, en el año 2020 sucedió la mayor incautación de aleta de tiburón de la historia del Ecuador; se incautaron en Hong Kong 26 toneladas de aletas que provenían principalmente de A. pelagicus (rabón) y P. glauca (azul) Clifford 2020). A pesar de que P. glauca (azul) es la segunda especie de mayor captura en Ecuador, no consta en el Apéndice II del CITES ni en ninguna de las categorías de amenaza de la UICN (Martínez-Ortiz y García-Domínguez 2013). Se presume que está enfrentando una gran presión pesquera justamente por las escasas medidas nacionales e internacionales para limitar la captura a niveles sostenibles. De hecho, en el estudio realizado por Baum et al. (2003) mencionan que las poblaciones de tiburones azules han disminuido en un 60%. P. glauca (azul) es la especie de tiburón con la más amplia distribución geográfica, lo que le convierte en la especie más frecuente en las capturas incidentales de las pesquerías que utilizan palangres y redes de enmalle, alrededor del mundo (Vögler et al. 2012). En el Pacífico ecuatoriano esta especie es capturada incidentalmente con artes de pesca espinel o palangre de superficie por la flota artesanal, representando el 13.85% y el 19.36% en peso del total de tiburones capturados en aguas de Ecuador (Martínez-Ortíz y García-Domínguez 2013).El tiburón con menor representatividad en este estudio, fue Isurus oxyrinchus (mako) resultado similar se encontró en el estudio de Hidalgo (2013) donde el 0.98% de sus muestras colectadas en Ecuador procedían del tiburón mako. En Ecuador representa el 2% anual en peso del total de tiburones desembarcados (Martínez-Ortiz y García- Domínguez 2013). Esta especie tiene una baja productividad biológica con un ciclo reproductivo de tres años, una madurez sexual tardía, y poca descendencia que la hace particularmente susceptible a la sobreexplotación en las pesquerías de palangre pelágico (Cortés et al. 2010). En el Océano Pacífico suroriental, se captura el tiburón mako como pesca incidental de la pesquería palangrera industrial cuya especie objetivo es Xiphias gladius (Linneaus, 1758) (pez espada) (Campana et al. 2016). A nivel mundial, http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1870-34532016000401387#B7 http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1870-34532016000401387#B7 25 se ha estimado una disminución de su población del 46.6%, con la probabilidad más alta de una reducción del 50% al 79% durante tres generaciones (Rigby et al. 2019). Actualmente está catalogado como <<En Peligro>> en la Lista Roja de la UICN y fue incluido recientemente en el Apéndice II de CITES en el año 2019 (CITES 2019). Las cinco especies descritas en este estudio son altamente migratorias con características biológicas únicas, lo que las hace vulnerables de la pesca selectiva y la captura incidental, más aún cuando se encuentran en mar abierto sin ninguna jurisdicción que los ampare. En base a los estudios anteriores, es evidente que el Océano del Pacífico Oriental es un importante punto de tráfico de aletas de tiburones hacia diferentes mercados del mundo, principalmente asiáticos (Fields et al. 2020); (Cardeñosa et al. 2021). De hecho, Ecuador anunció la creación de una nueva reserva marina de 60.000 𝑘𝑚2 en las Islas Galápagos. Este acuerdo también amplía la protección del Corredor Marino del Pacífico Este Tropical (CMAR) que Ecuador es parte junto con Costa Rica, Panamá y Colombia. Se trata de una iniciativa regional de conservación de especies altamente migratorias y uso sostenible de los recursos marinos y costeros de las áreas marinas protegidas de Malpelo, Gorgona, Coiba, Galápagos y Cocos conformadas en una Red de Áreas Marinas Protegidas (CMAR 2021). Observación del mercado e información de las muestras Las especies más significativas en los desembarques según los comerciantes son A. pelagicus (rabón) y P. glauca (azul), la primera especie coincidió con los resultados obtenidos en este estudio, mientras que, el tiburón azul fue la cuarta especie más frecuente después de C. falciformis (sedoso) y S. lewini (martillo). Esto posiblemente se debe a que P. glauca (azul), tiene una tendencia estacional de desembarque descendente entre el mes de marzo hasta agosto en el Pacífico ecuatorial (Martínez-Ortíz et al. 2007), fechas que coincidieron con la fase de muestreo del presente estudio. Se considera que el comercio de la carne de tiburón en la ciudad de Santo Domingo está en auge. Esto se refleja en que existen varios puestos dentro del mercado de la ciudad que se dedican a la venta de este producto pesquero, que satisfacen la demanda a nivel local y nacional. Por lo mismo, resulta evidente que no se trata de una pesca incidental cuando la economía de este comercio se basa en el aumento de la demanda. 26 La Fundación Mundial de la Vida Salvaje (WWF 2021), estima que más de 200 países están importando y exportando carne de tiburón y raya para un comercio mundial valorado en 2 600 millones de dólares entre 2012 y 2019. El comercio de la carne de tiburón está relacionado con la alta demanda de las aletas como principal producto de interés internacional. En consecuencia, el valor de las aletas resulta superior a la carne. De hecho, este último al ser considerado de mala calidad, tiende a comercializarse con un precio bajo en comparación con otros peces óseos. Según Oceana (2007) y Clarke et al. (2013) la baja calidad de la carne, se debe a su olor fuerte y desagradable a amoníaco producto de la degradación de la urea en el tejido. Además, no se recomienda su consumo por la presencia de metilmercurio en niveles que exceden los límites permisibles para los humanos (De Pinho et al. 2002); (Storelli et al. 2003). A pesar de esto, el consumo de este producto no solo se limita en Ecuador, sino que varios países del mundo como Sri Lanka, Omán, México y países de África dependen de la carne de tiburón como fuente de proteína (Rose 1998); (Schaeffer 2004); (Oceana 2007). El estudio realizado por Rose (1996), señala que Isurus oxyrinchus (mako) es bien apreciado por su carne, reconocido por su alta calidad entre las demás especies de su taxa y demandado en muchas partes del mundo. De hecho, en España la carne del tiburón mako en los mercados mayoristas cuesta el doble que la carne de P. glauca (azul), y en Venezuela es considerada de alta gama (Clarke et al. 2013). Esto posiblemente se debe a que consideran los consumidores que su carne es parecida en calidad al del pez espada (National Geographic 2018). Sin embargo, en este estudio los comerciantes consideran que la calidad de la carne de tiburón no varía por su especie. Por otro lado, resulta preocupante que todos los filetes de tiburón ofrecidos en el mercado minorista se los llame como “tollo”, esto genera un gran vacío en la trazabilidad de este producto. De igual forma, varios países del mundo han tratado de camuflar el nombre de tiburón bajo diferentes eufemismos ya que se cree que la venta de carne de tiburón tiene más posibilidades de crecer bajo el anonimato (Jacquet y Pauly 2008); (Cardeñosa et al. 2017). Por ejemplo; en Brasil etiquetan la carne de cualquier especie de tiburón como “cação” (Almerón-Souza et al. 2018), en Italia es comúnmente conocido como “palombo”, mientras que, en Argentina, el angelote es 27 comercializado como “gallina del mar” y en Reino Unido es común el término “rock salmon” (Vannuccini 1999). Así mismo, se ha evidenciado el crecimiento del fenómeno conocido como “etiquetado erróneo” que consiste en reemplazar una especie de alto valor económico por una de menor valor (Saubi 2018). El estudio realizado por Mateo (2014) en los mercados de Quito-Ecuador identifica que el 26.67% de los filetes de pescado colectados bajo el nombre de corvina, picudo, cherna, atún, etc. son en realidad de tiburón y de estos, el 40% se trata de especies amenazadas. Todo esto, está relacionado con las irregularidades en la trazabilidad de estos productos pesqueros, convirtiéndose en grandes obstáculos a la hora de implementar planes de conservación para los tiburones, especialmente para las especies protegidas (Jacquet y Pauly 2008). 28 CONCLUSIONES De las 150 muestras identificadas mediante PCR multiplex, se determinó que 148 correspondían a cinco especies de tiburón: A. pelagicus (56%), C. falciformis (25.33%), S. lewini (10%), P. glauca (6.67%) e I. oxyrinchus (0.67%). Mientras que las dos muestras restantes solo amplificaron para el amplicón de control positivo sugiriendo que se trata de otras especies de tiburón fuera del alcance del estudio. Esto demuestra que la metodología resultó eficaz en determinar si la muestra se adquirió de la especie objetivo o no. El 93.24% de los individuos identificados en este estudio se encuentran en alguna de las categorías de amenaza de la UICN. Esto demuestra la gestión poco sostenible que maneja el mercado y destaca la necesidad de implementar nuevas herramientas enfocadas en un sistema de trazabilidad más transparente para las especies de tiburones amenazadas. En el presente estudio, presentamos una herramienta molecular rápida, fiable, relativamenteeconómica que permite la identificación de especies de tiburones a partir de cualquier parte del cuerpo. La PCR multiplex es una metodología simplificada y su implementación en puntos de control estratégicos brindará datos fiables sobre la captura y el comercio de tiburones. 29 RECOMENDACIONES El presente estudio es el primer estudio en caracterizar y cuantificar la composición de especies de tiburón comercializados en un importante mercado de la ciudad de Santo Domingo-Ecuador y muestran resultados preliminares que pueden servir de línea base para investigaciones futuras. El método molecular utilizado en este estudio debería incluirse en el Plan de acción nacional para la conservación y el manejo de tiburones de ecuador (PAT-EC) con el fin de contar con pruebas diagnósticas moleculares en la identificación de especies de tiburón para no perder la trazabilidad de las especies y evitar el fraude de las mismas. Así mismo, los principales puertos pesqueros del Ecuador deberían implementar está técnica molecular para reforzar el monitoreo del comercio de tiburones en el país Realizar estudios similares en otros mercados pesqueros a nivel nacional para proporcionar un panorama más claro de la pesca y el comercio de tiburones en el país. Es necesario un seguimiento continuo del mercado mayorista 17 de Diciembre y acceso a las guías de pesca, dada la proporción relativamente alta de especies en peligro o incluidas en el Apéndice II de la CITES en el presente estudio. Es necesario que las comunidades pesqueras junto con los consumidores reciban una correcta educación ambiental que involucre una participación activa en el consumo sostenible enfocado en la conservación de las especies de tiburones que se encuentran amenazadas. El hecho de que los límites de las poblaciones de tiburones sean difíciles de definir y abarcar las jurisdicciones de muchos países pone de relieve la necesidad de que se tomen medidas a nivel regional e internacional para asegurar su supervivencia a largo plazo. 30 LITERATURA CITADA Abercrombie D. 2004. Identificación eficiente basada en PCR de productos de tiburón en el comercio mundial: aplicaciones para la gestión y conservación de tiburones caballa (familia Lamnidae), tiburón zorro (familia Alopiidae) y tiburones martillo (familia Sphyrnidae) comercialmente importantes. Trabajo de Grado presentado como requisito parcial para optar al Título de Master en Biología Marina. Universidad Nova Southeastern. 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