Biologia de los microorganismos-1068 (1269)

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624 E C O L O G Í A M I C R O B I A N A Y M I C R O B I O L O G Í A A M B I E N T A L
enzimas de restricción después de la amplificación con PCR. 
La palabra «automatizado» en el acrónimo ARISA se refiere al 
uso de un secuenciador de DNA que identifica y asigna tama-
ños de manera automática a cada fragmento marcado con colo-
rante (Figura 18.5c), al igual que se puede hacer en los análisis 
de T-RFLP. La aplicación más importante del ARISA es el estu-
dio de la dinámica de las comunidades microbianas mediante el 
seguimiento, entre otros, de los cambios en la presencia y abun-
dancia relativa de un miembro específico de la comunidad en el 
tiempo y en el espacio.
Estudios de diversidad usando genotecas y nuevas 
técnicas de secuenciación
La mayor parte de los primeros trabajos de investigación sobre 
diversidad microbiana se basaban en la construcción de biblio-
tecas de clones (genotecas) para separar moléculas individua-
les de DNA amplificado (amplicones); cada clon de la genoteca 
contenía una secuencia única que luego se usaba como molde 
para la determinación de secuencias ( Sección 6.2). En la 
Figura 18.4a se muestra que una mezcla de amplicones del gen 
de rRNA 16S aparece como una sola banda cuando se selec-
ciona en un gel no desnaturalizante. No obstante, como el gen 
diana amplificado procede de una mezcla de diferentes célu-
las, es necesario ordenar los filotipos antes de secuenciarlos. 
Esto se puede llevar a cabo mediante DGGE (Figura 18.14b, 
c), clonación molecular (Figura  18.13, Sección  11.4), o 
por sistemas de secuenciación de alto rendimiento ( Sec-
ción 6.2) que no precisan de clonación para la determinación 
de la secuencia.
La construcción de una genoteca y la secuenciación sigue 
siendo un método estándar para el análisis de la diversidad 
filogenética de las comunidades microbianas y para evaluar el 
las poblaciones en una comunidad microbiana, también puede 
servir para inferir la filogenia. La información diagnóstica de 
cada fragmento comprende las secuencias cerca de ambos 
extremos (la secuencia cebadora y el sitio de corte de la enzima 
de restricción), el conocimiento de que el fragmento no cuenta 
con un segundo sitio de restricción, y la longitud del frag-
mento. Mediante programas informáticos especializados se 
puede utilizar esta información para buscar en bases de datos 
públicas secuencias de rRNA 16S con las que se puedan empa-
rejar. Aunque esto puede tener cierto valor predictivo, muchas 
secuencias que guardan una estrecha relación a menudo no 
se diferencian por estos criterios. Por tanto, generalmente los 
datos de diversidad dentro de una comunidad microbiana que 
se obtienen a partir del T-RFLP son más bajos que los datos 
reales. 
Una técnica relacionada con el T-RFLP que proporciona 
un análisis más detallado de las comunidades microbianas es 
el análisis automatizado del espacio intergénico ribosómico 
(ARISA, del inglés automated ribosomal intergenic spacer 
analysis), que utiliza la proximidad de los genes de rRNA 16S 
y 23S en los procariotas. El DNA que separa estos dos genes, 
llamado región espaciadora transcrita interna (ITS, del inglés 
internal transcribed spacer), difiere en longitud entre especies, 
y a menudo también en longitud entre diversos operones de 
rRNA dentro de una misma especie (Figura 18.5a). Los cebado-
res de PCR para ARISA son complementarios de las secuencias 
conservadas en los genes de rRNA 16S y 23S que flanquean la 
región espaciadora. La amplificación (Figura 18.5b) y el análisis 
(Figura 18.5c) se llevan a cabo del mismo modo que el T-RFLP, 
y se obtiene un patrón complejo de bandas que se pueden usar 
para el análisis de la comunidad. Sin embargo, el ARISA se 
diferencia del T-RFLP en que no requiere de la digestión con 
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1 2 3 4 5 1 2 3 4 56 7 8
(a) Amplificación por PCR
(b) DGGE (c) DGGE de plantas de tratamiento de aguas residuales
1 2 3 4 5 6 7 8
Este filotipo parece ser 
universal
Este filotipo es exclusivo de
la planta de tratamiento 2
Este filotipo está presente 
en las plantas 1 y 2
Figura 18.14 Geles de PCR y DGGE. Se aisló el DNA total de una comunidad microbiana y se amplificó por PCR usando cebadores para los genes de rRNA
16S del dominio Bacteria (a, carreras 1-8). Se resolvieron seis bandas por DGGE (b, carreras 2-7), se cortaron y se volvieron a amplificar, y cada una dio una sola 
banda en la misma posición en el gel de PCR (a, carreras 2-7). No obstante, por análisis de DGGE cada banda migró a una posición distinta del gel (b, carreras 
2-7). Obsérvese que todas las bandas migran a la misma posición en el gel de PCR no desnaturalizante porque son todas del mismo tamaño, pero a posiciones
diferentes en el gel de DGGE porque tienen secuencias diferentes. (c) Perfiles de DGGE de comunidades microbianas de diferentes plantas de tratamiento de aguas
residuales amplificadas con cebadores para los genes de rRNA 16S del dominio Bacteria.
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