Biologia de los microorganismos-1068 (1251)

Vista previa del material en texto

M É T O D O S D E E S T U D I O E N E C O L O G Í A M I C R O B I A N A 615
U
N
ID
A
D
 4
este último método, es importante realizar el ensayo de cre-
cimiento en medios para los que se ha predicho que el orga-
nismo de interés crecerá poco o nada en absoluto, pero que 
organismos contaminantes lo harán vigorosamente. En el aná-
lisis final, la observación microscópica de un solo tipo morfoló-
gico de célula que presenta características uniformes de tinción 
(por ejemplo en una tinción de Gram), unida a las caracterís-
ticas uniformes de la colonia y la ausencia de contaminación 
en los ensayos de crecimiento con varios medios de cultivo es 
una buena prueba de que un cultivo es axénico (también lla-
mado puro).
Los métodos moleculares descritos en las secciones siguientes 
para caracterizar poblaciones naturales también se pueden aplicar 
para verificar la pureza de un cultivo. No obstante, estas técnicas 
suelen ser complementarias y no sustituyen las observaciones más 
básicas de las características del cultivo y la morfología celular.
Aislamiento selectivo de células individuales:
las pinzas de láser y la citometría de flujo
Además de los métodos que acabamos de describir, exis-
ten otras herramientas tecnológicamente más avanzadas para 
obtener cultivos axénicos, como las pinzas de láser o la citome-
tría de flujo. Estos métodos son especialmente útiles para ais-
lar microorganismos de crecimiento lento que, de otro modo, 
serían superados por especies no deseables en los cultivos de 
enriquecimiento, o para aislar organismos presentes en tan 
poca cantidad que se perderían en los métodos de enriqueci-
miento por dilución. 
Las pinzas de láser consisten en un microscopio óptico inver-
tido equipado con un láser de infrarrojos enfocado con preci-
sión y un dispositivo de micromanipulación. Se puede atrapar 
una célula individual porque el haz de láser crea una fuerza que 
empuja una célula microbiana (u otro objeto pequeño) y la deja 
inmóvil (Figura 18.5a). Después, al mover el haz de láser, la célula 
atrapada se mueve con él. Si tenemos una muestra de mezcla 
en un tubo capilar, podemos atrapar una sola célula y separarla 
de organismos contaminantes (Figura 18.5b). A continuación, 
se puede aislar la célula rompiendo el tubo en el punto entre la 
célula y los microorganismos contaminantes y haciéndola pasar 
a un tubo pequeño con medio estéril. Las pinzas de láser acopla-
das a técnicas de tinción para identificar organismos concretos 
(Secciones 18.3 y 18.4) se pueden usar para seleccionar organis-
mos de interés a partir de mezclas, para obtener cultivos axéni-
cos, y posteriormente estudiarlos en el laboratorio.
Un segundo método para el aislamiento selectivo de células 
individuales utiliza la citometría de flujo, una técnica para con-
tar y examinar partículas microscópicas suspendiéndolas en una 
corriente de fluido y pasándolas por un detector electrónico. Los 
citómetros de flujo evalúan criterios seleccionados (como tamaño, 
forma, o propiedades fluorescentes) de células individuales a 
medida que pasan por un detector a velocidades de muchos miles 
de células por segundo, y también pueden clasificar células indi-
viduales según criterios de medición determinados (véase la Sec-
ción 18.10 y la Figura 18.29). Esta última propiedad del citómetro 
de flujo es útil para obtener cultivos de enriquecimiento de tipos 
de células determinados a partir de una mezcla con muchos tipos.
Esta capacidad para clasificar células individuales permite 
disponerlas en la superficie de un medio de crecimiento sólido o 
depositarlas en pocillos individuales en una placa con múltiples 
método del tubo giratorio, se utilizan tubos que contienen una 
delgada capa de agar recubriendo el interior. Después, el agar se 
puede estriar para aislar colonias. Como en esos tubos se puede 
hacer circular un gas sin oxígeno cuando se realiza la siembra 
en estria, este método se usa principalmente para el aislamiento 
de procariotas anaerobios.
Otro método de obtención de cultivo axénico es la dilu-
ción en serie de un inóculo en un medio líquido hasta que el 
último tubo de la serie no presenta crecimiento. Por ejemplo, 
cuando se usan diluciones en series de diez en diez el último 
tubo con crecimiento se habrá originado a partir de diez células 
o menos. Además de ser un método para obtener cultivos axé-
nicos, las técnicas de dilución seriada se usan mucho para esti-
mar cantidades de células viables en la técnica del número más 
probable (NMP) (Figura 18.4). Los métodos del NMP se han uti-
lizado para estimar el número de microorganismos en alimen-
tos, aguas residuales y otras muestras en las que la cantidad de
células se evalúa rutinariamente. Un recuento del NMP de una
muestra natural se puede hacer empleando medios y condicio-
nes de incubación muy selectivos dirigidos a un organismo o un 
pequeño grupo de ellos o a un patógeno concreto. Por otro lado, 
un recuento puede hacerse también utilizando medios comple-
jos para obtener una estimación general de número de células
viables (pero véanse en la Sección 5.9 las precauciones que hay
que tomar con estas estimaciones).
El uso de réplicas de los tubos en cada dilución mejora la pre-
cisión del NMP final obtenido.
Criterios de pureza
Independientemente de los métodos utilizados para obtener 
un cultivo axénico, una vez que se ha obtenido es esencial veri-
ficar su pureza. Esto se lleva a cabo normalmente mediante 
una combinación de (1) microscopía, (2) observación de las 
características de las colonias en placas o en tubos de dilución, 
y (3) ensayos de crecimiento del cultivo en otros medios. En 
Figura 18.4 Procedimiento para el análisis del número más probable.
El crecimiento en la dilución 10−4 pero no en 10−5 significa que había al 
menos 104 células/ml en la muestra usada para la inoculación. Como los 
microorganismos unidos a partículas pueden alterar significativamente los 
resultados, se suelen usar métodos suaves para disociarlos antes de la dilución.
9 ml
de 
medio
Dilución
1/10
(10–1) 10–2 10–3 10–4 10–5 10–6
1 ml
(líquido)
o 1 g
(sólido)
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 
Creci-
miento
Creci-
miento
No hay
creci-
miento
Cultivo de enriquecimiento
o muestra natural
https://booksmedicos.org
	booksmedicos.org
	Botón1: